Optogenetic активации нейронов данио рерио Соматосенсорные использованием шеф-tdTomato

Резюме

Optogenetic методы сделали возможным изучение вклада отдельных нейронов в поведении. Мы описываем метод в личиночной рыбок данио для активации одного соматосенсорной нейронов, экспрессирующих channelrhodopsin вариант (шеф-повар) с диодной накачкой твердом состоянии (DPSS) лазерные и записи вызвала поведения с высокоскоростной видео-камеры.

Аннотация

Личинки данио появляются как модель для описания развития и функционирования простых нейронных цепей. Благодаря своим внешним оплодотворением, быстрое развитие, и полупрозрачность, рыбок данио особенно хорошо подходит для подхода optogenetic для расследования нейронные функции цепи. При таком подходе светочувствительных ионных каналов выражается в конкретных нейронов, что позволяет экспериментатору, чтобы активировать или подавлять их волю и таким образом оценить их вклад в конкретное поведение. Применение этих методов в личиночной рыбок данио концептуально проста, но требует оптимизации технических деталей. Здесь мы показываем, процедуры для выражения вариант channelrhodopsin в личиночной рыбок данио нейронов соматосенсорной, фото-активирующие отдельные клетки, и записи в результате поведения. Вводя некоторые изменения в ранее установленные методы, этот подход может быть использован для выявления поведенческих реакций от отдельных нейронов активирован допо крайней мере 4 дня после оплодотворения (DPF). В частности, мы создали трансгенных использованием нейронных соматосенсорной усилитель, CREST3, чтобы управлять выражением отмеченных channelrhodopsin вариант, шеф-tdTomato. Потребители инъекционных этого трансгена в 1-клеточной стадии эмбриона приводит к мозаике выражение в соматосенсорной нейронов, которые могут быть выявлены с конфокальной микроскопии. Освещающая определены клеток в этих животных с света от 473 нм лазер DPSS, направляется через волоконно-оптический кабель, вызывает поведение, которое может быть записано с помощью высокоскоростных видеокамер и количественный анализ. Эта техника может быть адаптирована к исследованию поведения, вызванного активацией нейронов любых рыбок данио. Отсюда и подход с генетическим или фармакологических возмущений будет мощный способ исследовать формирование схемы и функции.

Введение

Развитие optogenetic методы поощрения или подавления возбудимости нейронов с определенными длинами волн света дало возможность изучить функции различных популяций нейронов в нейронных цепях управления поведением ^{1, 19, 21.} Этот метод часто используется для активации группы нейронов, но он также может быть использован для активации отдельных нейронов. Данио рерио Личинки особенно актуален в этих методах, так как они являются прозрачными, их нервная система развивается быстро, и создание трансгенных животных очень быстро и рутины. Тем не менее, значительные технические препятствия необходимо преодолеть, чтобы надежно достижения одной активации нейрона.

Для оптимизации процедуры optogenetic активации отдельных нейронов у рыбок данио, мы сосредоточились на соматосенсорной нейронов. Личинки данио рерио обнаружить различные соматосенсорной раздражители с помощью двух популяций нейронов: нейроны тройничного нерва, которые иннервируют голову, и Rohon-Борода (RB) нейроны, которые иннервируют остальные части тела. Каждый тройничного и RB нейронов проекты периферических аксонов, что ветви широко в кожу для обнаружения стимулов и центрального аксона, который подключается к вниз по течению нейронных цепей. Животные реагировать на прикосновение уже 21 часов после оплодотворения (HPF), указывая, что когерентное соматосенсорной схемы сформировали ^{5, 18.} Во время развития личинок по крайней мере некоторые тройничного и RB нейроны синапсов на ячейку Mauthner для активации классического ответы побега, но накапливаются данные свидетельствуют о том, что существует несколько классов нейронов соматосенсорной с различными формами соединения, которые могут вызвать изменения на побег поведения ^{2, 4, 10, 12, 14, 15, 16, 17.} Наша мотивация для развития этого метода было охарактеризовать поведенческие функции различных классов нейронов соматосенсорной, но такой подход в принципе может быть использован для изучения функций практически любой нейрон или популяции нейронов в ЛарВал рыбок данио.

