Процедура Скрининг Обработка глюкокортикоидных сигнализации с корреспондентом системе данио рерио Личинка люциферазы

Резюме

Опишем порядок и анализ данных скрининга системы химической для глюкокортикоидов сигнализации гормона стресса с помощью данио личинки: глюкокортикоидный В естественных условиях данио рерио активности люциферазы (GRIZLY) анализа. Анализ чутко и специально обнаруживает воздействие на глюкокортикоидов сигнализации соединениями, которые требуют метаболизму или негативно повлиять на выработку эндогенного глюкокортикоидов.

Аннотация

Глюкокортикоидных гормонов стресса и их искусственные производные широко используются препараты для лечения воспаления, но длительное лечение глюкокортикоидами может привести к серьезным побочным эффектам. Тест-системы необходимы для поиска новых соединений, влияющих глюкокортикоидов сигнализацию в естественных условиях или определить нежелательные эффекты соединений на метаболизм глюкокортикоидов сигнализации. Мы создали трансгенных данио анализа, который позволяет измерять глюкокортикоидов сигнальной активности в естественных условиях и в режиме реального времени, GRIZLY анализ (глюкокортикоидный В естественных данио рерио активности люциферазы). Люциферазную основе анализа обнаруживает воздействие на глюкокортикоидов сигнализации с высокой чувствительностью и специфичностью, в том числе эффектов по соединений, которые требуют метаболизму или негативно повлиять на эндогенный продуцирование глюкокортикоидов. Мы приведем здесь подробный протокол для проведения химических экраны с этим анализом. Мы описываем сбор данных, нормализацию ианализ, поставив акцент на контроле качества и визуализации данных. Анализ обеспечивает простой и временным разрешением, и количественный отсчет. Он может работать в качестве платформы автономной, но также легко интегрируется в высокопроизводительного скрининга рабочих процессов. Кроме того, он позволяет в течение многих применений, помимо химического скрининга, такие как мониторинг окружающей среды эндокринные расстройства или исследований стресса.

Введение

Глюкокортикоиды (ГКС) являются стероидные гормоны, производимые надпочечниками, которые играют важную роль в реакции на стресс и в регуляции обмена веществ ^1. ГК связать цитоплазматические глюкокортикоидных рецепторов (ГР) на ядерных рецепторов суперсемейства, которые, при связывании, перемещать в ядро ^2. Здесь они могут, например, репрессировать транскрипцию путем вмешательства с другими факторами транскрипции (трансрепрессии) или активировать транскрипцию гена с помощью глюкокортикоидных чувствительными элементами (Gres, трансактивации). Из-за их противовоспалительными свойствами, как природные, так и искусственные ГК широко используются препараты для лечения ряда заболеваний, таких как астма или артрит ^3. Тем не менее, особенно при длительном применении ГКС может привести к серьезным побочным эффектам, в том числе диабета и глаукомы ^4. Таким образом, новые соединения, направленные на GC сигнализации с потенциально более выгодным эффективности лечения и переносимости высоко ценятся на кормеэ. Важно отметить, что лиганд эффекты, наблюдаемые в культивируемых клетках могут отличаться от тех, видели в естественных условиях ^5. Такие эффекты могут Результаты смещения, полученные с обычной культуре клеток на основе фармацевтических скрининга. Химический анализ в естественных условиях, как включается данио модели недавно попали в фокус, как это позволяет определить эффектов не обнаруживаемых в культуре клеток ^6,7.

Гормональные сигнальные пути также могут быть затронуты, загрязняющих окружающую среду. Так называемые эндокринные нарушения химических веществ (СЭД) влияют на различные гормональные регулируется процессы ^8. Таким образом, воспроизводство и половое различие водных организмов может модулироваться веществ с эстроген-подобных действий. В последнее время проблемы были подняты, что метаболические нарушения могут быть связаны с ЭДХВ в среде ^9. Один путь мишенью такой "метаболического нарушения" является глюкокортикоид путь, который также участвует в ксеноБиотики воздействие на развитие и иммунной функции ^10,11. Однако, по сравнению с большим количеством информации, доступной на соединений, препятствующих половых стероидных действия гормона, сравнительно мало известно о эндокринных эффектов на разрушение опосредованных через ГР. Таким образом, средства необходимы, что позволит мониторинга загрязнителей на GC сигнализации в естественных условиях.

