Submillisecond конформационные изменения в белках решены фототермического отклонения луча

Резюме

Здесь мы сообщаем применение методики отклонения фототермическая луча в сочетании с в клетке соединения кальция, DM-nitrophen, для отслеживания микросекундные и миллисекундные динамику и энергетику структурных изменений, связанных с ассоциацией кальция в нейронной датчика кальция, Переработка регуляторный элемент антагонистов модулятор .

Аннотация

Отклонение Фототермическая луч вместе с фото-акустической калориметрии и термического решетки принадлежит к семейству фототермических методов, которые контролируют Время-профиля громкости и энтальпии изменения света, индуцированные конформационные изменения в белках на микросекунды до миллисекунды временные рамки, которые не доступны в режиме обычного стоп -потока инструменты. Кроме того, поскольку общий изменения объема и / или энтальпии зондируются, эти методы могут быть применены к белков и других биомакромолекул, которые не имеют флуорофор и этикетку или хромофора. Для мониторинга динамики и энергетику структурных изменений, связанных с Са ^{2 +} привязка к кальция преобразователей, таких нейронных датчиков кальция, в клетке соединения кальция, DM-nitrophen, используется для фото-триггера быстрой (τ <20 мкс) увеличение свободного кальция концентрации и связанное с ним объема и энтальпии зондируются используя технику отклонения фототермическая луча.

Введение

Фототермические методы, такие как фотоакустического калориметрии, прогиб фототермическая пучка (PDB), и переходных решетки в сочетании с наносекундного лазерного возбуждения представляют собой мощную альтернативу переходных оптических спектроскопии для временным разрешением исследований короткоживущих промежуточных ^1,2. В отличие от оптических методов, таких как нестационарного поглощения и ИК-спектроскопии, что наблюдение за временной профиль изменения поглощения в окружающем хромофора; фототермические методы обнаружить временную зависимость изменений тепло / объем и, следовательно, являются ценными инструментами для исследования временных профилей оптически "молчаливые" процессы. До сих пор, фотоакустическая калориметрии и переходные решетки успешно применяется для изучения конформационных динамику фотоиндуцированных процессов, включая двухатомной миграции лиганда в глобинов ^3,4, лиганд взаимодействия с белком кислородного датчика FixL ^5, электрон и протон транспорт в гема-медь оксидазы ⁶й фотосистемы II, а также фото-изомеризации в родопсина ⁷ и конформационной динамики криптохрома ^8.

Чтобы расширить применение методов фототермических в биологических системах, которых не хватает внутреннего хромофора и / или флуорофор, техника PBD сочеталась с использованием клетке соединения к фото-триггера увеличение концентрации лиганд / подложки в течение нескольких микросекунд или быстрее, в зависимости на клетке соединения. Такой подход позволяет мониторинг динамики и энергетики структурных изменений, связанных с лиганд / связывание субстрата с белками, которых не хватает внутреннего флуорофор или хромофора и на временной шкале, которые не доступны инструментов коммерческих стоп-потока. Здесь применение PBD контролировать термодинамику клетке соединения, Ca ^{2 +} DM-nitrophen, фото-расщепление, а также кинетика для Ca ^{2 +} ассоциации с С-концевого домена нейронной датчика кальция внизпоток регуляторный элемент антагониста модулятор (DREAM) представлена. Са ^{2 +} является фото-освобожден от Ca ^{2 +} DM-nitrophen в пределах 10 мкс и повторную привязку к unphotolysed клетку с постоянной времени ~ 300 мкс. С другой стороны, в присутствии apoDREAM дополнительной кинетической происходит на временной шкале миллисекунд наблюдается и отражает связывание лиганда с белком. Применение PBD, чтобы исследовать конформационные переходы в биологических системах была как-то ограничена из-за инструментальных трудностей; например трудным выравнивание зондом и пучка накачки для достижения сильного и воспроизводимый сигнал PBD. Однако тщательная разработка контрольно-измерительного настройке, точный контроль температуры и осторожны выравнивание пробного луча и насоса обеспечивают последовательный и надежный сигнал PBD, который позволяет мониторинг временным разрешением объема и изменения энтальпии на широкий временная шкала от 10 мкс до примерно 200 мс. Кроме того, Modificобъема экспериментальной процедуры, чтобы гарантировать обнаружение проб и эталонных трасс под одинаковой температурой, буферной состава, ориентации оптических клеток, мощности лазера и т.д. значительно снижает экспериментальную ошибку в измеренных реакционных объемов и энтальпий.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Примеры Подготовка

