왼쪽 앞쪽에 내림차순 동맥의 결찰을 통해 심근 허혈 - 재관류 손상의 생쥐 모델

요약

우리는 재현성을 높이기 위해 좌전 하행 동맥 (LAD)에 결찰의 위치에서 더 명확 수 있습니다 마우스 모델에서 심근 경색 (MI)을 시뮬레이션하기 위해 실험 허혈 / 재관류 (I / R) 손상을 유발하는 수술 방법을 소개합니다 마우스에있는 MI 실험.

초록

급성 또는 만성 심근 경색 (MI)은 높은 병적 상태와 사망률의 결과로 심혈관 이벤트입니다. MI 동안 직장에서 병리학 적 메커니즘을 수립하고 효과적인 치료 방법을 개발하는 것은 재현 임상 발생을 시뮬레이션하고 MI와 관련된 병태 생리 학적 변화를 반영하는 방법이 필요합니다. 여기, 우리는 단기 허혈 재관류 (I / R) 부상을 입 영구 결찰에 사용할 수있는 마우스 모델에서 MI를 유도 할 수있는 수술 방법에 대해 설명합니다. 이 방법의 주요 이점은 쥐 심장의 좌심실에서 허혈을 유도하기 위해이 동맥의 결찰 정확한 있도록 좌전 하행 동맥 (LAD)의 위치를​​ 용이하게하는 것이다. LAD의 합자의 정확한 위치는 경색 크기의 재현성을 향상하여보다 신뢰성있는 결과를 얻을 수 있습니다. 합자의 배치에 더 큰 정밀도는 t, 마우스, 미시간을 시뮬레이션하는 표준 수술 방법을 향상시킬 것입니다HUS 통계적으로 중요한 연구에 필요한 실험 동물의 수를 감소시키고 다음 MI 심장 부전의 제조 메커니즘에 대한 이해를 향상시킨다. MI의이 마우스 모델은 MI 다음과 심근 손상을 대상으로 치료의 전임상 시험에 유용합니다.

서문

심근 경색 (MI)의 동물 모델은 허혈성 심장 질환 ^(1)의 복잡한 기전 연구에 중요하다. 허혈 - 재관류 (I / R) 부상 MI 중에 발생하는 심근 손상이 주요 원인이다. 관상 동맥 순환의 폐색에 의해 생성 된 초기 허혈 손상은 적시에 살포를 복원하는 혈관 성형술의 사용에 의해 MI 환자에서 최소화 할 수있다. 이 개입은 크게 급성 MI, 심근 죽음에 이르게 I / R 상해에서 허혈 영역의 결과로 혈액의 흐름의 복원에 사망자 수를 감소하고 있지만. 심근 질량이 손실은 심 박출량과 심장 마비를 향해 진행을 감소에 기여한다. 따라서, I / R 상해에서 심근 죽음을 초래하는 메커니즘의 연구는 심장 혈관 연구에서 탐구의 중요한 라인이다. 외과 관상 동맥 결찰은 다양한 동물의 종류에있는 MI의 모델을 유도 할 수있는 유용한 실험 기법, includi에있다쥐, 개, 돼지를 겨. 다른 실험실에서 출판물 I / R 상해 ^2,3의 쥐 심장 모델의 설립에 관한 다양한 방법을 도입했습니다. 이러한 메커니즘에 대한 통찰력을 얻기 위해 우리는 MI 병리의 여러 측면을 재현 할 수있는 신뢰할 수있는 동물 모델에 액세스 할 수 있어야합니다. 이러한 모델의 개발은 MI의 처리와 관련 I / R 손상에 대한 치료 방법을 테스트하기 위해 필수적이다.