Данио уже давно популярной моделью в биологии развития, а относительно недавно также привлекает исследователей из других областей, в том числе эндокринологии ^12. По сравнению с другими костистых рыб, система GC сигнализации данио более похож на млекопитающих, поскольку данио геном содержит только один ген ГР в отличие от дублированных рецепторов во многих других видов рыб ^13-15. Кроме того, гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой оси уже функционирует в 5-дневной данио личинки, которые увеличивают выработку эндогенного GC в ответ на ^{стресс-14,16-1}8.

Недавно мы генерируется трансгенного данио линию, GRE: Люк, который позволяет для мониторинга деятельности сигнализации GC в естественных условиях и в режиме реального времени ^18. Линия несет репортера люциферазы генную конструкцию под контролем минимального ТАТА бокс промотора и четыре concatemerized ГОЭ (фиг. 1а). GC индуцированный биолюминесценции может быть измерена с одной GRE: Люк личинки в 96-луночных микротитрационных планшетах в естественных условиях в течение длительных периодов времени. Это GRIZLY анализ (для "глюкокортикоидный в естественных условиях данио рерио активности люциферазы") может быть использован в ряде различных исследовательских областях, таких как стресс исследований, экологического мониторинга и фармакологических экранов ^18. Мы были в состоянии обнаружить эндогенный рост кортизола после осмотического стресса от одного личинок и может следовать созревание ответ в процессе разработки. Кроме того, мы могли контролировать воздействие на GC сигнализации оловоорганическогос, которые требуют метаболизму личинкой. Важно отметить, что линия была в состоянии обнаружить эти эффекты в экологически значимых концентрациях. Наконец, в пилотном экрана анализ чувствительно и специфически обнаружен соединений с GC активности от химической библиотеки, в том числе одного соединения, которое стимулированного эндогенную продукцию кортизола у личинок. Здесь мы описываем подробный протокол для химических экранов с использованием анализа GRIZLY.

протокол

1. Подготовьте рабочее разведение химической библиотеки

Предварительно разведите соединений библиотеке испытуемого лекарственного средства (например, FDA утвержденных препаратов, Энцо науки о жизни) в Е3 (5 мМ NaCl, 0,17 мМ KCl, 0,33 мМ CaCl ₂₎ с роботизированной наливных станции (например Multiprobe II, 8 игл с наконечник утилизации адаптер, PerkinElmer). Подходящие концентрации являются, например, 40 мкг / мл в 3% ДМСО, но это будет зависеть от типа используемой библиотеки. Параметры Multiprobe II, соответствующие этапам, описанным ниже, указаны в таблице 1. Протокол, описанный в таблице позволяет получать четыре аликвотных пластин параллельно.

1. Внесите 10 мкл аликвоты фондовом библиотеки (2 мг / мл в ДМСО) в глубокие тарелки также (например 96-луночный планшет для хранения, Круглый Ну, 0,8 мл ABgene). Колонки 1 и 12 должна быть пустой - они будут получать положительные и отрицательные внутри-пластины управления.
я> Внесите 490 мкл E3 с 1% ДМСО в приготовленных аликвотам библиотеке с Multiprobe II. Разведение выполняется с фиксированными иглами без свалок.
2. Добавить 10 мкл ДМСО в колонну 1 и 10 мкл раствора 5 мМ дексаметазона (в ДМСО) в колонке 12 как внутри-пластины управления. Концентрация ДМСО во всех лунках теперь 3%, концентрация дексаметазона в положительных контрольных лунок 100 мкм E3 / 3% ДМСО.
3. Уплотнение тарелку с ДМСО водостойким клеем уплотнительных листов. не хранить пластин при -80 ° С до использования.