Дуглас и соавт. Ранее описанного метода для активации Channelrhodopsin-2-выражения нейронов соматосенсорной с голубым светом, вызывая выход поведения ^3. Их подход, используемый элемент усилителя от Isl1 генов для управления экспрессией ChR2-EYFP в соматосенсорной нейронов. Это трансгенов, однако, как сообщается, отображение относительно слабой флуоресценцией, требующих совместного введения второго докладчика, UAS :: GFP, чтобы обеспечить визуализацию клеток, экспрессирующих ChR2-EYFP. Этот подход был использован, чтобы вызвать поведение ответов между 24-48 HPF, но никогда не могли вызвать отклик последние 72 HPF. Таким образом, хотя этот метод работает для изучения нервной системы на ранних личиночных стадиях (24-48 HPF), оно является недостаточным для характеристики нейронных цепей и поведенческие реакции у пожилых личинки, когда более разнообразными поведенческими реакциями являются очевидными и нейронные цепи являются более зрелыми.

Мы стремилисьповысить чувствительность этого метода для того, чтобы охарактеризовать функции субпопуляций личинок нейронов РБ. Для улучшения выражения мы использовали соматосенсорной конкретного усилителя (CREST3) ²⁰ для управления экспрессией LexA-VP16 и участок LexA оператор последовательности (4xLexAop) ¹¹ для усиления экспрессии флуоресцентно отмеченных свет активированного канала. Эта конфигурация усиливается экспрессия каналов, устраняя необходимость для совместного выражения второго репортера и позволяющие непосредственно определить относительное содержание канала в каждый нейрон. Использование LexA / LexAop последовательность была дополнительным преимуществом, что позволяет нам ввести трансгенных данио рерио в линии репортеру, что использовать Gal4/UAS системы. Переходный выражение этого трансгена в результате различных уровней выражение, но, как правило, достаточно прочной, чтобы визуализировать как тело клетки и аксональной проекции отдельных нейронов в течение нескольких дней. Для оптимизации чувствительностиность на свет мы использовали свет активированного канала шеф-повара, вариант channelrhodopsin, состоящий из химеры channelopsin-1 (Chop1) и channelopsin-2 (Chop2) с кроссовером сайте спирали цикл EF ^13. Этот канал активируется при той же длине волны, как ChR2, но требует низкой интенсивности света для активации, что делает его более чувствительным, чем другие широко используемые каналы, в том числе ChR2. Белка повар был слит с красным флуоресцентным белком, tdTomato, позволяя нам для выявления экспрессии белка без активации канала. В качестве источника света, мы использовали диодной накачкой твердотельным (DPSS) лазерный связан с волоконно-оптическим кабелем для доставки точным, мощным импульсом синего света на конкретный регион личинок. Это позволило нам сосредоточиться лазерного излучения на отдельных нейронов, устраняя необходимость в поиске редких трансгенных животных, выразив канал в одном нейроне. Используя этот подход, мы смогли активировать отдельных нейронов РБ, записывать поведенческая реакцияс, высокоскоростные видеокамеры, изображения и активированные нейроны в высоком разрешении с конфокальной микроскопии.

протокол

Подготовьте следующие раньше времени.

1. Подготовка оптического кабеля

1. Создайте запоминающее устройство для оптического кабеля путем плавления конической шейке стекло пипетки Пастера над горелкой Бунзена создать ~ 150 °.
2. С помощью резака проволоки или лезвие бритвы, аккуратно вырезать оптического кабеля на две части. Каждая часть должна иметь один конец с FC / PC адаптер и один открытый конец. Хранить одну часть в качестве кабеля резерва.
3. Снимите оптический кабель до оболочке путем удаления оболочки волокна и укрепления волокон (рис. 1А) от 5,0 см срез кабеля.
4. Вставьте оптический кабель в подготовленную пипетки Пастера. Убедитесь, что кабель может легко перемещаться в и из кончика пипетки.
5. С оптическим кабелем выступающие из кончика пипетки Пастера, аккуратно вырезать и удалить оболочки волокна по всему стекловолокна, ~ 2 мм от среза.
6. Использование алмазов ручка / стеклорез, ник стекловолокна и разбить оFF конца, чтобы создать чистый срез / поверхности на конце волокна (рис. 1б).
7. Уберите оптический кабель в пипетку Пастера для хранения. Повторите шаг (1,6), если кончик оптического волокна получает сколы или перерывов неравномерно.
8. Позиция оптического кабеля в пипетку Пастера с помощью микроманипулятора (рис. 1С).

Процедуры 2-8 описывают метод для потребителей инъекционных трансгенов в эмбрионы вообще применимо ко многим экспериментах данио рерио. Вариации на тему этого метода, как описано в других Юпитера видео ^{6, 7, 8, 9, 22} одинаково эффективны.