실험 동물에서 MI를 시뮬레이션하는 현재 수술 기법의 대부분은 허혈성 이벤트를 생성하는 시간에 정의 된 기간 동안 합자에 의해 폐색되어 동맥 (LAD)를 좌전 하행을 노출 흉강에 수술 절개를 포함한다. 그 합자 I / R 손상의 허혈 영역 및 발생의 재관류를 허용하도록 제거 될 수있다. LAD에 대한 문헌의 위치를​​ 항상 정확하게 재현되지 않도록, 이러한 방법 중 하나를 주요 제한이 방법에 의해 유도 된 MI의 심각도의 변화로 이어질 수 있습니다. 사용 가능한 대부분의 기술은 일반적으로 심장의 앞쪽 벽에 LAD의 대략적인 위치를 설명했다. LAD의 분기 및 방향은 위치가 항상 고정되어 있지 및 수술 ^6시 발생할 수있는 합병증에 이르는, ^4,5 쉽게 혼동 될 수있는 개별 동물 다를 수 있음. 합자의 부적절한 배치의 결과는 완전히 모델의 특이성을 손상하는 좌심실에 유도 경색의 크기 변화에서 실행할 수 있습니다. 여기에서 우리는 심근 I / R 및 LAD의 합자의 위치의 정확도를 향상 할 수 있습니다 생쥐의 영구 결찰에 대한 수정 방법을 제시한다. 초기 절개 및 내부 해부뿐만 아니라,이 대동맥에서 나온다 LAD와 사이트의 더 감사 할 수 있도록 심방을 들어 올리는 조작의 사용에 대한 구체적인 접근 방법을 적용하여. 설립LAD와 그 기원에 위치 재현 방식으로 LAD을 결찰 할 수있는 기회를 제공합니다. 심근 I / R 영구적 결찰 모델 수술 후 경색 크기의 편차를 감소 할뿐 아니라 작동 중에 과도한 출혈의 빈도를 감소시킬 수있다.

프로토콜

이 동물 프로토콜의 승인을 오하이오 주립 대학에서 기관 동물 케어 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 명시된 지침과 규정에 따라가되었습니다. 지역 IACUC에 의해 개발 된 모든 정책은 건강의 국립 연구소에서 실험 동물 복지 사무소에 의해 개발 된 동물 실험 가이드를 준수합니다.

1. 마취 및 기관 내 삽관

1. 사용하기 전에 모든 장비와 수술 용품을 압력솥. 절차를 통해 멸균 일회용 수술 장갑을 착용 할 것. 절차에 걸쳐 무균 영역을 유지한다. 멸균 드레이프의 사용은 권장하지만, 마우스의 해부학 적 랜드 마크의 더 나은 시각화 수 있도록 비디오에 표시되지 않습니다.
2. 유도 챔버에 개별적으로 각 마우스를 놓고 반사 손실을 보상하기까지 0.4 L / 분의 유속으로 5 % 이소 플루 란과 산소를​​ 사용하여 마취를 제공하고 번째 유지기관 튜브가 제 위치에 고정 될 때까지 마취 장치에 접속 노즈콘 튜브에 의해 0.4 L / 분의 유량으로 100 % 산소의 2 % 이소 플루 란으로 E 동물. 사용 된 이소 플루 란 마취 기계를 적절하게 배출 및 절차 중에 이소 플루 란 가스로 외과 의사의 노출을 최소화하기 위해 카본 필터가 장착되어야한다. 노즈콘을 언급하지만, 마우스를 삽관하는 조작의 시각화를 허용하기 위해 비디오에 도시되지 않는다.
3. 수술 위치의 오염을 방지하기 위해 수술 플랫폼이 아닌 다른 위치에있는 동물 머리 어선과 동물의 가슴을 면도.
4. 이후 삽관 수술 플랫폼에 누운 위치에 마우스를 놓습니다. 간단한 작은 스티로폼 플랫폼은 운영 플랫폼 역할을 할 수 있습니다. 멸균 된 표면을 제공하기 위해 사전 멸균 드레이프와 플랫폼을 커버. surgica있는 쥐의 체온을 유지하기 위해 플랫폼과 드레이프간에 가열 패드를 배치L 절차.
5. 테이프로 플랫폼에 10 cm 이상 2-0 실크 봉합사의 길이를 연결 한 후 전면 상단 앞니 주변에 루프 봉합. 마우스의 코를 통해 플랫폼의 가장자리에 근접 (2-3 인치) 콘을 배치합니다. 마우스 팽팽하게 당겨 테이프의 조각으로 꼬리 플랫폼에 고정.
6. 테이프의 가닥과 본체의 양측에 다리를 고정. 이것이 호흡을 손상시킬 수있는 전면 사지가 과도하게 확장되지 않습니다하는 것이 중요합니다.
7. 목과 가슴 절개가되기 전에 베타 딘과 알코올로 면도 외과 사이트를 준비합니다.
8. 마우스 머리 연산자의 방향으로 가리키는 플랫폼을 놓습니다. 0.5 cm 중간 경부 피부 절개를 잘라. 기관은 근육에서 볼 수있는 sternohyoideus 근육을 노출하기 위해 지협에서 갑상선 엽 (叶)을 분리합니다.
9. 그것이 intub으로 사용할 수 있도록 18 게이지 트로 카의 내 바늘을 제거ATION 관. 니들 포인트 홀더 역할을 할 수 및 외부 튜브의 1cm는 기관 튜브의 역할을 할 수있다.
10. 한 손으로 곡선 집게로 쥐의 혀를 잡고 약간 위쪽으로 이동합니다. 자궁 경부 피부 절개를 통해 기관을 볼 수 있습니다. 튜브가 기관 내부에서 볼 때까지 부드럽게 삽관 튜브를 삽입하는 다른 손을 사용합니다.
11. 마자 튜브는 기관에서와 같이, 튜브를 향해 반면에 곡선 집게를 이동하고 신속 내 바늘을 제거한다. 튜브는 기관에 삽입 할 수없는 경우에, 관은 호흡 문제를 피하기 위해 생산 인출되어야한다. 그것은 대신 기관의 식도에 튜브를 삽입하는 것을 방지하기 위해 목에 근접 할 때까지 튜브의 팁을 지적하는 것이 중요하다.

