Мышиной модели ишемии миокарда-реперфузии через перевязки левой передней нисходящей артерии

Резюме

Введем хирургический метод, чтобы побудить экспериментальной ишемии / реперфузии (I / R) травмы имитировать инфаркт миокарда (ИМ) в мышиных моделях, что позволяет для большей ясности в позиционировании перевязки на левой передней нисходящей артерии (ПНА), чтобы увеличить воспроизводимость из MI экспериментов на мышах.

Аннотация

Острая или хроническая инфаркта миокарда (ИМ) являются сердечно-сосудистые события, приводящие к высокой заболеваемости и смертности. Установление патологические механизмы на работе в течение ИМ и разработке эффективных терапевтических подходов требует методологии воспроизводимо имитировать клиническую заболеваемость и отражают патофизиологические изменения, связанные с ИМ. Здесь мы описываем хирургический метод, чтобы вызвать инфаркт миокарда на мышах, который можно использовать для кратковременного ишемии-реперфузии (I / R) травмы, а также постоянного труб. Основным преимуществом этого метода является то, чтобы облегчить расположение левой передней нисходящей артерии (LAD), чтобы обеспечить точную лигированием этой артерии, чтобы вызвать ишемию в левом желудочке сердца мыши. Точное позиционирование из лигатуры на LAD увеличивает воспроизводимость размера инфаркта и, таким образом, дает более надежные результаты. Повышенная точность в размещении лигатуры улучшит стандартные хирургические подходы для моделирования ИМ у мышей, тГУС уменьшения количества экспериментальных животных, необходимых для статистически соответствующих исследований и улучшения нашего понимания механизмов, производящих сердечной дисфункции следующие ИМ. Эта модель мыши ИМ также полезен для доклинических испытаний лечения, направленных на повреждение миокарда следующие ИМ.

Введение

Животные модели инфаркта миокарда (ИМ) играют важную роль в исследовании комплекса патофизиологии ишемической болезни сердца ^1. Ишемии (E / R) травма одной из основных причин повреждения миокарда образующихся при ИМ. Начальное повреждение ишемии получают путем окклюзии коронарной циркуляции может быть минимизировано у больных ИМ с использованием ангиопластики, чтобы восстановить перфузию своевременно. В то время как это вмешательство привело к значительному сокращению количества смертельных случаев из-за острого ИМ, восстановления кровотока в ишемических области приводит в я / R травмы, что приводит к смерти кардиомиоцитов. Эта потеря массы миокарда способствует снижение сердечного выброса и прогрессирование к сердечной недостаточности. Таким образом, изучение механизмов, которые приводят к кардиомиоцитов смерти от I / R травмы является важным направление исследований в сердечно-сосудистых исследований. Хирургическое коронарной перевязки является полезным экспериментальная методика, чтобы побудить модели ИМ в различных видах животных, includiнг крысиные, собака и свинья. Публикации в разных лабораториях ввели различные методы создания мышей сердца модели ввода / R травмы ^2,3. Для того чтобы получить представление о этих механизмов мы должны иметь доступ к надежным животных моделях, которые могут воспроизводить несколько аспектов М.И. патологии. Разработка таких моделей также имеет важное значение для проверки терапевтические подходы для лечения инфаркта миокарда и связанных с ними я / R травмы.

Большинство имеющихся в настоящее время хирургических методов для имитации ИМ у экспериментальных животных включают хирургическую рассечение в грудную полость, чтобы разоблачить левой передней нисходящей артерии (LAD), который затем поглощается лигатуры для определенного периода времени с получением ишемического события. Тогда что вязь могут быть удалены, чтобы обеспечить реперфузии зоне ишемии и генерации I / R травмы. Одним из основных ограничений этих подходов в том, что положение литературы по ЛАД не всегда точно воспроизведены, которыеможет привести к изменению в тяжести ИМ, вызванного этим подходом. Большинство имеющиеся методы только в общих чертах описал приблизительное расположение ЛАД в передней стенке сердца. Как ветвление и направление ЛАД могут меняться в отдельные животных расположение не всегда фиксируется и может быть легко спутать ^4,5, что привело к возможных осложнений во время операции ^6. Последствия Неправильное размещение лигатуры может работать от изменчивости размеров инфаркта, индуцированного в левом желудочке, чтобы полностью ущерба специфичность модели. Здесь мы представляем модифицированного метода для инфаркта I / R и постоянного перевязки у мышей, что повышает точность размещения лигатуры на ЛАД. Применяя конкретные подходы для начального разреза и внутреннего вскрытия, а также использования манипуляций поднять предсердий, чтобы лучше оценить ПНА и месте, где он выходит из аорты. Установлениеположение на LAD и его происхождения дает возможность перевязывать ЛАД воспроизводимым способом. Эта модель инфаркта I / R и постоянного лигирования не только уменьшает вариацию размера инфаркта после операции, он также может снизить частоту кровотечения во время операции.