2. Потяните иглы для инъекций

1. С помощью иглы съемник, извлеките из боросиликатного стекла трубки на две иглы инъекции постепенно снижалась чаевых. Съемник параметры будут меняться. (На игле съемник Sutter Instruments мы используем настройки: P = 500, Heat = 720, Pull = 50, Скорость = 70, а Время = 150). Каждая игла съемник разные, поэтому оптимизация параметров съемника EMэмпирически. Для получения дополнительной конической иглы, увеличить тепло-и / или тянуть. Для менее конической иглы, увеличить время и / или уменьшения тяги.
2. Хранить иглы в безопасном контейнере (например, чашку Петри с проката лента, клей из сторон).

3. Залить Пресс-формы

1. Растопите 0,5 г агарозы в 30 эмбрион мл / голубой водой, пока агарозном полного растворения.
2. Налейте в нижней части чашки Петри.
3. Поместите прямоугольной формы с монтажной скважин (рис. 2) в агарозы, будьте осторожны, чтобы ограничить образование пузырьков вокруг колодцев.
4. Разрешить агарозном чтобы затвердеть.
5. Удалить плесень и заполнить чашку Петри с голубыми / эмбрионов воды.
6. Хранить в вертикальном, наполненный чистой водой, при комнатной температуре в течение же дня использования или при 4 ° C для дальнейшего использования.

4. Сделать плазмиды Mix ДНК для инъекций

1. Развести плазмидной ДНК в концентрации 50 нг / мкл с 1:10 фенола красного в DDH ₂ O. ДляНапример:

   1,0 мл	плазмидной ДНК (250 нг / мл)
   0,5 мл	фенол красный
   3,5 мл	DDH 2 O

2. ДНК смесь можно хранить при комнатной температуре, если использовать сразу или хранить при температуре 4 ° С в течение нескольких дней.

5. Настройка спаривания пар

Это должно быть сделано накануне вечером вы планируете делать инъекции.

1. Заполните разведения цистерны с водой системы и место мужчины и женщины рыбы вместе. Если инъекций не может быть выполнена, как только подсветка включается на объекте, отдельные мужские и женские рыбы с разделителем.

6. Подготовка к инъекции (это можно делать во время ожидания эмбрионов)

1. Включите давление инжектора установки. Убедитесь, что система установлена ​​на импульс. Начните с множеством длительность импульса до 1.
2. Включите воздушный клапан иОтрегулируйте давление инжектора ~ 20 фунтов на квадратный дюйм.
3. Использование рассекает сферу при максимальном увеличении, сломать кончик иглы с помощью пинцета или покер, чтобы создать ~ 2 мкм открытия (рис. 3, Фильм 1).
4. Заполните иглы с ДНК смесь: 1. Размещение игла, кончиком вверх, в ДНК смесь и дать иглу заполнить под действием капиллярных сил или 2. Использование долгосрочных достичь наконечник пипетки 1-2 мкл ДНК смешивают непосредственно в иглу.
5. Место заполнено иглу в безопасное место до момента инъекции.

7. Сбор эмбрионов

1. После объекте огни включены, удалить делителей (если применимо). Сбор эмбрионов с фильтром / мелкое сито и передавать их в чашку Петри со свежей голубой / эмбрионов воды.

8. Inject эмбрионов на 1-2 клеточной стадии

1. Передача собранных эмбрионов для литья под давлением с помощью пластиковой пипетки.
2. Использование рассекает микроскопом, осторожно надавите эмбрионов вскважин с щипцами или тупой покер (рис. 4, фильм 2).
3. Поместите загруженный иглу в микроманипулятора и положение над эмбрионами.
4. Калибровка Объем впрыска путем изменения длительности импульсов в 1-с шагом, пока не достигнете желаемого объема (~ 1 п). Это может быть откалиброван с помощью микрометра слайд, как описано в предыдущем видео Юпитер ^{8, 22,} но для этого эксперимента точность не нужна, так как широкий спектр инъекции объемах приведет к адекватным выражением.
5. Inject ~ 1 п ДНК смешивают непосредственно в клетку и повторить для всех эмбрионов. ДНК может быть также введен в желтке, но это, как правило, менее эффективны (рис. 5, фильм 3).
6. Удалить впрыском эмбрионов от плесени использованием нежного потока синий / эмбрионов воды.
7. Магазин вводят эмбрионы на 28,5 ° C в темноте.
8. Удалить неоплодотворенной, поврежденные или мертвые эмбрионы периодически.
9. Лечить эмбрионов Wiго ПТУ между 18-24 HPF, чтобы предотвратить пигментацию.

