JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Циркулирующие опухолевые клетки (CTCs) являются прогностическим в нескольких метастатических раковых заболеваний. Эта рукопись описывает стандартный CellSearch систему золотую (CSS) CTC перечисления платформу и выделяет наиболее распространенные ошибки неправильной классификации. Кроме того, два адаптированные протоколы описаны для пользовательского маркера характеристике ЦОК и СТС перечисления в доклинических моделях мыши метастазов с использованием этой технологии.

Аннотация

Большинство случаев смерти, связанных с раком происходить после развития метастазов. Это крайне опасная стадия заболевания связана с наличием циркулирующих опухолевых клеток (CTCs). Эти редкие элементы были продемонстрированы быть клиническое значение в метастатического рака молочной железы, простаты и колоректального рака. Нынешний золотым стандартом в клинической обнаружения и подсчета СТС является FDA-очищенный CellSearch система (CSS). Эта рукопись описывает стандартный протокол, используемые этой платформы, а также два дополнительных адаптированные протоколы, описывающие подробную процесс пользовательского оптимизации маркера для белка характеристике CTCs пациентов и сопоставимой протокола для СТС захвата в очень низких объемов крови, используя стандарт CSS реагенты, для изучения в естественных доклинических моделях мыши метастазов. Кроме того, различия в CTC качества между здоровой донорской крови подсыпали клеток из культуры тканей по сравнению с пациентами SAMP кровиле выделены. Наконец, несколько часто противоречивые элементы, которые могут привести к CTC ошибок ошибочной классификации изложены. Взятые вместе, эти протоколы будут служить полезным ресурсом для пользователей этой платформы, заинтересованного в доклинических и клинических исследований, касающихся метастазов и ЦОК.

Введение

В 2013 году, по оценкам, 580 350 людей будет умирать от рака и что 1660290 новых случаев этого заболевания будут диагностированы только в 1 США. Большинство из этих случаев смерти происходит после развития метастазов 2. Отсутствие в настоящее время эффективных методов лечения в лечении метастазов и ограниченное понимание метастатического каскада делает это стадия заболевания крайне опасная. Наличие циркулирующих опухолевых клеток (CTCs) в кровоток были продемонстрированы коррелирует с метастатической болезни 3. Эти клетки встречаются крайне редко и их обнаружение свидетельствует о общей выживаемости в метастатического рака молочной железы 4, простаты 5, и колоректальный рак 6. У этих больных, наличие ≥ 5 (молочной железы и простаты) или ≥ 3 (колоректальный) ЦОК в 7,5 мл крови свидетельствует о менее благоприятный прогноз по сравнению с теми пациентами с менее или без обнаруженных ЦОК в СэмомОбъем электронной крови. Кроме того, изменение количества СТС во время или после терапевтического вмешательства было продемонстрировано, чтобы быть полезным в качестве предсказателя ответа на лечение, зачастую раньше, чем используемых в настоящее время методов 7-10.

Было подсчитано, что в метастатических раковых больных, ЦОК происходят с частотой примерно 1 КТК за 10 5 -10 7 мононуклеарных клеток крови и у пациентов с локализованным заболеванием, эта частота может быть даже ниже (~ 1 в 10 8). Редкое характер этих клеток может сделать это трудно для точного и надежного обнаружения и анализа CTCs 11. Существует несколько методов (отзывы ранее 12-14) были использованы для обогащения и обнаружить эти клетки, используя свойства, которые отличают их от окружающих компонентов крови. В общем, СТС перечисление из двух частей процесс, который требует как стадию обогащения и стадию обнаружения. Традиционно по обогащению шаги полагаться на различия в физикеческих свойств ЦОК (размер ячейки, плотность, деформируемости) или на экспрессию белка-маркера (т.е. молекула эпителиальных клеточной адгезии [EpCAM], цитокератин [СК]). После обогащения, обнаружение CTC могут быть выполнены в нескольких различных направлениях, наиболее распространенным из которых анализы на основе нуклеиновых кислот и / или цитометрии подходы. Каждая из этих стратегий являются уникальными, имеющих свои преимущества и недостатки, однако все они не имеют стандартизации; необходимостью для входа в клинических условиях. Поэтому CellSearch система (CSS) был разработан для обеспечения стандартизованный метод обнаружения и подсчета редких ЦОК в крови человека с использованием флуоресцентной микроскопии и методов на основе антител 4-6. Эта платформа в настоящее время считается золотым стандартом в CTC перечисления и является единственной методикой одобрен в США пищевых продуктов и медикаментов (FDA) для использования в клинике 15.