2. 환기 및 고정

1. 동물 용 인공 호흡기를 0.4 L / 분의 유속으로 산소 2 % 이소 플루 란을 배출하여 인공 환기. 수정 된 Y-SHA를 사용인공 호흡기와 기관 내 삽관 튜브를 연결하는 PE 커넥터에 연결합니다. 기관 튜브의 정확한 위치는 대칭 가슴 팽창을 판정함으로써 확인 될 수있다.
2. 260 μL / 행정 및 환기 속도로 갯벌 볼륨을 설정하면 특정 마우스 필요한 경우의 체중을 조절할 수 있습니다 분당 130 스트로크입니다.
3. 꼬리에 테이프를 제거하고 이후 수술을 오른쪽 측와위에 배치 부드럽게 마우스를 켭니다. 다시 플랫폼으로 꼬리와 다리를 고정하는 테이프를 사용합니다.
4. 체온을 모니터링하는 직장​​ 프로브를 넣고 37 º C. 주위 온도를 유지하기 위해 온난화 패드를 조정
5. 테이프를 사용하여 플랫폼에 프로브를 고정합니다. 절개가 이루어지기 전에 지역을 마비하기 위해 절개 사이트에서 부피 바카 인의 피하 주사.

3. 개흉술

1. 멀리 왼쪽에서 사이트 2mm에 약 1cm 길이 경사 절개를합니다왼쪽 앞 다리는 몸 (다리와 몸이 결합 위치를 아래 약 1 ~ 2 mm)를 만나는 곳의 방향으로 흉골. 피상적 흉부 정맥이 사이트 부근에 위치하며 절개의 측면 끝까지 들어가도록 절개해야한다,하지만 정맥으로 절단하지 않습니다.
2. 가슴 근육 아래 갈비뼈를 노출하지만 잘라. 이 단계에서는 선박의 사고로 부상을 방지. 출혈이 발생하면, 다음 ⁷ 단계로 진행하기 전에 출혈을 멈추게하는면 도포를 사용합니다.
3. 갈비뼈를 시각화하고 얇고 반투명 가슴 벽을 통해 폐를 팽창. 세 번째 늑간에 6-8 밀리미터 절개를하는 외과 용 가위를 사용하여 흉강을 엽니 다. 이 절개는 내흉 동맥이있는 흉골에서 2mm 이상이어야한다. 동맥에 손상을 제어하기 어려운 무거운 출혈을 생성합니다.
4. 미리 살균 만든 가슴 견인기가 int로 삽입폐 않도록주의하면서 폭 넓은 8 ~ 10 ㎜이다 그래서 O 부드럽게 절개하고 절개를 엽니 다 철수. 견인기는 핀 수술 플랫폼에 연결해야합니다.
5. 이 시점에서 마음 그러나, 폐는 여전히 마음의 한 부분을 다룰 것, 볼 수 있어야합니다. 곡선 포셉 부드럽게 심낭을 선택, 그것을 떨어져 당기고, 견인기 뒤에 조직을 밀어 넣습니다. 이 조작 동안 폐까지 떨어져 심장에서 올라옵니다.