2. Разведение Reporter рыбы

Сбор эмбрионов из естественного нереста групповых вязки между GRE: Люк трансгенных рыб. Поднимите эмбрионов (не более 60) в 9 см чашки Петри, содержащие E3 среду не дополненную 1 мг / мл фунгицида метиленового синего до 4 дней после оплодотворения (DPF) в инкубаторе при 28 ° С Изменение E3 среды регулярно.

Название "> 3. Подготовка люциферазы Medium (E3L)

Приготовить водный люциферин исходного раствора 50 мМ добавлением дН ₂ O во флакон, содержащий люциферин порошок. Этот исходный раствор может храниться при -80 ° С в течение нескольких месяцев. Развести люциферин запас в E3 среде до конечной концентрации 0,5 мМ, чтобы получить E3L среды.

4. Распределить Личинки в 96-луночных планшетах

1. Подготовить 1 мл пипеток с широким отверстием, отрезав примерно 5 мм, кончик и кратко пылающий острые края.
2. Бассейн личинки из нескольких крестов, осторожно лить их из чашек Петри в стакан. Урожай около 50 личинок в то время, осторожно наливая их на сито (размер пор диаметром 0,25 мм) и сразу же поместить сито в небольшую чашку Петри (диаметр 5,5 см), заполненной E3L среды.
3. С широким наконечником отверстие пипетки, передача 225 мкл среды, содержащие одну личинку каждый в лунки белый96-луночный планшет (Optiplate, PerkinElmer).
4. Уплотнение пластин с клей уплотнительных листов (например, Topseal-A, PerkinElmer) и инкубируют их при 28 ° С в течение ночи. Это инкубация предотвращает запись переходных изменений в биолюминесценции сразу после того люциферина, явление, которое происходит также в культивируемых клетках ^19.

5. Фармакотерапия

1. Снимите пластину, содержащую готового раствора библиотеки от -80 ° C морозильник около 4 ч перед использованием. Аккуратно вихрь пластины и кратко вращать его в центрифуге для сбора жидкости в нижней части пластины.
2. Удалить клейкие уплотнительные листы от личинок пластин.
3. С ручным 96-канальной пипетки устройства (например, Ликвидатор, Steinbrenner) пипетки лекарственного раствора вверх и вниз 3 раза. Тогда аликвоту 25 мкл готового раствора химического библиотеки в лунки, содержащие личинки (с приведенном выше примере, этоприводит к конечной концентрации 4 мкг / мл в E3 с 0,3% ДМСО). Подготовка 10 (не менее 5) реплики пластины с личинок на библиотеки пластины.
4. Уплотнение тарелки с клеем уплотнительных листов и маркировать каждую тарелку с штрих-наклейке.

6. Свечение Запись

1. Положите пластины, содержащие личинки в укладки единиц в Envision биолюминесценции читателя с повышенной чувствительностью люминесценции (PerkinElmer). Вместо этого можно использовать роботизированный систему инкубатора например занятых для млекопитающих скрининга системах клеточных культур в сочетании с читателем.
2. Запись биолюминесценции в течение двух дней с помощью настроек чтения, аналогичные описанным в таблице 2 для читателя представить себе. Адаптация количество аналитических повторов с числом пластин в перспективе, чтобы соответствовать требуемой бега время.
3. После конце прогона, проверьте пластины на наличие погибших личинок, чтобы оценить общее токсичность компounds.

7. Анализ данных

Весь анализ данных выполняется в статистической среды программирования R с помощью пользовательских сценариев.