CSS состоит из двух компонент платформы consistinг, (1) система CellTracks AutoPrep (далее по тексту подготовки инструмента), который автоматизирует подготовку образцов крови человека, и (2) в CellTracks Analyzer II (именуемую в дальнейшем прибора исследования), который сканирует эти Образцы следующие подготовки. Чтобы отличить CTCs от загрязняющих лейкоцитов препарат инструмент использует антитело опосредованной, феррожидкость подход магнитной сепарации и дифференциального окрашивания флуоресценции. Первоначально система этикетки CTCs с использованием анти-EpCAM антител, конъюгированных с наночастиц железа. Затем образец инкубируют в магнитном поле, и все немаркированные клетки отсасывают. Отдельные опухолевые клетки ресуспендировали, и инкубировали в дифференциальной флуоресценции пятна, состоящий из флуоресцентно меченные антитела и ядерного окрашивающего реагента. Наконец, образец переносят в магнитном картриджа, называется MagNest (далее по тексту магнитного устройства) и подкожноanned помощью анализа инструмент.

Анализ инструмент используется для сканирования приготовленных образцов с использованием различных флуоресцентных фильтров, каждый из которых оптимизирован на соответствующий флуоресцентного частицы, с использованием 10X объектива. CTCs определены как клетки, которые связаны с анти-EpCAM, анти-пан-CK-фикоэритрин (РЕ) (CK8, 18, и 19), и окрашивающим ядра 4 ',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI). С другой стороны, загрязняющие лейкоциты определяются как клетки, которые связаны с анти-CD45-аллофикоцианина (APC) и DAPI. После сканирования, потенциальные опухолевые клетки компьютерные определенные представлены пользователю. Из этих изображений, пользователь должен использовать качественный анализ с использованием определенных параметров и дифференциальное окрашивание, описанные выше, чтобы определить, какие события являются CTCs.

В дополнение к предоставлению стандартизированный метод для СТС перечисления, CSS позволяет молекулярных характеристик ЦОК на основе белковых маркеров, представляющих интерес. Это допрос свыполняться на уровне одной клетки, используя изотиоцианат флуоресцеина (FITC) флуоресценции канал не требуется для идентификации СТС 16. Хотя эта платформа предоставляет возможности для молекулярной характеристики, подробное процесс разработки протокола и оптимизации не четко определены. Три коммерчески доступные маркеры были разработаны производителем для использования с CSS, в том числе рецептора эпидермального фактора роста (EGFR), человеческого рецептора эпидермального фактора роста 2 (HER2) и инсулиноподобного фактора роста 1 рецепторов (IGF-1R). Анализ HER2, в сочетании с CSS, была использована несколькими группами, чтобы проиллюстрировать потенциал для СТС характеристики сообщить клинических решений и потенциально изменить существующие принципы лечения. Например, Fehm др.. 17 показали, что примерно треть больных раком молочной железы с HER2-первичных опухолей был HER2 + CTCs. Кроме того, Liu и соавт.18 недавно сообщил, что до 50% пациентов с + метастатическим раком груди не было HER2 + CTCs. Герцептин, рецептор HER2 вмешиваясь моноклональное антитело подтверждение того, большую пользу пациентов, у которых опухоли выразить достаточные уровни HER2, является широко используются для лечения пациентов с HER2 + первичных опухолей 19-21. Тем не менее, эти исследования показывают, что Герцептин может быть быть субоптимально используются и что СТС характеристика может помочь в прогнозировании ответа на лечение. В конечном счете, СТС характеристика может иметь потенциал для улучшения индивидуальное обслуживание.