1. Провести подготовку образца и все образцы манипуляций в темной комнате, чтобы предотвратить нежелательную uncaging.
2. Растворения DM-nitrophen ((1 - (2-нитро-4 ,5-диметоксифенил) - N, N, N ', N'-тетракис [(окси-карбонил)-метил] -1,2-этандиамин) в 50 мМ HEPES буфер, 100 мМ KCl, рН 7,0 до конечной концентрации 400 мкМ (ε _{350 нм} = 4330 М ^-1 см ^{-1 9).}
3. Добавить CaCl ₂ от маточного раствора 0,1 М для достижения желательного соотношения [Ca ^{2 +]:} [DM-nitrophen]. Для белков с _Уб для Ca ^{2 +} ассоциации более 10 мкм, отношение [Ca ^{2 +]:} [DM-nitrophen] 1:1 предпочтительнее предотвращения связывания фото-выпущен Ca ^{2 +} в Uncaged DM-nitrophen . Действительно, с учетом стоимости _{С У} для DM-nitrophen быть 10 нМ и общая концентрация DM-nitrophen и Ca ^{2 +} быть 400 мм, ~ 90% кальция связывающего белкас K _D = 10 мкм будет в apoform. С другой стороны, для изучения Са ^{2 +} связывания с белками с K _D <10 мкм, это предпочтительнее, чтобы уменьшить [Са ^{2 +]:} [DM-nitrophen] отношение к 0,95 предотвратить Ca ^{2 +} комплексообразованию с апо- белок до клетке фотодиссоциации.
4. Солюбилизации Ссылочное соединение, K ₃ [Fe (III) (CN) _6] или Na ₂ CrO _4, в том же буфере, как для образца.

2. Настройка эксперимента

1. Основная экспериментальная конфигурация показана на рисунке 2.
2. Используйте отверстие под штифт (P _2), чтобы регулировать диаметр пробного луча (632 нм выходе He-Ne лазера, ~ 5 мВт мощность лазера) до 1 мм и распространять пробного луча через центр ячейки, помещенной в температуре контролируется держатель клеток с использованием М ₁ зеркало.
3. Используйте зеркало (м ₂₎ за образцом для центрирования луча датчикана центре чувствительной положение детектора.
4. Фокус зондирующего луча на центр детектора таким образом, что разница в напряжении между двумя верхними диодов и нижних двух диодов, а также разница в напряжении между двух диодов на левой и правой стороне детектора нулю.
5. Впоследствии, форма диаметром луча накачки, в 355 нм выход добротности Nd: YAG лазера, ПШПВ 5 нс) с помощью 3 мм крошечное отверстие (P _1), расположенный между двумя 355 нм лазерных зеркал.
6. Copropagate пучка накачки через центр кюветы, как показано на рисунке 2. Важно, что оба лазерные лучи распространяются через центр оптического клетки в почти коллинеарными образом, чтобы получить измеримый угла рассеяния и, следовательно, высокую амплитуду сигнала PBD. В экспериментальных условиях, угол пересечения зонда и пучков накачки меньше 15 °.
7. Использование эталонного соединения для выравнивания зонд и насослуча для достижения удовлетворительного сигнал PBD, т.е. хорошим соотношением сигнал / шум и стабильной амплитуды PBD на длинных временных масштабах (~ 100 мс).
8. Отрегулируйте положение луча накачки по отношению к пробного луча с помощью дополнительных регулировки 355 нм лазерных зеркал.
9. Измерение амплитуды опорного сигнала PBD в виде разности между двумя верхними и нижними фотодиодов на позиционно-чувствительный детектор. Сигнал PBD должен наблюдаться быстрый рост амплитуды на быстром масштабе времени (<10 мкс) и остаются стабильными на 100 мс сроки, как показано на рисунке 3. Выстрела к выстрелу изменчивости амплитуды PDB находится в пределах 5% от амплитуды сигнала и сигнал воспроизводимость в основном пострадали от вибрации.
10. Проверьте линейность амплитуды PBD сигнала по отношению к выпущенному тепловой энергии путем измерения линейную зависимость сигнала PBD на возбуждающего лазерного власти и о количестве Einsteins поглощается, E _A= ^(1-10-A), где А соответствует исходной оптической плотности при длине волны возбуждения.
11. Держите мощность лазера ниже примерно 1000 мкдж и оптическую плотность образца / эталонного соединения на длине волны менее 0,5 возбуждения, чтобы предотвратить поглощение многофотонную и уменьшение мощности луча накачки, соответственно, и обеспечить линейность сигнала PBD.

