Стереотаксической инъекции микроРНК-экспрессирующих Lentiviruses в области CA1 гиппокампа мыши и оценка поведенческих результатов

Резюме

MicroRNAs играть значительную роль в структуре и функции мозга. Здесь мы опишем метод для обеспечения гиппокампа микроРНК сверхэкспрессию использованием стереотаксической инъекции инженерных микроРНК-экспрессирующих лентивирус. Этот подход может служить относительно быстрым способом оценки В естественных условиях Эффекты сверхэкспрессированные микроРНК в определенных областях мозга.

Аннотация

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory single-stranded RNA molecules around 22 nucleotides long that may each target numerous mRNA transcripts and dim an entire gene expression pathway by inducing destruction and/or inhibiting translation of these targets. Several miRNAs play key roles in maintaining neuronal structure and function and in higher-level brain functions, and methods are sought for manipulating their levels for exploring these functions. Here, we present a direct in vivo method for examining the cognitive consequences of enforced miRNAs excess in mice by stereotactic injection of miRNA-encoding virus particles. Specifically, the current protocol involves injection into the hippocampal CA1 region, which contributes to mammalian memory consolidation, learning, and stress responses, and offers a convenient injection site. The coordinates are measured according to the mouse bregma and virus perfusion is digitally controlled and kept very slow. After injection, the surgery wound is sealed and the animals recover. Lentiviruses encoding silencers of the corresponding mRNA targets serve to implicate the specific miRNA/target interaction responsible for the observed effect, with naïve mice, mice injected with saline and mice injected with "empty" lentivirus vectors as controls. One month post-injection, the animals are examined in the Morris Water Maze (MWM) for assessing their navigation learning and memory abilities. The MWM is a round tank filled with colored water with a small platform submerged 1 cm below the water surface. Steady visual cues around the tank allow for spatial navigation (sound and the earth's magnetic field may also assist the animals in navigating). Video camera monitoring enables measuring the route of swim and the time to find and amount the platform. The mouse is first taught that mounting the hidden platform offers an escape from the enforced swimming; it is then tested for using this escape and finally, the platform is removed and probe tests examine if the mouse remembers its previous location. Repeated tests over several consecutive days highlight improved performance of tested mice at shorter latencies to find and mount the platform, and as more direct routes to reach the platform or its location. Failure to show such improvement represents impaired learning and memory and/or anxiety, which may then be tested specifically (e.g. in the elevated plus maze). This approach enables validation of specific miRNAs and target transcripts in the studied cognitive and/or stress-related processes.

Введение

Роль микроРНК в частности функционирования нервной системы недавно было оспорено лентивирусный инъекций в нескольких исследованиях. MiRNAs было установлено, что важно для поддержания и повторное формирование синапсов структуры ^{1, 2} синаптогенез и реконструкции синапсов и техническое обслуживание ^3. Эти исследования убедительно показывают, что микроРНК занимаются, через многоуровневую регуляторных эффектов как в формировании и поддержании в основном выходе нервной системы, когнитивные функции. Стереотаксической инъекции лентивирус частиц в конкретных регионах в мозге грызунов позволяет поисках изменений в морфологии и синапсов нейронной активности, и был использован для создания функционального значения сверхэкспрессированные стенограммы ^4,5. Прямая инфекции нейронов, находящихся в четко определенных областях мозга с микроРНК-экспрессирующих лентивирусы могут быть причастны исследования старения, заболеваний мозга и нейродегенеративные; исследований микроРНКы в области поведенческой регуляции ^6-8 находятся на гораздо менее развитые государства, и стереотаксической инъекции микроРНК-экспрессирующих лентивирус частиц последующим поведенческие тесты могут использоваться для таких целей. Значительно более трудоемкий способ индукции избыточного или недостаточного-выражение содержит генетически модифицированные нок-ин или нокаут мышей. Генетические системы может дополнительно позволить условный и временной контроль экспрессии (например Cre-Lox, Tet системы), но они вряд ли предлагать пространственной специфичности процедуры инъекции и почти всегда имеется определенное количество неплотности. Кроме того, инженерные процедуры не требуют хирургического вмешательства и может использоваться во всех лабораторий с относительно хорошей воспроизводимости, но они медленнее и требуют гораздо больше трудовых и финансовых ресурсов. Кроме того, временной контроль избыточного или недостаточного-выражение в вводили мышам является гораздо более точным по сравнению с генетически модифицированных мышей.

протокол

1. Подготовка Лентивирус

1. Grow НЕК-клетки 293FT до 90% слияния.
2. В день трансфекции изменение клеточной среде в бессывороточной среде DMEM с добавлением 1 мМ глутамина и 50 мг / мл пенициллин-стрептомицина.
3. Со-трансфекции клеток с pLKO.1-Puro вектор и плазмидами, кодирующими дельта R8.2 и VSV-G фрагментов и миРНК интерес, с использованием 10 мкл 1 мг / мл полиэтиленимина в качестве носителя ^9.
4. Сбор упакованных лентивирусов на 24 ч и 48 ч после трансфекции через фильтр 0,45 мкм фильтр.
5. Концентрат лентивирусы использованием ультрацентрифугирование в 70 000 мкг, в течение 2 часов и 15 ° C, аликвоты и хранят при температуре -70 ° С.
6. Измерение титра вируса путем инфицирования клеток НЕК-293Т с серийно разведенными вирусных препаратов (от 1 до 10 ^-6 мл вектор на лунку). Полученное титр (минимум ~ 1 × 10 ⁹ инфекционных частиц на мл рекомендуется) вычисляется для экспрессии GEдной из интереса, используя пуромицин отбор и путем количественного выражения GFP вирусов через подсчет флуоресцентных клеток.

Для получения более подробных протоколов лентивирусом получения см. ^10.

2. Подготовка животных для хирургии

1. Хирурги одежде должна включать хирургический халат, стерильные перчатки, шапки и маски.
2. Взвешивание животных, то обезболить его с IP-инъекции кетамина смеси, объем пропорционально веса животных, как указано для каждого препарата. Для кетамин / ксилазин смеси диапазоне доз 80-200 мг / кг кетамина и 7-20 мг / кг ксилазина обычно используется для мышей.
3. Подождите, пока животное не полностью под наркозом, а затем проверить из-за отсутствия вывода рефлекс в задней конечности животного, расширив конечности, а затем нажать на него пальцем.
4. Введите животного подкожно Римадила, как указано на коробке, для облегчения боли. Типичный диапазон доз для Rymadil составляет 5-10 мг.
5. Место животное на грелку держать постоянную температуру тела и увлажнить глаза мазь.
6. Бритье области между двумя ушами с функцией подрезки машины.
7. Sanitize кожи бетадином.

3. Воздействие на череп и бурение

1. Место животное внутри stereotact, регулируя стержней в щели только впереди ушей животного.
2. Используйте скальпель, чтобы сделать передне-задней разрез около 1,5 см между ушами и держать его открытым с хирургии зажимов (serfines).
3. Очистите поверхности черепа с помощью ватного тампона до пересечения венечного шва и сагиттального швов, т.е. брегмы и пересечение между корональной и ламбдовидный швов, т.е. лямбда, видны.
4. Направьте кончик шприца, проведенного stereotact, вплоть до темени, на всех трех осях. Запишите координаты. Эта точка будет считаться нулевой POINT по всем трем осям.
5. Поднимите шприц в вертикальной оси, так что плоские движения не поцарапать черепа и переместить шприц голову в нужное место. CA1 гиппокампа инъекции потребуются следующие координаты относительно брегмы в мм: -2 на передней / задней оси, ± 1,8 на боковых / срединной оси и -1,5 на спинной / вентральной оси.
6. Опустите кончик шприца, пока она не коснется черепа и отметить место, с маркером. Удалите шприц назад, чтобы избежать колоть.
7. Просверлите небольшие отверстия, только в кости черепа с помощью тонкой бурильщика. Держите бурильщика устойчивый поэтому он не будет продолжать сверлить под мягкие ткани. Вы можете предотвратить это, стабилизирующее одной стороны, с другой, и путем бурения в коротких импульсов.

4. Инъекции Лентивирус

1. Вывод 0,5 мл концентрированного раствора лентивирусов.
2. Поместите шприц над отверстием и медленно опустите ее вертикально, пока он не REAчес поверхности черепа. Продолжайте опускать шприца в мозг очень медленно. На этом этапе некоторые могут возникнуть кровотечения, которое не обязательно указывает на ложный проникновения. Если кровотечение происходит вытереть его с помощью ватного тампона.
3. Установите цифровой насоса до 0,02 мл / мин (0,5 мкл бы быть введен в течение 25 минут) и начать вливания. Медленное инфузии позволяет эффективно распространение вируса в ткани и предотвращает обратный поток. В некоторых типах шприцев рассмотреть вопрос о внесении шприц за дополнительную глубину 0,5 мм перед отступлением с исходными координатами и вливания.
4. После завершения вливаний ждать еще 5 мин, чтобы позволить материалу распространились в мозг, а не отступают назад в канал образован шприц.
5. Удалите шприц очень медленно и следить за потоками обратно. Если обратный поток наблюдается на этом этапе часть вводимого материала, вероятно, потеряны.

5. Уплотнительная ран и восстановления

1. Уплотнение йэлектронной намотаны гистоакрил. Будьте уверены, чтобы избежать утечки гистоакрил в глаза.
2. Введите животным внутрибрюшинно (IP) в 1 мл предварительно нагретый солевой раствор, чтобы избежать обезвоживания.
3. Место животное в клетке восстановления, который расположен на нагретой панели. Часы животных в то время как он восстанавливает в течение дополнительного часа.

В случае потеря веса, отсутствие аппетита, слабость / невозможность получения корма или воды, умирающей государственной или инфекцию, эвтаназии животных должны быть выполнены. Приемлемые методы эвтаназии грызунов барбитураты, ингаляционные анестетики, CO _2, CO, или хлорид калия в сочетании с общей анестезией.

После 4 до 6 недель, оценивать навигации памяти животного оценивали в водном лабиринте Морриса. Лентивирусов, как правило, заражают большинство клеток в области инъекции.

6. Поведенческая оценка в водном лабиринте Морриса

1. Поезд животных в MИрис водный лабиринт. Для точного обучение и тестирование протокола см. ^11. После каждого испытания, высушить животное с сухим полотенцем, заменить его в клетку и обновить воды в баке.
2. Проверка животных в водном лабиринте Морриса течение 3 дней подряд, 4 испытания каждый день. Каждый день вставить животное в лабиринте в каждом из 4-х направлениях из лабиринта (север, юг, восток и запад) в меняющемся порядке, например один день: Восток-Запад-Север-Юг, день второй: Запад-Юг -северо-восток. Протрите животных после каждого испытания.
3. Во время испытаний, отслеживать животное с системой слежения, такие как Noldus системой слежения.
4. После ^12-го суда теста, вставьте животных в бункер для воды без платформы в течение одной минуты. Это может быть использовано для анализа стратегии поиска животного принимает.
5. Проанализируйте данные, как предложено в ^12.

Результаты

Инъекция 0,5 мкл лентивирусов в области СА1 в гиппокампе мышей, с расходом указано в протоколе раздел дает инфицированные области около 1 мм в ростральной-хвостовой оси и около 0,5 мм в медиальных-боковой и передней -задней оси (рис. 3).

Обсуждение

Стереотаксической инъекции лентивирус является относительно быстрый метод для прижизненного оценивать как вверх или вниз-регулирование различных генов и микроРНК. Основной альтернативой является генетически модифицированные мыши, который является намного более длительными и...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Rodent weigh scale	Burtons (UK)	115-455
heating pad	FIRstTechnology	DCT-25
trimming machine	Stoelting	51465
stereotact	Stoelting	51730
Scalpel and blades	Kent scientific	INS500348
Harland syringe	Hamilton	7632-01
driller	Stoelting	51449
digital pump	Harvard apparatus	704507
Water tank and platform	Stoelting	60135
Reagents
ketamine	Vetoquinol(Lure France)	3055503
domitor	Orion pharma	107140-10
Rimadyl	Pfizer animal health	24751
moisture ointment - Synthomycine 5%	Rekah Pharmaceutical	195
histoacryl	Braun	112101
saline	Sigma Aldrich	D8662