1. AUC расчет
   В целях выявления соединений активирующие GC сигнализации независимо от их кинетических свойств, определения площади под кривой (AUC) записанных люминесценции следов (биолюминесценции исходных импульсов в зависимости от времени) в качестве параметра экранирования. AUCs аппроксимируются с трапеций (см. 2а и А ').
2. Нормализация
   Вход преобразовать АУК, чтобы обеспечить более высокую нормальность данных (фиг. 2b и B '). Тогда нормализовать журнала превращается АУК для каждой библиотеки пластины с надежной метода Z-счет (см. ^20). Такая нормализация приводит значений, представляющих количество стандартных отклонений от медианы всех точек данных. Таким образом,систематические ошибки, такие как изменчивость между выполнения, будут удалены из данных. Данные теперь могут быть визуализированы откладывая среднюю надежную Z-балл реплик для каждой скважины (рис. 2в и с ').
3. Метрики качества
   1. Тепловая карта
      Для того чтобы визуализировать пластины эффектов, связанных, построить данные для каждой пластины как Тепловая карта, используя, например, функции heatmap.2 от gplot пакета ^21. Таким образом, краевые эффекты или соединение переноса могут быть легко обнаружены (сравните, например, с рис. 3а 3b). Исключить неоптимальные пластины из дальнейшего анализа.
   2. РПЦ кривая
      Чтобы определить чувствительность и специфичность анализа, расчета приемника, работающего характерный (ROC) кривая, например, с помощью Bioconductor пакета РПЦ ^22, используя значения Z-оценка определяется в 7,2 (рис. 3в). Впоследствии определить AUC этого у.е.RvE. AUC значение близко к 1 указывает на высокую чувствительность и специфичность анализа.
4. Хитов Идентификация
   Для оптимизации порогового значения для идентификации активных соединений, определить индекс Youden. Для расчета индекса, вычесть расчетную истинную положительные темпы (TPR) от ложных срабатываний (РСП) кривой ROC для повышения надежные Z-оценка пороговых значений. Возьмите надежную Z-счет с наивысшим коэффициентом Youden (TPR минус РСП) в качестве точки отсечки. TPR / FPR можно оценить путем определения положительных контрольных лунок или известных активных соединений в библиотеке. При использовании положительного контроля скважин убедитесь, что они совпадают ожидаемого прочность хит.

8. Повторное проведение

1. Пересмотреть положительные хит соединений путем обработки личинок с серийных разведений соединений, полученных от другого поставщика, используя ту же запись настройки, описанного выше. Правда хиты должны побудить люминесценции ALSO в этом анализе, в идеале в зависимости от дозы.

Результаты

В предыдущей публикации ^18, мы провели скрининг библиотеку 640 FDA утвержденных препаратов в пилотном экране, чтобы оценить производительность анализа GRIZLY. Эта библиотека содержится 12 истинному ШС, тем самым позволяя нам определить качество мер по чувствительности и специфичности анализа.

Рисунок 2 показывает типичные примеры исходного анализа данных и нормализации, взятой из этого экрана. Типичный результат из элемента управления дексаметазон хорошо изображен на рисунке 2а, иллюстрирующая временную информацию, предоставленную данных. Пик биолюминесценции, что происходит при температуре около 12 ч после лечения медленно уменьшается в течение следующего 36 час измерения. 2а 'подчеркивает приближении AUC значения, используя метод трапеции. Этот расчет проводится для всех скважин и каждого технического повторения. Результат трансформации журнала показана на рис 2b </ STRONG> и Ь '. Здесь среднее значение положительного контроля приведены в нормальном QQ участка. Войти преобразование приводит к большему сближению точек данных в теоретических нормально распределенных значений, указанных красными диагоналями. Преобразование для достижения нормальность данных увеличивает статистическую силу последующих анализов. Наконец, показатели 2с и 2с 'показывают влияние надежной Z-счет нормализации на пластину-к-пластины изменчивости: Различные базовые значения, полученные с различных пластин (рис. 2, в) нормированы в прочном участке Z-счет в фиг.2с ".