3. PBD Измерения

1. Начните с измерения следов PBD для справки. Поместите раствор эталонного соединения в 1,0 см х 1,0 см или 1,0 см х 0,5 см кварцевой кювете и поместите ячейку в контролируемой температурой держателя. Обе длины путей обеспечить сравнимую амплитуду PBD.
2. Обнаружение опорный сигнал PBD в виде функции температуры в диапазоне температур от 16-35 ° С с температурой приращения 3 ° С.
3. При каждом изменении температуры, проверить положение зонда пучка на позиционно-чувствительный детектор и повторноотрегулировать положение в центре детектора если это необходимо.
4. Проверьте линейность сигнала PBD в виде функции [(DN / ТД) / C] ρ _р термин в соответствии с уравнением 2.
5. Поместите раствора образца в том же оптическую кювету, как и для эталонного соединения сохраняя тот же ориентацию оптической кювете как для опорного измерения.
6. Обнаружение образцы PBD следы в том же диапазоне температур, как и для ведения и проверить линейность амплитуды образец PBD по отношению к [(DN / ТД) / С _р ρ] срок.

4. Анализ данных

Величина отклонения прямо пропорционально изменению объема из-за нагрева образца (ΔV _й) и нетепловой изменения объема (ΔV _nonth) в соответствии с уравнением 1:

Амплитуда образца _(S) И ссылка _(г) PBD сигнал можно описать с помощью уравнений 2 и 3, соответственно.

Сигнал PBD прямо пропорциональна параметра отклика прибора (K) и количество Einsteins поглощается (Е). Первое слагаемое в уравнении 2, (дп / ТД) (1/ρC _р) Q, соответствует изменению сигнала из-за тепла, выделяемого в растворителе. Дп / дт термин представляет собой изменение в зависимости от температуры показателя преломления, ρ-плотность растворителя, С _{р-теплоемкость.} Все параметры известны в дистиллированной воде и могут быть определены для буферном растворе путем сравнения сигнала PBD для сравнительного соединения в дистиллированной воде и в соответствующем буфере. Вопрос является количество тепловой Returneд в растворителе. Ρ (дп / д ρ) термин является единицей-менее постоянным, что не зависит от температуры в диапазоне температур от 10-40 ° C ^10. Ап термин _абс соответствует изменению показателя преломления в связи с наличием поглощающих видов в растворе, и это незначительным, если длина волны зондирующего луча смещена относительно спектров поглощения любых видов в растворе. Сигнал, возникающий от эталонного соединения _(г) выражается уравнением 3, где Е _{ч ν} является энергия фотона на длине волны возбуждения, Е _{ч ν} = 80,5 ккал / моль для возбуждения 355 нм.