Исследование СТС уникален тем, что она в значительной степени использовал подход прикроватные к-лабораторного стола. Этот метод, в отличие от настольных-к-ухода за больным исследований, которые часто могут потребоваться годы, чтобы повлиять на уход за больным, позволило CTCs быстрый вход в клинических условиях. Тем не менее, врачи не решаются использовать результаты анализа СТС в лечении пациента принятия макING в связи с отсутствием понимания их основной биологии. Поэтому соответствующие доклинические мышиные модели метастазирования и дополняют друг друга анализа СТС методов должны быть использованы для того, чтобы расследовать эти нерешенные вопросы. В общем, есть два типа доклинических моделях используются для изучения метастатического каскада, (1) модели спонтанное метастазирование, которые позволяют для изучения всех этапов метастатического каскада, и (2) экспериментальные модели метастазов, которые позволяют только для изучение поздних стадий в метастатического процесса, таких как транссудации и формирование вторичных опухолей 22. Спонтанные модели метастазов, привлекать инъекции опухолевых клеток в соответствующие ортотопических местах (например, инъекций раковых клеток простаты в предстательную железу для изучения рака простаты). Затем клетки дали время, чтобы сформировать первичные опухоли и спонтанно метастазированию вторичных сайтов, таких как кости, легких и лимфатических узлов. Вконтрастность, экспериментальные модели метастазов включать прямую инъекцию опухолевых клеток в кровоток (например, через хвостовую вену или внутрисердечной инъекции с клетками-мишенями для определенных местах) и, следовательно, пропустить начальные шаги intravasation и распространения вторичных органов 22. До сих пор большинство анализа СТС в в естественных условиях модельных систем была выполнена с использованием либо цитометрии основе 23 или адаптированных методик CTC человека на основе (например AdnaTest) 24. Хотя это и полезно, ни один из этих методов адекватно не отражают СТС перечисление с помощью золотого стандарта CSS. На основании клинической апробации, стандартизированной природе, и широкое использование в CSS, разработка захвата и обнаружения техники CTC для естественных условиях моделирования в который использует эквивалент подготовки образца, обработку и критериев идентификации было бы выгодно как результаты были бы сопоставимы с получены из образцов пациентов. Тем не менее, из-за объема REQuirements подготовки инструмента это не возможно обработать небольшие объемы крови, используя эту автоматизированную платформу. . Кроме того, предыдущая работа Элиан и др. 25 показали, что загрязнение образцов с мышь эпителиальных клеток (которое также соответствует стандартной четкости СТС [EpCAM + CK + DAPI + CD45 -]) может привести к неправильной классификации мыши клеток плоского эпителия, как ЦОК. Для решения этих вопросов адаптированный метод, который позволяет разработан использование из реагентов набора CSS CTC в сочетании с ручной процедуры выделения. Добавление FITC меченого человеческого лейкоцитарного антигена (HLA) антител в анализе позволяет опухолевые клетки человека следует отличать от мыши клеток плоского эпителия.

Эта рукопись описывается стандарт, коммерчески разработанный и оптимизированный протокол CSS для обработки пациентов образцы крови и распространенных ошибок, которые могут возникнуть, в том числе discrepanт предметы, которые могут привести к CTC ошибок ошибочной классификации. Кроме того, настройки из CSS анализа изучения определяемые пользователем белковые характеристики захваченных ЦОК и сопоставимой адаптированной методики CSS, что позволяет для обогащения и выявления ЦОК из малых объемов крови в доклинических моделях мыши метастазов описаны.

протокол

Все человеческие исследования, описанные в этой рукописи проводились под протоколами, утвержденными Советом Западной университета человеческого этике исследований. Все исследования на животных были проведены в соответствии с рекомендациями Канадского совета по уходу за животными, по протоколам, утвержденным Подкомитета использования животных Западного Университета.