4. 위치 LAD

1. 해부 현미경을 통해 마음의 표면에 LAD를 찾습니다. LAD는 좌심실을 통해 다운 마음의 정점 근처에서 심장 벽의 중간을 실행합니다. LAD는 밝은 빨간색 표시 강하게 펄스됩니다. 여기 정맥은 때때로 그러나 적절한 조명은 두 배를 구분하는 데 도움이 될 수 있습니다, LAD 오해한다. 조명이 너무 밝은 경우 색을 평가하기가 어려울 수 있습니다혈관 사이의 차이.
2. 결찰에 대한 LAD를 준비하는 약 1 ~ 2 mm의 직경과 멸균 면봉 조각을 사용합니다. 좌심방을 들어 올려 LAD를 노출하고 그 위치를 명확히하는 데 도움이되는, 좌심방과 좌심실 사이의면을 넣습니다. LAD가 위치 할 수없는 경우, 조각은 그래서 좌심방이 LAD가 발생한 대동맥을 나타 내기 위해 더 높은를 들어 올려에 추가 하락 할 수 있습니다.

5. LAD 내고

1. 합자위한 이상적인 위치는 왼쪽 귓바퀴의 끝보다 약 2mm 낮다. 폐 트렁크 왼쪽 귓바퀴를 식별 마커로서 사용할 수있다. 또한, 결찰 위치는 멀리 좌 회선의 분기에서 포인트 1-2밀리미터으로 시각화 할 수 있습니다. 부드럽게 즉시 의도 결찰 지점 아래 사이트에서 압력을 적용 할 곡선 집게를 사용합니다. 이렇게하면 동맥을 볼 수 있도록하고 또한 장소에 마음을 유지하는 데 도움이됩니다와 합자를 묶는 간단. 한 번에 5 초 이상 집게와 압력을 적용하고 펌핑을 변경할 수있는 마음의 압축을 피하지 마십시오.
2. 해부 현미경으로 관찰하면서 LAD 아래 6-0 실크 봉합사를 통과 테이퍼 바늘을 사용합니다. 바늘이 너무 많이 배치하면 좌심실 챔버를 입력하거나 바늘이 너무 얕은 경우 LAD을 손상 될 수 정밀도로 동맥에서 바늘을 삽입합니다. LAD 부상되면 출혈이 제어 할 수없는 경우는 동물을 안락사하는 것이 바람직하다, 바늘을 제거하고 출혈을 제어하기 LAD 봉합.
3. PE-10 튜브의 2 ~ 3 mm 길이의 조각이 ⁸ 배치되는을 통해 2-3 mm 직경의 루프를 떠나, 봉합 느슨한 두 번 매듭을합니다.
4. 다음 심실 벽을 손상하지 않도록주의하면서, 하나의 추가 매듭을 묶는하여 루프를 고정하는 동맥과 튜브 주위에 루프를 조입니다. 영구 결찰에 직접와 LAD 넥타이^{9 매듭.} 결찰 후 몇 초 이내에 나타납니다 LV의 앞쪽 벽에 옅은 색의 외관을 검사하여 LAD의 폐쇄를 확인합니다.
5. 트랙터를 제거하고 겸자와 함께 피부를 집어 일시적으로 상처를 닫습니다. 허혈이 유지되는 시간의 길이는 실험 디자인에 따라 다르지만, 흔히 20, 30, 45 또는 60 분이다. 마우스는 LAD의 동맥 폐쇄의 기간 동안 인공 호흡기에 남아 있습니다.