Прочные значения Z-балл может быть использован для идентификации систематических ошибок в данных посредством визуализации распределение попаданий через пластины. Фиг.3А показан один пример HeatMap библиотечного пластины, в которой прочный Z-Val счетЕЭС нанесены цветные в позиции а. Легко идентифицирует столбец 12 с в-пластины положительного контроля. Положительные соединения забил библиотека видны в а F8 и, хотя слабее, Е2. Рис. 3б показывает тарелку, в которой систематическая ошибка присутствует. Наблюдается ряд соединений с уменьшением значения Z-счет в строках А и Е в течение нескольких столбцов. Ни одно из соединений в этих скважинах не дали положительный результат в повторном испытании. Поскольку скважины с этим уменьшением тестовой деятельности GRIZLY размещаются вдоль пути пипетирование робот берет, когда аликвоты библиотеки пластины, эта картина свидетельствует о перенесенных положительного соединения во время автоматизированного процесса пипетки.

Надежная Z-оценка нормализация вместе с наличием известных ГК в библиотеке также позволило рассчитать приемник Характеристика срабатывания (ROC) кривая для экрана ^18. 3, в приведена сюжет оцеповязана истинную положительные темпы против расчетной ложных срабатываний для различных надежных Z-счет пороговых значений. Оценочная верно положительный показатель определяется как процент верных положительных хитов (здесь известных глюкокортикоидов, присутствующих в библиотеке), которые находятся в данный надежной Z-счетом порогового значения. Соответствующее оценкам процент ложных срабатываний указывает процент не-положительных соединений ударил при этом значении отсечки. AUC этой кривой 0,95, что указывает на высокую чувствительность и специфичность экрана и отличную производительность анализа. Кривая AUC также была использована для оценки оптимального порогового значения для идентификации меткости расчета индекса Youden для различных надежных Z-баллы. Мы определили надежную Z-балл 1,49 как имеющие самый высокий показатель Youden. Это отсечения значение указано на рисунке 2с 'виде черной линии, разделяющей хиты от основной массы соединений.

В нашем экране^18, мы смогли определить почти все известные ШС, присутствующие в библиотеке. Только три из 12 добросовестных ГК не были обнаружены. В случае меленгестрол ацетата, это была ложная негативная находка, так как это соединение дали положительный результат в повторном тесте при более высокой концентрации, чем той, которая используется в библиотеке. Два других ГК были отрицательными и в повторную проверку. Кортикостерон является основным GC у грызунов, но не в рыбу или человека ^1, в то время как преднизон пролекарство может быть не метаболизируется хорошо личиночной системы. Интересно, что также два препарата не аннотированные как ШС были определены в экране, один из которых не может быть подтверждена в повторную проверку (спиронолактона, минералокортикоиды антагонист рецепторов). Другое соединение, прегненолон, является предшественником в биосинтезе стероидов, который преобразуется в кортизола надпочечниками. Действительно, лечение прегненолона стимулировали выработку кортизола у личинок ^18. Все эти результаты подтверждают высокую перфорацияormance из анализа: только один ложный отрицательный и один ложный положительный соединение были среди результатов первичного скрининга, и 10 из 11 подтвержденных соединений с стимулирующего деятельности ГК сигнализации уже определены в первичном экране.