протокол

Этот протокол животных был утвержден и находится в соответствии с руководящими принципами и правилами, установленными в уходу и использованию животных комитета институционального (IACUC) по крайней Университете штата Огайо. Все политики, разработанные на местном IACUC находятся в соответствии с Руководство экспериментов на животных, разработанной Управлением лабораторных животных благосостояния на Национальных Институтов Здоровья.

1. Анестезия и интубации трахеи

1. Перед использованием Автоклав все инструменты и хирургические принадлежности. Носите стерильные, одноразового использования хирургических перчаток на протяжении всей процедуры. Поддержание стерильное поле в течение всей процедуры. Использование стерильной драпировки предлагается, но не показано на видео, чтобы позволить для лучшей визуализации анатомических ориентиров на мышь.
2. Место каждого мышь по отдельности в индукционной камере и обеспечить обезболивание не с использованием 5% изофлуран и кислород с расходом 0,4 л / мин до тех пор, потери рефлекса, а затем поддерживать тыс.е животное с 2% изофлуран в 100% кислорода с потоком 0,4 л / мин с помощью головная часть трубы, соединенного с устройством анестезии, пока не эндотрахеальной трубки на месте. Изофлюран наркозный аппарат используется должны быть надлежащим образом вентилируется и оснащены угольными фильтрами для минимизации воздействия хирурга к изофлурановой паров во время процедуры. Головная часть отметить, но не показано на видео, чтобы позволить для визуализации манипуляций интубировать мыши.
3. Бритье грудь животного с волоса животных клипер в другом месте, чем в хирургии платформы, чтобы избежать загрязнения расположения хирургии.
4. Наведите в положении лежа на спине на хирургии платформы для последующего интубации. Простой маленький пенополистирол платформа может служить в качестве операционной платформы. Накройте платформу с предварительно стерилизованной драпировка, чтобы обеспечить стерильную поверхность. Поместите грелку между платформой и драпировка для поддержания температуры тела мышей в surgicaПроцедуры л.
5. Прикрепите длину 2-0 шелковых шва не менее 10 см на платформу с лентой, а затем цикл шва вокруг передних верхних резцов. Установите конус в непосредственной близости (2-3 см) на краю платформы на нос мыши. Потяните Тугой мыши и закрепите его на платформу за хвост с помощью ленты.
6. Закрепите ножки в стороны тела с прядями ленты. Важно, чтобы передние конечности не чрезмерную нагрузку, так как это может нарушить дыхание.
7. Подготовьте бритые хирургические сайты с Бетадин и алкоголя до шеи и груди разрезы делаются.
8. Поместите платформу с главой мыши указывая в направлении оператора. Отрежьте 0,5 см средний шейки разрез кожи. Отделите доли щитовидной железы в их перешейке подвергать sternohyoideus мышцы, где трахея можно увидеть под мышцу.
9. Удалите внутреннюю иглу 18 калибра троакара, чтобы он мог быть использован в качестве intubAtion трубки. Острие иглы может служить в качестве держателя и 1 см внешней трубки может служить интубационной трубки.
10. Держите язык мыши с изогнутыми щипцами в одной руке и немного сдвиньте его вверх. Просмотр трахею через цервикальный разрез кожи. Используйте другую руку, чтобы аккуратно вставьте интубации трубку, пока трубка не видно внутри трахеи.
11. Как только трубка находится в трахеи, перемещать изогнутых щипцов в другой стороны по отношению к трубе и быстро удалить внутреннюю иглу. Если трубка не может быть вставлен в трахеи, трубка должна быть вытащен, чтобы избежать получения респираторных заболеваний. Важно отметить кончик трубки, когда она близка к горлу во избежание вставки трубки в пищевод вместо трахеи.