6. 재관류

1. 허혈 기간 후 불독 클립을 제거하고 합자를 노출하는 가슴 견인기를 삽입합니다. 매듭을 풀어 PE-10 튜브를 제거합니다. 15 ~ 20 초 후에 LV의 전벽의 분홍색 붉은 색의 반환을 관찰하여 재관류를 확인합니다.
2. 2 % 트리 페닐 테트라 졸륨 클로라이드 (TTC), 청색 염색은 재관류 후 수행 할 경우 장소에 봉합을 남겨주세요. 염색이 필요없는 경우에, 봉합은 B 수전자 제거.
3. 재관류 시간은 일반적으로 1 시간부터 24 시간까지 걸친 실험 설계에 의존 할 것이다.

7. 가슴 폐쇄 및 수술 후 관리

1. 봉제 흉강을 닫고 4-0 실크 봉합사와 ³ 차 늑간에 절개를 종료합니다. 그것은 폐는 봉합의 명확하고 ³ 번째로 갇혀 4 ^번째 갈비뼈가 함께 봉합하는이되지 않는 것이 중요합니다. 봉합사의 매듭을 묶는 동안은 흉강에 갇혀 될 수있는 실내 공기를 최소화하기 위해 바늘 홀더와 가슴에 약간의 압력을 적용하는 것이 도움이된다.
2. 4-0 실크를 사용하여 연속 봉합과 근육의 모든 레이어를 닫습니다. 연속 봉합으로 피부를 닫습니다 나일론 봉합사를 사용합니다. 대안 적으로, 피부가 중단 봉합사로 폐쇄 될 수있다.
3. 산소의 흐름을 계속하면서 봉합이 완료 중단 이소 플루 란의 흐름 경우. 마우스는 수염이나 꼬리 해, 어깨에 매는를 이동하면자발적으로 호흡하는 시도를 시작하는 거라고. 삽관 튜브와 인공 호흡기에서 마우스를 제거 여전히 기관에 보관.
4. 마우스가 정상적인 호흡 패턴을 재개 한 후 마우스를 튜브를 빼내 때까지 신중하게 동물을 관찰한다. 튜브는 구강 분비물의 흡입을 피하기 위해 천천히 제거되어야한다.
5. 마우스가 케이지에 반환하기 전에 또 다른 3 ~ 5 분 정도를 관찰하여 어떤 호흡 곤란에이 아닙니다. 탈수의 증상이 수술 후 관찰되는 경우, 복강 내 주사에 의해 멸균 식염수 0.5 ㎖까지 제공한다.
6. 수술 후 진통제의 경우, 동물이 외래 전에 아편 진통제 (부 프레 노르 핀, 0.1 ㎎ / ㎏) 피하 (SC)를 관리하고 추가 량에게 다음 24 시간 동안 매 4-6 시간을 제공합니다. 수술 후 12 시간에서 고통의 동물의 흔적을 확인합니다. 생존 수술을 이용하여 심근 경색의 시뮬레이션 스와 회복 다음과 같은 고통과 고통의 평가가 필요rgery. 현재 승인 된 모범 사례로 인해 체중 감소 또는 고통의 흔적을 보증으로 주어진 추가 용량을 가진 침략 절차에 따라 처음 24 시간 동안 진통을 제공하는 것입니다. 영구 결찰를 들어, 체중은 동물의 회복을 측정하는 데 도움이 매일 추적해야합니다.
7. 이부프로펜 (모 트린)는 항염증제, 진통제 및 해열제 활동, 또는 다른 비 스테로이드 성 소염 진통제와 비 스테로이드 성 항 염증 약물 (NSAID)는, 수술 전 이틀 동안 0.2 ㎎ / ㎖ 용액으로서 동물의 식용에 제공 할 수있다 추가 통증 / 고통을 관리하는 부 프레 노르 핀과 함께 수술 후 7 일까지.

