Использование каспазы мультиплексирования Пробирной для определения апоптоза в гипоталамуса Cell Model

Резюме

Мультиплекс анализы могут обеспечить полезной информацией для основных клеточных механизмов и ликвидации отходов реагентов и ненужных повторяющихся экспериментов. Мы описываем здесь многозальный каспазы-3/7 анализа активности, используя флуоресцентные и люминесцентные методы, основанные на, чтобы определить жизнеспособность клеток в гипоталамо модели в пробирке следующей окислительного заражения пальмитиновой кислоты.

Аннотация

Возможность мультиплексирования анализов при исследовании сложных клеточных механизмов исключает необходимость в повторных экспериментах, обеспечивает внутренний контроль, и уменьшает отходы в затратах и ​​реагентов. Здесь мы опишем оптимизацию многозальный анализа для оценки апоптоза после пальмитиновой кислоты (ПА) вызов в гипоталамо модели в пробирке, используя как флуоресцентные и люминесцентные основе анализов для измерения жизнеспособных количество клеток и каспазы-3/7 деятельность в 96-а Формат микротитрационный планшет. После PA вызов, жизнеспособные клетки определяется резазурин основе флуоресцентного анализа. Каспазы-3/7 активность была затем определена с использованием люминогенных подложку, DevD и нормализованы к числу клеток. Это мультиплексирование анализ является полезным методом для определения изменения в активности каспазы следующее апоптоза стимулом, таким как вызов насыщенной жирной кислоты. Насыщенной жирной кислоты PA может увеличить гипоталамуса окислительного стресса и апоптоза, что указывает на потенциальную ImportaNCE анализов, таких как описаны здесь, что в изучения связи между насыщенных жирных кислот и функции нейронов.

Введение

Диета, богатая насыщенными жирными кислотами, такими как пальмитиновая кислота (PA) были связаны с ожирением и другими сопутствующими заболеваниями, в том числе сердечно-сосудистых заболеваний и диабета ^{1, 2.} Жирная диета также было показано увеличение окислительного стресса, апоптоз и дегенерации нейронов в гипоталамусе, важным регулятором аппетита и энергии расходов ^3-7. Понимание механизма, через который экспозиции высоким содержанием жиров индуцирует гипоталамуса нарушение регуляции Таким образом, важно для развития фармакологических методов лечения ожирения. Тем не менее, клеточные механизмы, через которые диетического жира влияет функции нейронов остаются неясными. Более глубокое понимание того, как жиры, такие как ПА может вызвать начало гипоталамуса апоптоза является необходимым первым шагом на пути к этой цели. Цель этой статьи заключается в описании многозальный анализа для тестирования в пробирке нейронов ответ на воздействие Звуковая, разработанный для использования в исследованиях чypothalamic нейродегенерация. Мы предоставляем подробное описание в пробирке 96-а формате мультиплекса анализа для измерения каспазы 3/7 активность на общее количество клеток в дифференцированного увековечена взрослых мышей гипоталамо клеточной линии (назначенного A12) после окислительного заражения PA ^8.

Вкратце, жизнеспособность клеток определяется следующее PA вызов через резазурин основе анализа. Ресазурин является проницаемой соединение клеток, который подвергается ферментативной снижение метаболически активных клеток, процесс полагают, происходит через митохондрии ^9. Жизнеспособные клетки непрерывно преобразовывать резазурин в резоруфином, производя флуоресцентный сигнал, пропорциональный количеству жизнеспособных клеток. Каспазы-3/7 активность затем анализировали с использованием DEVD основе lumogenic анализа. DEVD является аминокислотная последовательность (Asp-Glu-Val-Asp) расщепляется каспазы-3. Когда эта последовательность соединен с lumogenic вещества, при активации внутриклеточного каспазы-3/7 и последующим расщеплениемиз DEVD подложки, люминесцентный продукт выпущен. Эта реакция пропорциональна активности каспаз и, таким образом, к индукции апоптоза. Как мертвые клетки не могут производить каспазы, каспазы-3/7 деятельность по своей природе переходного; Поэтому анализ должен быть завершен в период с 30 мин до 4 ч после заражения, в зависимости от эффективности клеточной стресс. Жизнеспособность клеток обратно пропорциональна каспазы-3/7 активностью и могут быть использованы для определения механизмов гибели клеток. Например, этот метод ранее был использован, чтобы показать, что предварительная обработка с пептидного гормона орексина уменьшает апоптоз в клетках гипоталамуса, зараженных перекиси водорода, предполагая, что механизмы страдают от этого лечения играют важную роль в защите против окислительного повреждения ^10. Важно отметить, эти анализы клеточной линии и ткани зависит, как они опираются на митохондриальной активности уменьшить реагентов для анализа. Этот протокол был оптимизирован для взрослых мышей гипоталамо (A12) клеток; ОднакоСпособы, описанные может быть изменена, чтобы соответствовать в пределах подобного исследования.