Рисунок 1. Общий принцип анализа и работы потока процедуры отбора.) Схема GRIZLY анализ репортерной конструкции. Люциферазы (желтый) выражение под контролем минимального промотора (P _мин, оранжевый) и четыре concatemerized элементов GRE ((GRE) _4, белый), которые связаны лиганд-активированных GR гомодимеров (GR, синий). Красные прямоугольники обозначают Tol2 транспозазу сайтов, которые облегчают интеграции конструкции в геном. Розовая коробка представляет собой сайт поли-аденилирование (ПА). Трансгенные личинки несут эту конструктура помещают в 96-луночный непрозрачных микротитровальных пластин для измерения биолюминесценции. б) Схема реакции люциферазы. Люциферазы катализирует окисление люциферина в оксилюциферин, что приводит к эмиссии света (hν). Реакция требует также АТФ и Mg ^{2 +,} который входит в состав личинки. ПП _я, пирофосфат. С) Workflow экрана. Рабочие фондовые разведения получают из FDA одобрил библиотека лекарственных средств в 96-луночные планшеты, один столбец, содержащий отрицательное в пластине-контроль (только DMSO, зеленый) и один столбец, содержащий положительный контроль (дексаметазон, красный) (библиотека конструкция). GRE: Люк личинки распределены в 96-луночные планшеты (5-11 повторяет) и обрабатывали библиотеки соединений (применения препарата). Биолюминесценция следы записываются с читателем биолюминесценции в течение двух дней (сбора данных). Биолюминесценция следы интегрированы (AUC расчеты), войти трансформируется и надежная Z-оценка нормализованы (normaliзация). Нормированные данные используются для определения показателей качества и для идентификации хит (анализа данных). Выбранный хиты повторно для дозозависимым деятельности в анализе (повторной проверки). Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Рисунок 2. Анализ данных показано с данными из экрана FDA одобрило библиотеку наркотиков. а) представитель след от лунки положительного контрол. а ') площадь под кривой (AUC) аппроксимируется с правилу трапеций. В трапеции, используемые для расчета приведены в разных оттенков красного б) Нормальный QQ участок сырьевых AUC значений положительных контрольных лунок (Y-ось) против стандартного нормального населения (оси х) до преобразования журнала. Б '. ) Нормальная QQ участок из значений ППК после трансформации журнала. Нормальное распределение обозначается линейности журнала превращается точек данных. C) земельный журнал превращается исходные данные для всех тестируемых соединений на экране. Синий, добросовестных глюкокортикоиды;. Серый, все другие соединения с ') земля экранных данных после надежной Z-счет нормализации. Систематические ошибки, такие как вариации между пластин были удалены из данных. Красные линии обозначают среднее ± SEM положительных внутриплитных управления. Черная линия: ударил идентификационный порогового значения, как определено Youden-Index оптимизации (рис. 3). Воспроизводится с разрешения ^14, 2012 ACS. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

0439fig3.jpg "/>
Рисунок 3. Результаты экрана. а) Тепловая карта результатов экраном. Прочные значения Z-счет библиотечных соединений приведены в соответствующих положениях также. Положительные контроли в колонке 12, а также два положительных хит соединения в скважинах F8 и Е2 могут видеть. Б) Тепловая карта пластины показывая перенесение положительного соединения во время библиотеки препарата с пипетки робота. Градиент деятельности видна по пути пипетки, принятого робота. С) Приемник характеристической (ROC) кривая для экрана. Сметные истинные положительные темпы (левая ось у) и ложные положительные темпы (ось Х) построены для увеличения надежные Z-оценка пороговых значений (цветом, правая ось у). Значение AUC из полученной кривой близко к 1, что указывает на хорошую производительность анализа. Воспроизводится с разрешения с ¹⁴ 2012 ACS. Г) таблица, показывающая соединения активным (Yelloж) или неактивное (синий) на первичном экране (Прим.) или в повторном тестировании. Добросовестные глюкокортикоиды не всегда повторно (белый). Перерисованы с разрешения ^14, 2012 ACS. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Общие параметры:
Шаг 1.1
Процедура	Тип:	один жидкости
	Режим:	задуть
	обходится в аспирации:	1
	оптимизации по скорости:	Да
	воздушные зазоры система:	10 мкл
	транспорт:	0
Флеш / Wash	Нет
Произносить с придыханием	Тип установки	Значение	замечания
	Положение	В7, В10, В13, В16
	Аспирируйте Vol.	10 мкл
	Скорость	200 мкл / сек
	Жидкость слежения	60%
	Аспирируйте Высота	Лабораторное оборудование по умолчанию	22.28
Распределять	Тип установки	Значение	замечания
	Позиции	D7, D10, D13, D16
	Внесите Vol.	10 мкл
	Скорость	200 мкл / сек
	Жидкость слежения	100 мкл
	Внесите Рост	Лабораторное оборудование по умолчанию	17.01
Шаг 1.2
Процедура	Тип:	реагент
	Режим:	отходы
	обходится в аспирации:	3
	оптимизации по скорости:	Да
	воздушные зазоры система:	15 мкл
	транспорт:	0
Флеш / Wash		Нет
Произносить с придыханием	Тип установки	Значение	замечания
	Положение	A4
	Аспирируйте Vol.	3 х 490 мкл
	Воздушные зазоры	15 и 0
	Скорость	200 мкл / сек
	Жидкость слежения	400%
	Аспирируйте Высота	Поверхности жидкости
Распределять	Тип с Etting	Значение	замечания
	Положение	D7, D10, D13, D16
	Внесите Vol.	490 мкл
	Воздушные зазоры	15 и 0
	Скорость	200 мкл / сек
	Жидкость слежения	100%
	Внесите Рост	Лабораторное оборудование по умолчанию	17.01