1. Стандартный СТС Перечень от пациента проб крови с помощью CSS

1. Крови человека для сбора проб и подготовка к переработке по подготовке инструмента

  1. Используя стандартные асептических методов кровопускания, нарисовать минимум 8,0 мл крови человека в 10 мл CellSave трубки (далее как СТС консерванта трубки), который содержит этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA) и собственный сотовый консервант. Обратить 5x трубки, чтобы предотвратить свертывание крови. Образцы могут быть обработаны немедленно или хранить при комнатной температуре в течение до 96 часов.
  2. Снятиеэ CSS реагенты из холодильника и дать им возможность нагреться до комнатной температуры перед использованием.
  3. Использование одноразовый 10 мл пипетки и автоматизированной пипетки, собирают 7,5 мл крови из CTC консерванта трубки и медленно обойтись кровь в соответствующей маркировкой препарата обработки трубки прибора.
  4. Добавить 6,5 мл буфера для разведения в каждом образце. Смешайте путем обращения образец 5x. Центрифуга образца при 800 мкг в течение 10 мин с тормозом в положении "выключено". Следуйте инструкциям на экране по подготовке инструмента загрузить все образцы пациентов на систему для обработки. Образцы должны быть обработаны в течение 1 часа препарата.

2. Подготовка управления для обработки по подготовке инструмента

  1. Аккуратно вихрь управления флакон и инвертировать 5x перемешать.
  2. Осторожно снимите крышку с контрольной флакона и поместите перевернутый подготовки обработка труб инструмент сверху незакрытой пробирке. В одним быстрым движением, инвертироватьконтролировать флакон, и вылить содержимое в перерабатывающей трубки. В то время как перевернутый, мягко Флик стороны управления флакона выпустить оставшиеся содержимое.
  3. Осторожно снимите перевернутый флакон управления от обработки трубы, обеспечивая, чтобы жидкость не теряется и отложите в сторону. Использование 1000 мкл пипетки, собирать все оставшиеся содержимое из флакона и крышки и осторожно пипеткой в ​​обрабатывающую трубки.
  4. Следуйте инструкциям на экране по подготовке инструмента, чтобы загрузить контроль на систему для обработки.

3. Образец Сканирование на прибор исследования

  1. Следуйте инструкциям на экране по подготовке инструмента, чтобы разгрузить все образцы из системы. Свободно ограничить каждый картридж магнитное устройство и нажмите магнитное устройство с помощью руки или лабораторном столе, чтобы освободить пузыри, которые застряли к краям картриджа. После того, как все пузырьки были удалены, твердо ограничить картридж, заложить магнитное устройство квартиру, и яncubate в темноте в течение по крайней мере 20 мин при комнатной температуре. Образцы должны быть отсканированы в течение 24 часов подготовки.
  2. Включите прибора исследования и инициализировать лампу. При нагреве (~ 15 мин), загрузить проверки системы картридж на приборе исследования и выберите вкладку Test QC. Следуйте инструкциям на экране для выполнения необходимых мер по контролю качества.
  3. Загрузите образец на анализ документа и выберите вкладку Test пациента. Все сохраненные данные из подготовки инструмента будет отображаться. Нажмите кнопку Пуск, чтобы инициализировать сканирование образца. Система будет выполнять грубую фокусировку и края обнаружения на картридже магнитного устройства.
  4. Отрегулируйте все ребра по мере необходимости с помощью кнопки со стрелками. Выберите Принять. Система будет выполнять точной фокусировки и начать сканирование образца.
  5. После контроля сканирования результаты должны быть проверены с помощью определенных критериев для клеток шипами на высокой (CK + DAП.И. + CD45 - APC +) и низкой (СК + ДАПИ + CD45 - FITC +) концентрации. После образец пациента сканирования результаты должны быть пересмотрены для захваченных ЦОК, используя определенные критерии CTC (СК + DAPI + CD45 -).

2. СТС Характеристика для пользовательских маркеров с помощью CSS

1. Подготовка определяемых пользователем маркеров и приборостроения инициализации

  1. Развести интерес антитело с использованием первичных антител Bond разбавитель до желаемой концентрации в чашке маркер реагента с помощью следующей формулы, где работает концентрация представляет собой концентрацию антитела после дополнение к пробе и концентрации фондовой концентрация антитела в Реагент чашки. Для нескольких образцов, отрегулируйте антител объемы, как описано в таблице 1. Поместите маркер чашку реагента в положение 1 в реагента картриджа и лOAD картридж на CSS.
    Фото со концентрация = (Работа Концентрация х 850 мкл) / 150 мкл
  2. Соберите кровь, подготовить образцы, и загрузить подготовки инструмента, как описано выше стандартной СТС Перечень от пациента проб крови с использованием протокола CSS. Чтобы включить пользовательский маркер дополнение, выберите User Defined Пробирной при запросе подготовки инструмента. Введите имя маркер и выберите Сохранить. Как образцы загружаются в прибор, оператор будет предложено указать, какие должны получать пользовательский маркер, выбрав Да или Нет, если необходимо.