2. Вентиляция и Фиксация

1. Обеспечить искусственной вентиляции с животным респиратор вентиляции 2% изофлуран в кислороде с расходом 0,4 л / мин. Используйте модифицированный Y-шаPE Разъемы для подключения интубации трубки с вентилятором. Правильная установка тубус может быть подтверждено судя симметричный расширения грудной клетки.
2. Установите дыхательный объем при 260 мкл / инсульта и вентиляции скоростью 130 ударов в минуту, которые могут быть скорректированы, чтобы вес тела конкретного мыши, если необходимо.
3. Удалите ленту на хвосте и превратить мышь осторожно, чтобы поместить его в правом боковом положении пролежни для последующего хирургического вмешательства. Используйте ленту, чтобы закрепить хвост и ноги на платформу снова.
4. Вставьте ректальный зонд для контроля температуры тела и регулировать потепления площадку для поддержания температуры около 37 ° С.
5. Закрепите зонд к платформе с помощью липкой ленты. Введите бупивакаина подкожно в месте разреза, чтобы обезболить область до надрез.

3. Торакотомия

1. Сделать косой разрез длиной приблизительно 1 см на сайте 2 мм от левойгрудины границы в направлении, где левой передней ножки отвечает тело (примерно 1-2 мм ниже, где присоединиться ног и тела). Поверхностный грудной вены близко этого сайта и разрез следует так, чтобы боковой конец разреза идет до, но не нарезать, вены.
2. Вырезать хотя грудной мышцы, чтобы разоблачить ребра внизу. На этом этапе избежать случайных травм судна. Если же возникает кровотечение, использовать ватные аппликаторы, чтобы остановить любое кровотечение, прежде чем приступить к следующему шагу ^7.
3. Визуализация ребра, и раздувания легких через тонкую и полупрозрачного грудной стенки. Откройте грудную полость с помощью хирургических ножниц сделать 6-8 мм разрез в третьем межреберье. Этот разрез должен быть не менее 2 мм от края грудины, где внутренняя грудная артерия находится. Повреждение артерии будет производить сильное кровотечение, которое трудно контролировать.
4. Вставьте предварительно стерилизованные домашние ретракторы грудь десятичногоо разрез и осторожно потяните назад, чтобы открыть разрез таким образом, чтобы это около 8-10 мм в ширину, стараясь при этом, чтобы избежать легких. В ретракторы должны быть прикреплены к хирургической платформе с булавками.
5. В этот момент сердце должно быть видно, однако, по-прежнему легких покрывать часть сердца. Поднимите перикарда мягко с изогнутыми щипцами, вытащить его на части, и сдвиньте ткани позади преднатяжителями. Во время этой манипуляции легких поднимет и от сердца.

4. Позиционирование ЛАД

1. Найдите LAD на поверхности сердца через микроскопом рассечение. ЛАД работает по середине стенки сердца от около верхушки сердца вниз через левый желудочек. ЛАД появляется ярко-красный и будет пульсирует сильно. Жила здесь иногда ошибочно принимают за ПНА, однако надлежащее освещение может помочь различать два судна. Если освещение слишком яркое, это может быть трудно оценить цветразличия между судами.
2. Используйте стерильный ватный тампон фрагмент с диаметром приблизительно 1-2 мм, чтобы подготовить LAD для перевязки. Поместите хлопок между левого предсердия и левого желудочка, которая поднимет в левое предсердие и помочь разоблачить LAD и разъяснить свою позицию. Если ЛАД не могут быть расположены, фрагмент можно двигать дальше в так левое предсердие поднимается еще выше, чтобы выявить аорту где ЛАД берет свое начало.