심근 경색 크기의 8. 측정

1. 마취 및 원하는 재관류 시간의 끝에서 마우스를 삽관. xyphoid에 중간 선에있는 가슴의 피부를 잘라. 흉곽 아래와 쇄골 라인의 양쪽에서 복부와 횡경막을 엽니 다.
<리> 마음을 노출하고 같은 위치에 LAD를 다시 결찰. 그래서 10 %의 프 탈로 블루 천천히 비 허혈성 영역 ^{(10)으로부터} 허혈성 영역의 묘사에 대한 마음을 얼룩하는 대동맥에 직접 주입 할 수있는 대동맥을 Cannulate.
2. 신속하게 마음을 절제 및 심장의 박동을 중지하고 일관성 절편 수 있도록 30 ㎜의 KCl (염화칼륨 용액)으로 세척. -20 ° C에서 최소 4 시간 동안 마음을 동결 장치 ^(11)를 구획 심장 매트릭스를 사용하여 1mm의 조각으로 마음을 잘라.
3. 40 분 동안 37 ° C에서 2 % TTC 심장 조각을 품어. 생존 가능한 조직을 적색 얼룩 반면 경색 부분은 흰색 영역으로 경계가된다.
4. 경색 영역과 정상 조직 사이의 대비를 향상하는 데 도움이되는, 하룻밤 10 %의 포름 알데히드와 스테인드 조각을 수정. 조각을 사진과 위험 지역 (AAR), 비 허혈성 영역과 I​​mageJ에 소프트웨어를 사용하여 경색 면적을 계산.

9. 심장 효소 레벨 측정

포털 정맥에서 혈액을 획득 한 후 원심 분리하여 혈청을 분리하여 마우스의 혈청에있는 I (cTnI 상승) 수준의 심장 트로포 닌을 측정합니다. 혈청 cTnI 상승 수준은 다음 양적 빠른 째의 cTnI 분석 ^(12)에 결정된다.

결과

재관류, 경색 크기 및 면적에 위험 (AAR), 프 탈로 블루 염료 및 트리 페닐 테트라 졸륨 클로라이드 (TTC)에 의해, LAD의 결찰 봉합사에 심근 조직 원위의 창백을 관찰함으로써 확인 될 수있는 분석에 24 시간 뒤에 뿐만 아니라 앞쪽에 벽의 장애. 재관류는 심근 조직 및 앞쪽에 벽 운동의 일부 복구의 시범에 붉은 색의 반환에 의해 확인 될 수있다.

경색 영역 (흰색)는 위험 (빨간색)?...

토론

마우스 심근 허혈 - 재관류 모델은 임상 급성 또는 만성 심장 질환 ^{(13, 14)를} 시뮬레이션하는 심장 혈관 연구를위한 효과적인 방법입니다. 상당한 노력은 허혈성 이벤트와 여러 가지 동물 유형의 마음 재관류 손상을 일으킬 수술 방법을 개발하고 구체화 적용되었습니다. 다른 동물 시스템의 사용에 특히 장점이 있지만, 마우스는 마우스의 심장에 심근 I / R 생산에 광범위한 관심을 이끌고?...

자료

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Mouse Heart Slicer Matrix	Zivic Miller	HSMS001-1
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2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride	Sigma Aldrich	T8877
Buprenorphine (Buprenex Injectable)	Reckitt Benkiser Healthcare	NDC 12496-0757-1
bupivacaine	Hospira	NDC 0409-1163-01
Isoflurane	Abbott	NDC 5260-04-05
Betadine Soultion	Purdue Pharma	25655-41-8
Mouse Cardiac Troponin T(cTnT) ELISA	Kamiya Biomedical Company	KT-58997
Fine Scissors	Fine Science Tools	14040-10
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-30
Dumont #3 Forceps	Fine Science Tools	11231-30
Castroviejo Micro Needle Holders	Fine Science Tools	12060-01
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Tracheal Tube, 0.5 mm, 1/16 in Y	Kent Scientific Corp	RSP05T16
Anesthesia Systems for Rodents and Small Animals	VetEquip, Inc	901807
4-0 silk taper suture	Sharpoint™ Products	DC-2515N
6-0 silk taper suture	Sharpoint™ Products	DC-2150N