Таблица 1. Настройки для Multiprobe II. Протокол в таблице 1 описывает приготовление 4 пластин (каждый 96 скважины). Пластины расположены на пластинчатых адаптеров в рабочей зоне в положениях указанного робота (например, В7, В10, В13, В16).

1 "FO: держать-together.within-страницу =" всегда "> Общие параметры: Количество аналитических повторов зависит от длины пробега Количество пластин неограниченный Регулирование температуры 28 ° C Протокол Расчеты США Лам 96 (гц) читать Время измерения 2.5 сек Коррекция Перекрестные помехи Расстояние между пластиной и детектора 0 мм Свечение (а2) Корректирующий коэффициент 0% Содержание "> Таблица 2. Параметры Envision используемые для экрана.

Обсуждение

Мы приведем здесь рабочий процесс и анализа данных для химической экране измерения GC деятельность в естественных условиях с использованием GRIZLY анализа ^18. Анализ имеет характеристики контроля качества и показателей эффективности, которые сопоставимы с обычными экранами на основе клеток, важным преимуществом для его использования в условиях высокой пропускной. Кроме того, однако, в естественных условиях анализа обнаруживает также соединения, которые не доступны на экраны в пробирке. Примером этого может служить присутствии прогормонов прегненолона среди хитов. Таким образом, анализ GRIZLY расширяет сферу экранов, направленных на сигнальной активности GC.

Важность обнаружения естественных условиях эффектов в с нашим анализом также иллюстрируется результатами мы, полученных с DBT загрязняющих оловоорганические и ТБТ ^18. DBT, но не ТБТ, как было показано, ингибирует передачу сигнала GC в культуре клеток млекопитающих, и мы наблюдали то же самое в культурах клеток выражают даниоING в GRE: Люк репортер. Важно отметить, однако, в данном анализе GRIZLY, ТБТ показали ингибирующую активность по ГХ пути, так как он может быть преобразован в DBT на личиночной метаболизма. Это торможение наблюдалось уже на экологически значимых концентрациях ТБО. Эти результаты иллюстрируют потенциал анализа GRIZLY в обнаружении комбинированного воздействия, основанные на меж-органов перекрестных помех и метаболических модификаций соединений в живом организме. Они также подчеркивают приложений потенциал анализа GRIZLY для мониторинга окружающей среды. Таким образом, эффекты эндокринной нарушающими могут быть изучены на уровне сигнализации рецептора, где нарушающими мешает GC сигнализации активности индуцированного агонистом GR таких как дексаметазон. Другая возможность состоит в изучении сложное воздействие на прегненолона-стимулированных GC синтеза. Высокое качество пропускная способность анализа должны допускать быстрого скрининга образцов окружающей среды библиотек.