2. Образец Сканирование определяемых пользователем маркеров на прибор исследования

  1. Включите прибора исследования, инициализировать лампу, и осуществлять контроль качества и проверку системы, как описано в разделе 3.2 Стандартной СТС Перечень от пациента проб крови с помощью CSS протокол.
  2. Загрузите образец на анализ документа и выберите вкладку Настройка. Для инициализации канала FITC, выберите CellSearch КТК в качестве Kit ID в разделе протоколы испытаний. Из этого меню выберите СТС Исследования, нажмите кнопку Изменить и установите время экспозиции по желанию. Рекомендуется, чтобы время экспозиции 1,0 сек быть не превышен, когда с использованием набора CSS СТС, так как это может увеличить проступание в других флуоресцентных каналов, используемых для идентификации СТС.

3. Адаптация Стандартной CSSProtocol для использования в Доклинические мыши моделей

** Адаптировано из Veridex Мыши / Rat CellCapture Kit (больше не коммерчески доступных)

1. Мышь крови Сбор и хранение

  1. До сбора крови, запускать ~ 30 мкл 0,5 М ЭДТА и обратно через 22 G иглу, в результате чего небольшое количество ЭДТА в ступице.
  2. Собрать минимум 50 мкл крови мышей от мышей, предварительно вводили опухолевые клетки человека через ортотопических, хвостовую вену или внутрисердечных маршрутов. Сбор крови из подкожной вены (для последовательного анализа КТК) или пункции сердца (для терминала анализа КТК). Удалить иглу и обойтись кровь в 1 мл ЭДТА Microtainer пробирку для сбора крови. Смешайте инверсией или мягко Флик трубки, чтобы предотвратить свертывание крови. Кровь могут быть обработаны немедленно или хранить при комнатной температуре в течение до 48 ч после добавлени равного объема CytoChex сотовой консерванта.

2. СТС Обогащение

  1. Удалить CSS реагенты из холодильника и дать им возможность нагреться до комнатной температуры перед использованием.
  2. Передача эквивалент 50 мкл цельной крови на 12 мм х 75 мм проточной цитометрии трубки. Добавить 500 мкл буфера для разведения к каждому образцу, запивая никакой крови, которая остается на сторонах трубы. При необходимости, в нескольких минутах спин центрифугиможет быть использован для сбора оставшуюся кровь.
  3. Аккуратно вихрь анти-EpCAM магнитную жидкость и добавить 25 мкл к каждой пробе, помещая наконечник пипетки непосредственно в образце. Добавить 25 мкл Захват Повышение реагента и вихря мягко смешать. Инкубируйте образцы при комнатной температуре в течение 15 мин.
  4. Поместите пробирки с образцами в магнит и инкубировать в течение 10 мин. В то время как пробирки с образцом по-прежнему в магните, используйте стеклянную пипетку тщательно аспирации остаточной жидкости, не касаясь стенки трубы рядом с магнитом и выбросить.

3. СТС Окрашивание

  1. Удалить пробирки с образцами от магнита и ресуспендируют в 50 мкл Нуклеиновой Кислоты-Dye, 50 мкл окрашивающего реагента, 1,5 мкл анти-CD45-мыши APC, 5,0 мкл анти-человеческим HLA-Alexa Fluor 488, и 100 мкл проницаемости Реагент. Для нескольких образцов, эти реагенты могут быть предварительно смешаны и 206,5 мкл смеси могут быть добавлены в каждую пробирку. Vortex мягко смешиватьи инкубировать в течение 20 мин при комнатной температуре в темноте.
  2. Добавить 500 мкл буфера для разведения, вихрь мягко, место пробирки с образцами в магнит, и инкубировать в течение 10 мин. В то время как пробирки с образцом по-прежнему в магните, используйте стеклянную пипетку тщательно аспирации остаточной жидкости, не касаясь стенки трубы рядом с магнитом и выбросить. Удалить пробирки с образцами от магнита и ресуспендируйте в 350 мкл буфера для разведения. Vortex мягко перемешать.