Мультиплексирования анализы от одного культуры и обеспечивает преимущество по сравнению с традиционным методом выполнения отдельных анализов по нескольким причинам. В дополнение к экономии времени, образцы клеток и культуры реагенты, мультиплексирования анализы также могут предоставить знания выживания и гибели клеток, обеспечить внутренний контроль, и устранить необходимость в повторных экспериментах ^{11, 12.}

Альтернативные методы полагались на Вестерн-блоттинга или ИФА, которые надежные анализы, но это дорого и отнимает много времени (1-2 дней), особенно при использовании формата 96-луночного. Без учета времени, необходимого для культуры клеток для мультиплексирования анализа, общее время составляет менее 3 ч. Хотя этот протокол был оптимизирован для использования с A12 клеток, он может быть изменен для использования в других моделях, сохраняя при этом в виду факторы, которые могут повлиять на целостность клеток. Удерживатьдобыча если этот протокол будет работать на серии экспериментов зависит от от количества образцов или экспериментальных условиях и о планируемых последующих экспериментах.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Покрытие и обслуживание культуре клеток

1. Теплый Игла в модификации Дульбекко (DMEM), питательные среды (DMEM + 10% FBS + 1% пенициллина / стрептомицина / Неомицин) до 37 ° C.
2. Получить запас замороженных A12 клеток от -80 ° С.
3. Быстро разморозить клетки в 37 ° С водяной бане; После оттаивания мягко пипеток клетки перенести на 75 см ² вентилируемой колбу культуры и добавить 10 мл культуральной среды.
4. Выдержите колбу на ночь в 5% CO ₂ инкубаторе при 37 ° С Аспирируйте СМИ после 24 часов и заменить свежей средой. Продолжить выращивания клеток до 70-80% слияния не будет получено (рост 2-3 дня).

2. Подсчет и Покрытие Клетки

1. Теплый DMEM и 1x-трипсин-ЭДТА до 37 ° C.
2. Аспирируйте средств массовой информации из клеток и мыть два раза стерильной фосфатным буферным раствором (PBS).
3. Добавить 500 мкл раствора трипсина и инкубировали при 37 ° С в течение 2-5 мин.
4. ОтделятьКлетки из колбы с помощью скребка и приостановить клеток в 5 мл среды. Pass клетки через сито и пройти через ячейки фильтра в чистый 50 мл трубки. Возможно, потребуется пройти клетки через ситечко более одного раза, но не повторять более трех раз.
5. Граф клеток с помощью гемоцитометра, чтобы определить количество клеток в культуре на семена 6000 клеток / лунку в 96-луночный прозрачным дном черной или белой стеной пластины в конечном объеме 100 мкл среды. Инкубируйте пластины в 5% CO ₂ при 37 ° С в течение 24 часов.

3. Определение жизнеспособность клеток и каспазы-3/7 активность

1. Передача PA в стерильную стекл нную пробирку емкостью 5 мл и растворить в 100% диметилсульфоксиде (ДМСО). Развести маточного раствора PA 1:10 в ДМСО и добавить его в предварительно нагретой DMEM, чтобы получить конечную рабочую концентрации 0,1 мМ ПА. Для контроля СМИ, добавить такую ​​же концентрацию ДМСО, которое добавляется к среде, содержащей PA.
2. Извлеките носитель в каждую лунку и заменить 50 мкл СМИ + / -ПА. Инкубировать в течение 2 часов в 5% CO ₂ при 37 ° С Затем добавляют 5 мкл резазурин реагента и инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре.
3. Использование многомодовых планшетного, запись флуоресценции (560 _ЕХ / 590 _EM) для измерения жизнеспособности клеток. Результаты представлены в виде относительных единицах флуоресценции (РФС).
4. С этой же пластине, добавляют 55 мкл реагента каспазы и инкубируют при комнатной температуре в течение 2 часов.
5. Снова используя планшетного, запись свечение для измерения каспазы-3/7 деятельность. Результаты представлены в виде относительных единицах люминесценции (RLU), с люминесценции прямо пропорциональной каспазы-3/7 деятельности.
6. Для нормализации каспазы-3/7 деятельность по количеству клеток, разделите клеток жизнеспособность (РФС) по каспазы-3/7 деятельности (RLU).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Протокол выше описывает результаты в мультиплексирования двух отдельных анализов, чтобы определить механизмы клеточной гибели. Рисунок 1 показывает обзор протокола для определения жизнеспособности клеток и каспазы-3/7 деятельность. Каспазы активность была значительно увели...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Мультиплексный анализ является широко признанным методом, который был использован учеными во многих приложениях, таких как ПЦР, микрочипов иммунологического и других белковых основе методов обнаружения ^{13, 14.} В последнее время мультиплексирования анализы становятся все более и?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adult Mouse Hypothalamus Cell Line mHypoA-1/2	Cellutions Biosystems Inc.	CLU172
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium	Invitrogen	10313-039
Fetal Bovine Serum	PAA Labs	A15-751
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15070-063
Palmitic Acid	Sigma-Aldrich	P0500
Dimethy Sulfoxide	Sigma-Aldrich	D2650
PrestoBlue Cell Viability Reagent	Invitrogen	A13262
Caspase-Glo 3/7 Assay Systems	Promega	G8091
96 W Optical Bottom Plate, Black Polystyrene, Cell Culture Treated, with lid, Sterile	Thermo Fisher Scientific	165305
SpectraMax M5 Multi-Mode Microplate	Molecular Devices