Использование люциферазы в качестве арГен eporter позволяет высоким динамическим диапазоном обнаружения активности ²³ сигнализации. Действительно, чувствительность анализа дает возможность обнаружить осмотический стресс-индуцированной продукции GC от одного личинок ^18. Высокая временное разрешение достигается с люциферазы репортера позволяет проследить сигнализации деятельность в течение долгого времени, что дает возможность анализировать также кинетики данных.

Потенциальный недостаток для некоторых приложений является ограниченная пригодность для пространственного мониторинга этого репортера системы. Люминесцентные репортер системы могут быть лучше подходит для анализов, требующие мониторинга определенных областях личинок. Однако такие анализы могут страдать от более низких чувствительности из-за фоновых эффектов, вызванных света возбуждения, который также создает ограничений на обнаружении флуоресцентных соединений. Кроме того, они могут обеспечить меньшую кинетическую разрешение из-за обычно более высокой стабильности флуоресцентных белков ^23.Кроме того, они представляют проблемы с точки зрения съемочной аппаратуры, анализа данных и хранения данных, которые могут ограничить их использование для небольших исследовательских лабораторий.

Множество планом анализа GRIZLY как анализа микротитрационный планшет на основе позволяет легко интеграции в типичных скрининга рабочих процессов. Анализ легко применимы и в небольших исследовательских лабораторий из-за его простоты использования и анализа данных. В то же время, это позволяет в значительной степени автоматизации, например, автоматизированные применение препарата с помощью пипетки роботов или автоматизированное распределение зародышей по эмбриона сортировка устройств ^24,25. Простой считывания не требует автоматической сортировки микроскопы или сложное программное обеспечение для анализа изображений, но обеспечивает богатый набор данных о временных и количественных аспектов изучаемого сигнального пути.

Таким образом, мы представляем шаг за шагом протокол для относительно недорогой, надежный и простой в обращении химической скрининге для GCдеятельность сигнализации в естественных условиях и в реальном времени. Анализ позволяет определить эффектов в естественных условиях соединений на GC сигнализации не обнаруживаются в культуре клеток на основе анализов. Среди многих приложений для анализа являются, например, определения генетических эффектов на глюкокортикоидов сигнализации, мониторинга окружающей среды, подрывающих эндокринную систему воздействия на глюкокортикоидов синтеза и активности сигнализации, а также скрининга соединений для нежелательных эффектов на GC сигнализации или для романа в естественных условиях модуляторов это важно сигнальный путь.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Buffer composition + reagents
Dimethyl sulphoxide (DMSO)	Carl Roth GmbH Co KG	A994.2
FDA approved drug library	Enzo Life Sciences	BML-2841-0100
Luciferin	Biosynth	L-8220
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D4902
Methylene Blue	Sigma-Aldrich	M9140
E3	N/A	N/A	5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2
Instruments
Multiprobe II	PerkinElmer		8 channel, equipped with disposable tip adaptor
Liquidator 96	Steinbrenner Laborsysteme		hand-operated 96-channel pipette
EnVision XCite Multilabel Plate Reader	PerkinElmer		Equipped with stacker automation, temperature control, barcode reader and enhanced luminescence detector
Plasticware + consumables
96-Well Storage Plate	ABgene	AB-0765	round well, 0.8 ml
Cover films,	ratiolab	6018412	self adhesive, DMSO resistent
Pipette tips	Steinbrenner Laborsysteme	LRF-200L	for liquidator 96, 200 μl, low retention
TopSeal-A	PerkinElmer	6005185
OptiPlate-96	PerkinElmer	6005299	white opaque 96-well microplate
Barcode Labels	PerkinElmer	1608182
filtered polypropylene IsoTip pipette tips	Corning	S058.4809
Animals
GRE:Luc fish	N/A	ZDB-TGCONSTRCT-120920-1	available at the European Zebrafish Resource Centre EZRC, Karlsruhe