4. Магнитное устройство Загрузка

  1. Использование гель наливного наконечника, тщательно передавать весь объем от пробирку в патрон в магнитном устройстве. Начало в нижней части картриджа и медленно вывести кончик как образец обойтись.
  2. После того, как весь образец был передан, свободно колпачок картриджа магнитное устройство и нажмите на магнитное устройство с помощью руки или лабораторном столе, чтобы выпускать любые пузырьки, которые прилипли к краям картриджа, как описано в Sectioн 3.1 Standard СТС Перечень от пациента проб крови с помощью CSS.
  3. Поп пузырьки с помощью стерильной иглой 22 G путем захвата их между фаской и краем картриджа. После того, как все пузырьки были удалены, твердо ограничить картридж, заложить магнитное устройство плоским, и инкубировать в темноте в течение не менее 10 мин. Образцы должны быть отсканированы в течение 24 часов подготовки.

5. Сканирование разлученных вручную образцов на анализ инструмента

  1. Включите прибора исследования, инициализировать лампу, и осуществлять контроль качества и проверку системы, как описано в разделе 3.2 Стандартной СТС Перечень от пациента проб крови с использованием протокола CSS.
  2. Загрузите образец на анализ документа и выберите вкладку Настройка. Удалите все существующие данные по кнопке данных магнитного устройства, нажав кнопку Формат сэмплов. Включите FITC Канал Aй установить время экспозиции до 1,0 сек, как описано в разделе 2.2 КТК характеризации для пользовательских маркеров с помощью CSS.
  3. Перейдите на вкладку Test пациента и выберите Редактировать, чтобы ввести информацию образец. Выберите CellSearch КТК как комплект ID и СТС исследований как Протокол испытаний. Входной остальные необходимая информация, как указано в качестве звездочкой. Сохраните информацию образец и нажмите кнопку Пуск.

Результаты

Стандартный СТС Перечень Анализ

Чувствительность и специфичность CSS была хорошо документирована в литературе. Тем не менее, для проверки эквивалентную восстановление СТС, с шипами (1000 LNCaP раковые клетки предстательной железы человека) и unspiked образцы человеческой крови о?...

Обсуждение

Несмотря на развитие многих новых технологий СТС с момента введения CSS в 2004 году, этот метод остается единственным клинически одобрено технология на рынке сегодня, и поэтому он считается нынешний золотой стандарт для обнаружения и подсчета СТС. Эта рукопись показал, что хотя CSS имеет ст...

Раскрытие информации

Автор (ALA) получил финансирование, который был предоставлен Janssen онкологии, чья материнская компания Johnson & Johnson также владеет Janssen Diagnostics LLC, которая производит реагенты и инструменты, используемые в этой статье.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантами от Онтарио Института исследований рака (# 08NOV230), Канады фонда инноваций (# 13199), рака простаты Канады, Janssen онкологии Программы Лондонской регионального рака, и донорской поддержки от Джона и Донна Бристоль через Лондон медицинских наук Фонд (в ALA). НПВ поддерживается Фредерик Бантинг и Чарльз Лучший Канада Высшее стипендии докторской премии. ALA поддерживается CIHR Нью следователь премии и раннего премии исследователь из Онтарио Министерство исследований и инноваций.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
0.5 M EDTA
Anti-human CD44-FITCBD Pharmigen555478
Anti-human CD44-PEBD Pharmigen555479
Anti-human HLA-Alexa Fluor 488BioLegend311415
Anti-mouse CD45-APCeBioscience17-0451-82
Bond Primary Antibody DiluentLeicaAR9352
CellSave Preservative TubesVeridex952820 (20 pack) 79100005 (100 pack)
CellSearch CTC Control KitVeridex7900003
CellSearch CTC KitVeridex7900001
CellSearch CXC Control KitVeridex7900018RUO
CellSearch CXC KitVeridex7900017RUO
Instrument BufferVeridex7901003
Streck Cell Preservative (aka CytoChex)Streck213350
1 ml Syringe
10 ml Serological pipette
1,000 µl Pipette
1,000 µl Pipette tips
12 mm x 75 mm Flow tubes
200 µl Gel loading tips
200 µl Pipette
22 G Needle
5 3/4 in Disposible Pasteur pipetVWR14672-200
5 ml Serological pipette
Automated pipettor
Capillary Blood Collection Tube (EDTA)BD Microtainer365974
CellSearch Analyzer IIVeridex9555Includes magnests and verification cartirdges
CellSearch AutoPrep SystemVeridex9541
Centrifuge
MagCellect Magnet R&D SystemsMAG997
Small Latex BulbVWR82024-550
Vortex

