L'uso di una caspasi Multiplexing test per determinare apoptosi in un modello cellulare ipotalamica

Riepilogo

Saggi Multiplex possono fornire informazioni utile per i meccanismi cellulari di base ed eliminare gli sprechi di reagenti ed esperimenti ripetitivi inutili. Descriviamo qui un multiplex caspasi-3/7 saggio di attività, utilizzando metodi fluorescenti e si basano luminescenti-, per determinare la vitalità cellulare in un modello in vitro ipotalamico seguente sfida ossidativa con acido palmitico.

Abstract

La capacità di multiplexing saggi in studi sui meccanismi cellulari complesse elimina la necessità di esperimenti ripetitivi, fornisce controlli interni, e diminuisce rifiuti nei costi e reagenti. Qui si descrive l'ottimizzazione di un saggio multiplex per valutare l'apoptosi in seguito a un acido palmitico (PA) sfida in un modello ipotalamica in vitro, utilizzando sia fluorescenti e luminescenti saggi basati misurare conteggio delle cellule vitali e caspasi-3/7 attività in un ben 96 formato micropiastra. Seguendo PA sfida, cellule vitali sono stati determinati da un test di fluorescenza basato resazurin-. Caspasi-3/7 attività è stata poi determinata con un substrato luminogenic, DEVD e normalizzato al numero di cellulare. Questo saggio multiplexing è una tecnica utile per determinare cambiamento nell'attività caspasi seguente uno stimolo apoptotico, come sfida acido grasso saturo. L'acido grasso saturo PA può aumentare ipotalamica stress ossidativo e apoptosi, indicando la possibilità ImportaSNO di saggi come quello descritto qui in studio del rapporto tra acidi grassi saturi e funzione neuronale.

Introduzione

Le diete ricche di acidi grassi saturi come l'acido palmitico (PA) sono state legate a obesità e altre patologie concomitanti, tra cui le malattie cardiovascolari e il diabete ^{1, 2.} Diete ricche di grassi hanno anche dimostrato di aumentare lo stress ossidativo, apoptosi, e la degenerazione neuronale nell'ipotalamo, un importante regolatore di appetito e il dispendio energetico ^3-7. Comprendere il meccanismo attraverso il quale l'esposizione dieta ricca di grassi induce disregolazione ipotalamo è quindi importante per lo sviluppo di trattamenti farmacologici per l'obesità. Tuttavia, i meccanismi cellulari attraverso i quali i grassi alimentari colpisce la funzione neuronale rimangono poco chiari. Una migliore comprensione di come grassi come PA potrebbero innescare insorgenza di vie apoptotiche ipotalamici è necessario un primo passo verso questo obiettivo. L'obiettivo di questo articolo è quello di descrivere un saggio multiplex per la sperimentazione in vitro di risposta neuronale all'esposizione PA, sviluppato per l'uso in studi di hneurodegenerazione ypothalamic. Forniamo una descrizione dettagliata di un formato a 96 pozzetti test multiplex in vitro per la misurazione della caspasi 3/7 attività per numero totale di celle in una linea differenziata immortalato topo adulto ipotalamico cellulare (designato A12) dopo la sfida ossidativo con PA ^8.

In breve, la vitalità cellulare è determinata a seguito PA sfida con un saggio resazurina based. Resazurin è un composto permeabile cella subisce una riduzione enzimatica in cellule metabolicamente attive, un processo pensato avvenga tramite mitocondri ^9. Cellule vitali continuamente convertono resazurin a resorufina, producendo un segnale fluorescente proporzionale al numero di cellule vitali. L'attività della caspasi-3/7 viene poi analizzata utilizzando un saggio basato lumogenic-DEVD. DEVD è una sequenza amminoacidica (Asp-Glu-Val-Asp) spaccati da caspasi-3. Quando questa sequenza è accoppiato ad una sostanza lumogenic, previa attivazione di intracellulare caspasi-3/7 e successiva scissionedi substrato DEVD, il prodotto luminescente viene rilasciato. Questa reazione è proporzionale all'attività caspasi e quindi l'induzione di apoptosi. Poiché le cellule morte non possono produrre caspasi, caspasi-3/7 attività è per sua natura transitoria; pertanto, l'analisi deve essere completata tra 30 minuti e 4 ore post-sfida, a seconda dell'efficacia delle stressor cellulare. La vitalità cellulare è inversamente proporzionale all'attività caspasi-3/7 e può essere utilizzato per determinare meccanismi della morte cellulare. Ad esempio, questo metodo è già stata utilizzata per dimostrare che il pretrattamento con l'ormone peptidico orexina riduce l'apoptosi in cellule ipotalamiche stimolate con perossido di idrogeno, suggerendo che meccanismi interessate da questo trattamento sono importanti per proteggere dai danni ossidativi ^10. È importante notare questi saggi sono linea-e cellule tessuto-dipendente, in quanto si basano su attività mitocondriale per ridurre i reagenti del saggio. Questo protocollo è stato ottimizzato per topo adulto ipotalamico (A12), le cellule; tuttavia,metodi descritti possono essere modificate per adattarsi nell'ambito di ricerche simili.