9. Экран для экспрессии трансгенов

1. Вручную dechorionate 24-48 HPF эмбрионов с помощью пинцета.
2. Anesthetize личинки использованием 0,02% Tricaine.
3. С помощью флуоресцентного микроскопа рассекает, выявления личинок с РБ или тройничного выражение нейрона и перенести их в новое блюдо со свежим ПТУ синий / эмбрионов воды. Эмбрионы с редкими выражение в легко идентифицировать клетки являются оптимальным, но отдельные нейроны будут направлены на активацию с волоконно-оптическим кабелем таким широким спектром выражения плотности является приемлемым.
4. Магазин эмбрионов при 28,5 ° C в темноте, пока желаемый экспериментальной стадии.

10. Установите Личинки поведения Эксперименты

1. Сделайте 1,5% с низкой температурой плавления агарозы в DDH ₂ O и хранят в 42 ° C тепла блока, чтобы предотвратить затвердевание.
2. Использование стеклянной пипетки Пастера, передача одного из предварительно отобранных личинок в ваннойе 1,5% с низкой температурой плавления агарозы с минимальным синим / эмбрионов воды, сколько возможно.
3. Передача личинок в капле агарозы на небольшой чашке Петри.
4. В рассекает микроскопом, положение личинки спинной вверх.
5. Когда агарозном укрепил, срезать агарозы с тонким лезвием (# 11 скальпель), в результате чего клин агар по всему личинки.
6. Сделайте две диагональные надрезы на каждой стороне желтка, возьмите аккуратно, не повреждая личинку.
7. Заполните окрестностях агарозы с эмбрионом / голубой водой.
8. Потяните агарозном от туловища и хвоста личинки (рис. 6).

11. Подготовка Высокоскоростные камеры и обработки изображений

1. Гора высокая скорость камеры на рассекающих области.
2. Подключите фотокамеру к компьютеру.
3. Включите компьютер.
4. Включите высокоскоростные камеры.
5. Открыть видео / изображений программное обеспечение (Мы используем AOS обработки изображений и будет описывать процедуры для использования его здесь, но и других изображенийПрограмма одинаково приемлемы).
6. Настройка параметров камеры соответственно (то есть 1000 кадров в секунду (FPS), 50% триггером буфера или других параметров).
7. Начать запись.

12. Активировать отдельных нейронов с помощью 473 нм лазерный

1. Прикрепить стимулятор, лазерных и оптических кабелей.
2. Включите стимулятор.
3. Установить стимулятор максимум на 5 вольт и длительностью импульса 5 мс.
4. Включите лазер в соответствии с инструкциями производителя.
5. Используйте рассекает микроскопом, чтобы позиционировать кончик оптического кабеля вблизи тела клетки нейрона с шеф-tdTomato выражении (рис. 6).
6. Доставка импульса синего света для активации сенсорного нейрона.
7. Запись поведение с помощью высокоскоростной камеры установлены на 500 или 1000 кадров в секунду.
8. Повторите эксперимент по желанию, ожидая, 1 мин между каждой активации, чтобы избежать привыкания. (Мы записываем как минимум три ответа для каждого нейрона).
9. Квыпуск личинок, подглядывать друг от друга агарозном щипцами, стараясь не травмировать животное. Это животное может быть допущен к дальнейшему развитию и процедура может быть повторена в более старшем этапе характеризуют развитие поведения. Эмбриона может быть также перемонтирована высокого разрешения конфокальной микроскопии из клеток, активированных соотносить поведение с ячеистой структурой, как описано ниже.
10. Передача личинки к культуре пластины с свежая синяя / эмбрионов воды. Мы используем 24-луночный планшет для отслеживания отдельных личинок.

13. Изображение Нейрон (ы) с конфокальной микроскопии

1. Anesthetize личинок с 0,02% Tricaine.
2. Гора личинки, спинной стороной вверх, в 1,2% с низкой температурой плавления агарозы или в спинном формы.
3. Изображение шеф-tdTomato нейронов с лазерным 543 нм и соответствующий фильтр и объективным. Мы используем 20x цели.
4. Удалить личинок из агарозы и вернуться в отдельных скважин с голубыми / эмбрионов воды.
5. Хранить при температуре 28,5 ° C в темноте фуrther анализа.