1. Возьмем амплитуду сигнала опорной PBD в виде разницы между претриггер и после запуска PBD сигнала, как показано на рисунке 3. Аналогичным образом, определить амплитуду быстро _(с ^{быстро)} и медленная фаза _(с ^{медленным}) Сигнала образец PBD.
2. Чтобы исключить параметр отклика прибора, K, масштабировать амплитуду сигнала образец PBD амплитудой сигнала PBD для справки. Отношение сигнал выборки для опорного сигнала дает уравнение 4 и может быть записана как:
   
   
3. Используя это уравнение, определить тепло, выделяющееся в раствор (Q) и нетепловой изменения объема (ΔV _nonth) связан с фотоинициированной реакции со склона и перехвата, соответственно, земельного _[(с / _т) Е _{ч ν]} Термин в зависимости от температуры зависит перспективе [(дп / ТД) (1/ρCp)].
4. Для определения объема реакции и изменение энтальпии для быстрого и медленного процесса, масштабировать наблюдаемое объем и изменение энтальпии в соответствующее квантовым выходом в соответствии с уравнениями 5-7.
   
   
   
   
   
   
   Для многоступенчатого процесса с кинетика происходит на временной шкале от 10 мкс ~ 200 мс, объем и энтальпия изменения, связанные с отдельных стадий реакции может быть определена. Амплитуды и времена жизни для отдельных стадий анализируют с помощью аппроксимации данных функцией F (T), который описывает временной профиль объема и энтальпии изменений.
   
   где α ₀ соответствует _с ^{быстрым} и α _я соответствует _с ^{медленным} для каждого отдельного процесса и τ _я являются время жизни отдельных стадий реакции. Из температурной зависимости константы скорости FOг отдельные процессы (К ₌ 1 / τ _я) Энергия активации и энтропии параметры могут быть легко определены с помощью Эйринг участков.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Типичный пример PBD следы для Ca ^{2 +} фото-релизе от Ca ^{2 +} DM-nitrophen показано на рисунке 3. Быстрый фаза соответствует фото-расщепления Ca ^{2 +} DM-nitrophen и Ca ^{2 +} освобождения, тогда как медленная фаза отражает Са ^{2 +} привязка к nonphotolysed клетке. Участок из PBD амплитуды вы?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Физический принцип фототермических методов является то, что фото-возбужденная молекула рассеивает избыточную энергию через колебательной релаксации в основное состояние, в результате чего теплового нагрева окружающего ^1,12 растворителя. Для растворителей, таких как вода, это пр...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-(4,5-Dimethoxy-2-Nitrophenyl)-1,2-Diaminoethane-N,N,N',N'-Tetraacetic Acid	Life Technologies	D-6814	DM-nitrophen, cage calcium compound, keep stock solutions in dark to prevent photodissociation
4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid)	Sigma Adrich	0909C	HEPES buffer
Potassium ferricyanide (III)	Sigma Aldrich	702587	reference compound for PBD measurements
Sodium chromate	Sigma Aldrich	307831	reference compound for PBD measurements
He-Ne Laser Diode 5 mW 635 nm	Edmund Optics	54-179	use as a probe beam for PBD measurements
Oscilloscope,	LeCroy	Wave Surfer 42Xs	400 MHz bandwith
Nd:YAG laser	Continuum	ML II	pump beam for PBD measurements
M355; Nd:YAG laser mirror	Edmund Optics	47-324	laser mirror for 355 nm laser line
M1 and M2; Laser diode mirror	Edmund Optics	43-532	visilbe laser flat mirror, wavelength range 300-700 nm
P1 and P2; Iris Diaphragm	Edmund Optics	62-649	pin hole to shape the probe and pum beams
L1; bi-convex lens	Thorlabs	LB1844	a lens to focus the probe beam at the detector, EFL 50 mm, wavelength range 350-2,000 nm
DM, dichroic mirror	Thorlabs	DMLP505	a longpass dichroic mirror with a cutoff wavelength of 505 nm
F1; Edge filter	Andower	500FH90-25	a long pass filter with a cutoff wavelength of 500 nm
Temperature-controlled cuvette holder	Quantum Northwest	FLASH 300