5. ЛАД Лигирование

1. Идеальное расположение для лигатуры составляет примерно 2 мм ниже оконечности левого предсердия. Легочный ствол может быть использован в качестве маркера, чтобы помочь определить левого предсердия. С другой стороны, позиция перевязки можно представить в виде точки 1-2 мм от разветвления левой огибающей. С помощью изогнутых щипцов осторожно оказывать давление на участке, непосредственно ниже намеченной точки для лигирования. Это позволит сделать его легче увидеть артерию, а также поможет держать сердце на местеи упростить связывая лигатуры. Не надавливайте с пинцетом более 5 секунд за один раз и избежать сжатия сердца, которые могут изменить накачки.
2. Используйте коническую иглу пройти 6-0 шелковых шва под ЛАД, наблюдая с микроскопом рассекает. Вставьте иглу под артерии с точностью, как игла войдет левого желудочка камеру, если расположены слишком глубоко или повредить ЛАД если игла слишком мелко. Если ЛАД травмирован удалить иглу и шовный отрока контролировать кровотечение, поэтому если кровотечение не может управляться предпочтительно усыпить животное.
3. Сделайте свободную двойной узел с шва, оставляя 2-3 мм петлю диаметром, через который 2-3 мм длиной кусок ПЭ-10 трубки помещается ^8.
4. Затянуть петлю вокруг артерии и трубки затем закрепите петлю, привязав один дополнительный скользящий узел, стараясь не повредить стенки желудочка. Для постоянного перевязки, непосредственно связать отрока соузел ^9. Подтвердите окклюзии ПНА путем проверки появления более бледный цвет в передней стенке ЛЖ, которая должна появиться в течение нескольких секунд после перевязки.
5. Снимите втягивающим и закрыть рану временно зажимая кожу вместе с бульдогом зажима. Продолжительность времени, ишемия сохраняется зависит от конструкции эксперимента, но часто 20, 30, 45 или 60 мин. Мышь остается на искусственной вентиляции легких в течение всего срока окклюзии LAD артерии.

6. Реперфузия

1. После периода ишемии удалить бульдог клип и вставить грудные втягивающие подвергать лигатуры. Развязать узел и удалите ПЭ-10 трубки. Подтвердите реперфузию, наблюдая за возвращение розово-красного цвета передней стенки ЛЖ после 15-20 сек.
2. Оставьте шов на месте, если 2% хлорида трифенилфосфат тетразолий (ТТК) и голубой окрашивание будет выполняться после реперфузии. Если окрашивание не надо, шов может бэ удалены.
3. Время реперфузии будет зависеть от конструкции эксперимента, как правило, охватывает от 1 часа до 24 часов.

7. Грудь Закрытие и послеоперационный уход

1. Закройте грудную полость от шитья закрыть разрез в ^3-м межреберье с 4-0 шелковой нити. Важно, что легкие ясны шовного материала и не попасть в ловушку, как ^3-й и ^4-й ребра пришиты вместе. Хотя связывая шовные узлов полезно немного надавите на грудь с держателем иглы, чтобы свести к минимуму любые комнатного воздуха, которые могут быть в ловушке в грудной полости.
2. Закройте все слои мышц с непрерывными швами с использованием 4-0 шелк. Использование нейлоновые швы, чтобы закрыть оболочку с непрерывным швом. Кроме того, кожа может быть закрыт с прерванного шва.
3. Когда ушивание завершения прекращении поток изофлураном а кислород продолжает поступать. Как только мышь движется свои усы или хвост его, разделительнаяг начать зарабатывать попытки дышать самостоятельно. Отключив мышь от вентилятора с интубации трубки до сих пор хранится в трахее.
4. Соблюдайте животное тщательно, пока мышь не возобновит нормальную структуру дыхания, а затем экстубации мышь. Трубка должна быть удалена медленно, чтобы избежать аспирации полости рта выделениями.
5. Подтвердите мышь не в любом дыхательной недостаточности, наблюдая его на другой 3-5 мин, прежде чем вернуть в клетку. Если признаки обезвоживания наблюдается после операции, обеспечивают до 0,5 мл стерильного физиологического раствора путем внутрибрюшинной инъекции.
6. Для послеоперационного обезболивания, администрировать опиоидный анальгетик (бупренорфин, 0,1 мг / кг) подкожно (SC), прежде чем животное амбулаторно, а затем предоставить дополнительную дозу каждые 4-6 ч в течение следующих 24 часов. Проверьте животных признаки бедствия в 12 часов после операции. Моделирование инфаркта миокарда с помощью хирургии выживания требует оценки боли и страданий после выздоровления от суrgery. Нынешний хорошим тоном является предоставление обезболивание в течение первых 24 часов следующего инвазивные процедуры с дополнительными дозы, учитывая как гарантировано в связи с потерей веса или признаков боли. Для постоянного перевязки, вес тела должен быть отслежены ежедневно, чтобы помочь оценить восстановление животного.
7. Ибупрофен (Motrin), нестероидные противовоспалительные препараты (NSAID) с противовоспалительным, анальгезии и жаропонижающим действием, или другие НПВП, может быть предусмотрен в питьевой воде животного в виде раствора 0,2 мг / мл в течение двух дней до хирургического вмешательства и до 7 дней после операции в вместе с бупренорфина для управления дополнительного боль / бедствие.