Multiplexing saggi di un'unica cultura fornisce anche un vantaggio rispetto al metodo tradizionale di eseguire dosaggi individuali per diversi motivi. Oltre al risparmio di tempo, campioni di cellule e reagenti cultura, saggi di multiplazione possono anche fornire conoscenze della sopravvivenza cellulare e morte, fornire controlli interni, ed eliminare la necessità di esperimenti ripetitivi ^{11, 12.}

Metodi alternativi hanno invocato macchie o ELISA occidentali, che sono test affidabili, ma sono costosi e che richiede tempo (1-2 giorni), soprattutto quando si utilizza un formato a 96 pozzetti. Escludendo il tempo necessario per le cellule di coltura per il saggio multiplexing, il tempo totale è meno di 3 ore. Mentre questo protocollo è stato ottimizzato per l'uso con A12 cellule, può essere modificato per l'utilizzo in altri modelli tenendo a mente fattori che possono influenzare l'integrità delle cellule. Scoraggiareestrazione se questo protocollo funzionerebbe per una serie di esperimenti dipende dal numero di campioni o condizioni sperimentali e su esperimenti valle pianificati.

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Protocollo

1. Placcatura e la conservazione della cultura cellulare

1. Scaldano Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) terreni di coltura (DMEM + 10% FBS + 1% di penicillina / streptomicina / neomicina) a 37 ° C.
2. Ottenere magazzino di surgelati A12 cellule da -80 ° C.
3. Rapidamente scongelare le cellule in 37 ° C a bagnomaria; una volta scongelato, delicatamente le cellule pipetta di trasferire a un pallone di coltura ventilato 75 centimetri ² e aggiungere 10 ml di coltura.
4. Incubare pallone pernottamento in 5% CO ₂ incubatore a 37 ° C. Aspirare il terreno dopo 24 ore e sostituirlo con mezzi freschi. Continuare a crescere le cellule fino ad ottenere il 70-80% di confluenza (2-3 giorni di crescita).

2. Conteggio e placcatura Celle

1. DMEM Caldo e soluzione 1x-tripsina-EDTA a 37 ° C.
2. Aspirare supporti dalle cellule e lavare due volte con fosfato sterile salina tamponata (PBS).
3. Aggiungere 500 microlitri di soluzione di tripsina e incubare a 37 ° C per 2-5 min.
4. Distaccarecellule da matraccio con una spatola e sospendere le cellule in 5 ml di media. Passare cellule attraverso il filtro e passare attraverso il filtro delle cellule in una provetta pulita da 50 ml. Potrebbe essere necessario passare cellule attraverso il filtro più di una volta, ma non ripetere più di tre volte.
5. Contare le cellule utilizzando un emocitometro per determinare quantità di cellule di coltura per seminare 6.000 cellule / pozzetto in 96 pozzetti trasparente fondo nero o bianco piastra murato in un volume finale di 100 microlitri di media. Incubare la piastra in 5% CO ₂ a 37 ° C per 24 ore.

3. Determinare la vitalità delle cellule e caspasi-3/7 Attività

1. Trasferire PA ad una sterile 5 ml fiala di vetro e solubilizzare in 100% dimetilsolfossido (DMSO). Diluire soluzione stock PA 1:10 in DMSO e aggiungerlo al preriscaldata DMEM per ottenere una concentrazione finale di lavoro di 0.1 PA mm. Per i mezzi di controllo, aggiungere la stessa concentrazione di DMSO che viene aggiunto a supporti contenenti PA.
2. Rimuovere il supporto in ciascun pozzetto e sostituire con 50 mezzi microlitri + / -PA. Incubare la piastra per 2 h in 5% CO ₂ a 37 ° C. Aggiungere quindi 5 ml resazurina reagenti e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.
3. Utilizzando un lettore di micropiastre multimodale, record di fluorescenza (560 _EX / 590 _EM) per misurare la vitalità cellulare. I risultati sono presentati come unità di fluorescenza relativa (RFU).
4. Per la stessa piastra, aggiungere 55 ml di reagente caspasi e incubare a temperatura ambiente per 2 ore.
5. Anche in questo caso utilizzando il lettore per micropiastre, record di luminescenza per misurare l'attività della caspasi-3/7. I risultati sono presentati come unità di luminescenza relativa (RLU), con luminescenza direttamente proporzionale alla caspasi-3/7 attività.
6. Per normalizzare l'attività della caspasi-3/7 per il conteggio delle cellule, dividere vitalità cellulare (RFU) da caspasi-3/7 attività (RLU).

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Risultati

Il protocollo sopra descritto comporta multiplazione due test separati per determinare meccanismi della morte cellulare. Figura 1 mostra una panoramica del protocollo per determinare la vitalità cellulare e caspasi-3/7 attività. Attività di caspasi era significativamente aumentata in cellule stimolate con PA dopo 2 ore di incubazione (Figura 2A e Tabella 1). Perdita di integrità della membrana cellulare è un cambiamento morfologico associata con l'induzione di ...

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Discussione

Il saggio multiplex è una tecnica ben accettato che è stato usato dagli scienziati in numerose applicazioni come PCR, microarrays immunodetezione e altri metodi di rilevamento a base di proteine ^{​​13, 14.} Recentemente, saggi multiplexing sono diventati sempre più utilizzato in vitro esperimenti basati piatto-in e sono stati convalidati come un metodo accurato per valutare la citotossicità e la vitalità ^12. Nel protocollo di cui sopra, abbiamo dimostrato l'efficacia di...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adult Mouse Hypothalamus Cell Line mHypoA-1/2	Cellutions Biosystems Inc.	CLU172
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium	Invitrogen	10313-039
Fetal Bovine Serum	PAA Labs	A15-751
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15070-063
Palmitic Acid	Sigma-Aldrich	P0500
Dimethy Sulfoxide	Sigma-Aldrich	D2650
PrestoBlue Cell Viability Reagent	Invitrogen	A13262
Caspase-Glo 3/7 Assay Systems	Promega	G8091
96 W Optical Bottom Plate, Black Polystyrene, Cell Culture Treated, with lid, Sterile	Thermo Fisher Scientific	165305
SpectraMax M5 Multi-Mode Microplate	Molecular Devices