Ссылки

  1. Siegel, R., Naishadham, D., Jemal, A. Cancer statistics. 63 (1), 11-30 (2013).
  2. Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nat. Rev. Cancer. 2 (8), 563-572 (2002).
  3. Pantel, K., Brakenhoff, R. H. Dissecting the metastatic cascade. Nat. Rev. Cancer. 4 (6), 448-456 (2004).
  4. Cristofanilli, M., Budd, G. T., et al. Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer. New Engl. J. Med. 351 (8), 781-791 (2004).
  5. De Bono, J. S., Scher, H. I., et al. Circulating tumor cells predict survival benefit from treatment in metastatic castration-resistant prostate cancer. Clin. Cancer Res. 14 (19), 6302-6309 (2008).
  6. Cohen, S. J., Ja Punt, C., et al. Prognostic significance of circulating tumor cells in patients with metastatic colorectal cancer. Ann. Oncol. 20 (7), 1223-1229 (2009).
  7. Hayes, D. F., Cristofanilli, M., et al. Circulating tumor cells at each follow-up time point during therapy of metastatic breast cancer patients predict progression-free and overall survival. Clin. Cancer Res. 12 (14), 4218-4224 (2006).
  8. Budd, G. T., Cristofanilli, M., et al. Circulating tumor cells versus imaging--predicting overall survival in metastatic breast cancer. Clin. Cancer Res. 12 (21), 6403-6409 (2006).
  9. Olmos, D., Arkenau, H. -. T., et al. Circulating tumour cell (CTC) counts as intermediate end points in castration-resistant prostate cancer (CRPC): a single-centre experience. Ann. Oncol. 20 (1), 27-33 (2009).
  10. De Bono, J. S., Scher, H. I., et al. Circulating tumor cells predict survival benefit from treatment in metastatic castration-resistant prostate cancer. Clin. Cancer Res. 14 (19), 6302-6309 (2008).
  11. Allan, A. L., Keeney, M. Circulating tumor cell analysis: technical and statistical considerations for application to the clinic. J. Oncol. 2010, 426218 (2010).
  12. Lowes, L. E., Goodale, D., Keeney, M., Allan, A. L. Image cytometry analysis of circulating tumor cells. Methods Cell Biol. 102, 261-290 (2011).
  13. Lianidou, E. S., Markou, A. Circulating tumor cells in breast cancer: detection systems, molecular characterization, and future challenges. Clin. Chem. 57 (9), 1242-1255 (2011).
  14. Alix-Panabières, C., Pantel, K. Circulating tumor cells: liquid biopsy of cancer. Clin. Chem. 59 (1), 110-118 (2013).
  15. Parkinson, D. R., Dracopoli, N., et al. Considerations in the development of circulating tumor cell technology for clinical use. J. Transl. Med. 10, 138 (2012).
  16. Lowes, L. E., Hedley, B. D., Keeney, M., Allan, A. L. User-defined protein marker assay development for characterization of circulating tumor cells using the CellSearch system. Cytomet. A. 81 (11), 983-995 (2012).
  17. Fehm, T., Müller, V., et al. HER2 status of circulating tumor cells in patients with metastatic breast cancer: a prospective, multicenter trial. Breast Cancer Res. Treat. 124 (2), 403-412 (2010).
  18. Liu, Y., Liu, Q., et al. Circulating tumor cells in HER2-positive metastatic breast cancer patients: a valuable prognostic and predictive biomarker. BMC Cancer. 13, 202 (2013).
  19. Slamon, D. J., Leyland-Jones, B., et al. Use of chemotherapy plus a monoclonal antibody against HER2 for metastatic breast cancer that overexpresses HER2. New Engl. J. Med. 344 (11), 783-792 (2001).
  20. Marty, M., Cognetti, F., et al. Randomized phase II trial of the efficacy and safety of trastuzumab combined with docetaxel in patients with human epidermal growth factor receptor 2-positive metastatic breast cancer administered as first-line treatment: the M77001 study group. J. Clin. Oncol. 23 (19), 4265-4274 (2005).