Результаты

Рисунок 1. Оптический кабель создана. (A) слоев волоконно-оптического кабеля. (B) Stripped волоконно-оптического кабеля в пипетку Пастера. (C) Волоконно-оптический кабель в пипетку Пастера позиционируется с помощью микро?...

Обсуждение

Мы описали подход к optogenetic активации отдельных нейронов РБ в живых рыбок данио. Наш метод использует переходный трансгенез, чтобы выразить флуоресцентно отмеченных channelrhodopsin вариант, шеф-tdTomato ^13, в определенных нейронах соматосенсорной. Такой подход может быть легко адаптирована ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название Реагенты / Материал	Компания	Номер в каталоге	Комментарии
			Материалы
Стеклянная пипетка Пастера	Рыбак	1367820B	или эквивалент (10-15 мм в диаметре)
200 мкм оптического волокна	Thorlabs	AFS200/220Y-CUSTOM	Патч-корд, длина: 3 м, конец: FC / PC, конец B: FC / PC, куртка: FT030
50 мкм оптического волокна	Thorlabs	AFS50/125Y-CUSTOM	Патч-корд, длина: 3 м, конец: FC / PC, конец B: FC / PC, куртка: FT030
Регулируемый инструмент для зачистки	Thorlabs	AFS900	или три отверстия инструмент для зачистки (FTS4)
Алмазный Клин писец	Thorlabs	S90W
Flaming / коричневый микропипетки съемник	Sutter Instruments	P-97	или эквивалент
Боросиликатного стеклянных трубок с нитью	Sutter Instruments	BF-100-78-10
Инъекционные формы	N / A	N / A	Рисунок 5
Пробирки на 1,5 мл центрифуги	Любой	Любой
Чашка Петри (100x15 мм)	Любой	Любой
Чашка Петри (60x15 мм)	Любой	Любой
Давление инжектор	ASI	ИПМТ-3	или эквивалент
Микроманипулятор и металлической подставкой	Narashige	M152	или эквивалент
Одноразовые пластиковые пипетки	Fisherbrand	13-711-7	или эквивалент
Покер (держатель контактов и насекомых-контактный)	Изобразительное науки Инструменты, Inc	26018-17 и 26000-70	или эквивалент
Щипцы	Изобразительное науки Инструменты, Inc	11255-20	или эквивалент
Microloader наконечники	Eppendorf	9300001007
28,5 ° C инкубатора	любой	любой
42 ° C тепла блока	Любой	Любой
Нестерильные лезвий скальпеля № 11	Изобразительное научных инструментов, Inc	10011-00	или эквивалент
Пройдя ссправляться	Zeiss	Stemi	или эквивалент
Флуоресцентные рассекает сферу со стандартным фильтром	Любой	любой	или эквивалент
Конфокальной микроскопии	Zeiss	LSM 510 или 710	или эквивалент с лазерами для GFP и RFP, и 10x, 20x и 40x цели
Высокая скорость камеры	AOS Technologies, Inc	X-PRI (130025-10)	или эквивалент
473 нм портативный лазерный	Кристалл лазеров	CL-473-050	или более высокой мощности, с возможностью TTL
S48 стимулятор	Astro-Med, Inc травы инструмента разделения	S48K	или эквивалент
FC / PC для FC / PC спаривания рукавом	Thorlabs	ADAFC1	Май перед для оптического кабеля
Лазерные защитные очки	Thorlabs	LG10	или эквивалент
24 пластин культуры	Genesee	25-102	или эквивалент
Одноместный слайды депрессии	Рыбак	S175201	Или эквивалент
			Реагент
Мгновенный океан	Водных экосистем	IS50
Метиленовый синий	Рыбак	S71325
Фенол красным	Сигма	P4758
Агароза	EMD	2125	или эквивалент
Температура плавления агарозы	Сигма	A9045	или эквивалент
ПТУ	Сигма	P7629
Tricaine	Сигма	A5040
синий / эмбрионов воды			10 л DDH 2 O 0,6 г мгновенных океана 6 капель метиленового синего
фенол красный			(5 мг / мл в 0,2 М KCl)
100x ПТУ			0,150 г ПТУ 50 мл DDH 2 O растворяется при 70 ° C, встряхните часто аликвоты и хранят при -20 ° C
1x ПТУ			1 мл 100x ПТУ 99 мл синий / рыба
Tricaine раствора			400 мг Tricaine 97,9 DDH 2 O
~ 2,1 мл 1М Трис, pH9.0			отрегулировать рН до ~ 7,0 магазин в 4 ° C или -20 ° С для длительного хранения