8. Измерение инфаркта миокарда Размер

1. Обезболить и интубировать мыши в конце желаемого времени реперфузии. Разрежьте кожу груди в средней линии к xyphoid. Откройте живот и диафрагму ниже грудной клетки и от обеих сторон среднеключичной линии.
<литий> Expose сердце, а затем снова перевязывать ЛАД в том же месте. Иглу аорту так 10% Голубая ФЦ можно медленно вводят непосредственно в аорту окрашивать сердце для разграничения зоне ишемии от неишемической зоне ^10.
2. Быстро вырезать сердце и промойте его в 30 мМ KCl (раствор хлорида калия) прекратить биение сердца и позволяют более последовательного секционирования. Замораживание сердце, по крайней мере, 4 ч при -20 ° С и разрезать на кусочки сердце 1 мм с использованием сердечного матрицу секционирования устройство ^11.
3. Выдержите кусочки сердца с 2% TTC при 37 ° С в течение 40 мин. Зона инфаркта является разграничены виде белого области в то время как жизнеспособной ткани пятна красного цвета.
4. Fix окрашенных срезов с 10% формальдегида в одночасье, который поможет увеличить контраст между области инфаркта и нормальной ткани. Сфотографируйте ломтики и вычислить площадь риска (ЗР), в неишемической зону и зону инфаркта с помощью программного обеспечения ImageJ.

<р = класса "jove_title"> 9. Измерение уровней Сердечная ферментных

Измерение кардиального тропонина I (cTnI) уровни в сыворотке мышей путем получения крови из воротной вены и последующим выделением сыворотки центрифугированием. Сывороточные уровни cTnI затем определяли с помощью количественного анализа быстрого cTnI ^12.

Результаты

После 24 часов реперфузии, анализ размера инфаркта и область высокого риска (AAR), по ФЦ синего красителя и трифенилфосфит хлорида тетразолиевого (TTC), перевязка ЛАД может быть подтверждена путем наблюдения побледнение тканей дистальных инфаркта в швом а также дисфункция передней стенки. ...

Обсуждение

Mouse модели миокарда ишемии являются эффективным методом для сердечно-сосудистых исследований, чтобы имитировать клиническую острого или хронического заболевания сердца ^13,14. Значительные усилия были применены для разработки и совершенствования хирургические подходы, которые п...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
PhysioSuite with RightTemp Homeothermic Warming	Kent Scientific Corp	PS-RT
Light source	Zeiss	KL 1500 LCD
Mouse Heart Slicer Matrix	Zivic Miller	HSMS001-1
Micro Tray - Base, Lid, & Mat (6.0 x 10 x 0.75)	Fine Science Tools	6100A
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride	Sigma Aldrich	T8877
Buprenorphine (Buprenex Injectable)	Reckitt Benkiser Healthcare	NDC 12496-0757-1
bupivacaine	Hospira	NDC 0409-1163-01
Isoflurane	Abbott	NDC 5260-04-05
Betadine Soultion	Purdue Pharma	25655-41-8
Mouse Cardiac Troponin T(cTnT) ELISA	Kamiya Biomedical Company	KT-58997
Fine Scissors	Fine Science Tools	14040-10
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-30
Dumont #3 Forceps	Fine Science Tools	11231-30
Castroviejo Micro Needle Holders	Fine Science Tools	12060-01
Slim Elongated Needle Holder	Fine Science Tools	12005-15
Round Handled Needle Holders	Fine Science Tools	12075-12
Omano Trinocular Stereoscope	Microscope.com	OM99-V6
SB2 Boom Stand with Universal Arm	Microscope.com	V6
Tracheal Tube, 0.5 mm, 1/16 in Y	Kent Scientific Corp	RSP05T16
Anesthesia Systems for Rodents and Small Animals	VetEquip, Inc	901807
4-0 silk taper suture	Sharpoint™ Products	DC-2515N
6-0 silk taper suture	Sharpoint™ Products	DC-2150N