  21. Slamon, D., Eiermann, W., et al. Adjuvant trastuzumab in HER2-positive breast cancer. New Engl. J. Med. 365 (14), 1273-1283 (2011).
  22. Welch, D. R. Technical considerations for studying cancer metastasis in vivo. Clin. Exp. Metast. 15 (3), 272-306 (1997).
  23. Goodale, D., Phay, C., Postenka, C. O., Keeney, M., Allan, A. L. Characterization of tumor cell dissemination patterns in preclinical models of cancer metastasis using flow cytometry and laser scanning cytometry. Cytometry A. 75 (4), 344-355 (2009).
  24. Gorges, T. M., Tinhofer, I., et al. Circulating tumour cells escape from EpCAM-based detection due to epithelial-to-mesenchymal transition. BMC Cancer. 12, 178 (2012).
  25. Eliane, J. -. P., Repollet, M., et al. Monitoring serial changes in circulating human breast cancer cells in murine xenograft models. Cancer Res. 68 (14), 5529-5532 (2008).
  26. Flores, L. M., Kindelberger, D. W., et al. Improving the yield of circulating tumour cells facilitates molecular characterisation and recognition of discordant HER2 amplification in breast. 102 (10), 1495-1502 (2010).
  27. Sieuwerts, A. M., Kraan, J., et al. Molecular characterization of circulating tumor cells in large quantities of contaminating leukocytes by a multiplex real-time PCR. Breast Cancer Res. Treat. 118 (3), 455-468 (2009).
  28. Cohen, S. J., Ja Punt, C., et al. Relationship of circulating tumor cells to tumor response, progression-free survival, and overall survival in patients with metastatic colorectal cancer. J. Clin. Oncol. 26 (19), 3213-3221 (2008).
  29. Allard, W. J., Matera, J., et al. Tumor cells circulate in the peripheral blood of all major carcinomas but not in healthy subjects or patients with nonmalignant diseases. Clin. Cancer Res. 10 (20), 6897-6904 (2004).
  30. Thiery, J. P., Acloque, H., Huang, R. Y. J., Nieto, M. A. Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease. Cell. 139 (5), 871-890 (2009).
  31. Yang, J., Weinberg, R. A Epithelial-mesenchymal transition: at the crossroads of development and tumor metastasis. Dev. Cell. 14 (6), 818-829 (2008).
  32. Gradilone, A., Raimondi, C., et al. Circulating tumour cells lacking cytokeratin in breast cancer: the importance of being mesenchymal. J. Cell. Mol. Med. 15 (5), 1066-1070 (2011).
  33. Königsberg, R., Obermayr, E., et al. Detection of EpCAM positive and negative circulating tumor cells in metastatic breast cancer patients. Acta Oncol. 50 (5), 700-710 (2011).
  34. Kasimir-Bauer, S., Hoffmann, O., Wallwiener, D., Kimmig, R., Fehm, T. Expression of stem cell and epithelial-mesenchymal transition markers in primary breast cancer patients with circulating tumor cells. Breast Cancer Res. 14 (1), (2012).
  35. Mego, M., Mani, S. A., et al. Expression of epithelial-mesenchymal transition-inducing transcription factors in primary breast cancer: The effect of neoadjuvant therapy. Int. J. Cancer. 130 (4), 808-816 (2012).
  36. Yu, M., Bardia, A., et al. Circulating breast tumor cells exhibit dynamic changes in epithelial and mesenchymal composition. Science. 339 (6119), 580-584 (2013).
  37. Armstrong, A. J., Marengo, M. S., et al. Circulating tumor cells from patients with advanced prostate and breast cancer display both epithelial and mesenchymal markers. Mol. Cancer Res. 9 (8), 997-1007 (2011).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

84CTCsCellSearch

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены