Стенограмма и метаболитов профилирования по оценке табака Дерево и тополя в качестве сырья для био-основанной промышленности

Резюме

Биомасса растений предлагает возобновляемых ресурсов для нескольких продуктов, в том числе топлива, кормов, продуктов питания и различных материалов. В этой статье мы исследуем свойства табака дерева (Nicotiana Glauca) и тополя в качестве подходящих источников для Biorefinery трубопровода.

Аннотация

Мировой спрос на продовольствие, корма, энергии и воды создает огромные трудности для будущих поколений. Очевидно, что надежные платформы для освоения возобновляемых ресурсов необходимы для решения этих проблем. В многонациональной рамочной MultiBioPro мы разрабатываем Biorefinery трубопроводов для максимального использования растительной биомассы. В частности, мы используем тополь и табака дерево (Nicotiana Glauca) как целевых видов сельскохозяйственных культур для повышения осахаривания, изопреноидных, длинные содержимое цепи углеводородов, качество волокна и суберина и лигнина содержимое. Методы, используемые для получения этих результатов, включают ГХ-МС, ЖХ-МС и РНК платформы секвенирования. Метаболита трубопроводы хорошо известны инструменты для создания этих типов данных, но также имеют ограничения в том, что только хорошо характеризующихся метаболитов могут быть использованы. Глубокий секвенирование позволит нам включить все стенограммы, присутствующие во время стадии развития табачной лист дерева, но чкак быть отображены обратно в последовательности Nicotiana аЬасит. С помощью этих установок, мы нацелены на базовое понимание для основных процессов и на создание промышленной базы для использования результатов. В более долгосрочной перспективе, мы считаем, что данные, полученные здесь будет предоставлять средства для устойчивого процесса Biorefinery использованием тополя и табака дерево в качестве сырья. На сегодняшний день уровень основной метаболитов в образцах были проанализированы и протоколы, используемые приведены в этой статье.

Введение

Население и экономический рост обусловили растущий спрос на продовольствие, вода и топливо. Многие из этих материалов производятся, обрабатываются и транспортируют с помощью конечных ископаемых на основе средств, таких как нефть. Это, однако, ясно, что эта практика не является устойчивым, и, следовательно, развитие альтернативных ресурсов будет иметь большое значение ^1. Многие возобновляемые ресурсы, в разной степени, в настоящее время эксплуатируются, в том числе ветра, движения воды, солнечной, геотермальной, и волны на основе источников энергии. Другой устойчивой и в значительной степени неиспользованным ресурсом является биомасса из растений. Этот ресурс также предлагает очень экономически эффективным способ преобразования солнечной полученную энергию в топливо ^2. Помимо предоставления биологической основе топлива, растительная биомасса также предлагает уникальные возможности для альтернативных продуктов, в том числе пластмасс, моющих средств, и ценные химические.

Стена Растительная клетка, которая в значительной степени состоит из сахара на основе полимеров, макэс до основную массу биомассы завода и много усилий в настоящее время инвестировали в его эффективного преобразования в биоэтанол. Остальные биомассы может быть впоследствии перерабатывается в биогаз и нефтяных продуктов, связанных с ^3. Большая часть многолетних видов растений, в том числе трав и деревьев, которые производят большое количество целлюлозной биомассы обычно лучше всего растут в зонах с умеренным климатом. Тем не менее, около 20% от площади земель полузасушливых, и, следовательно, также склонны к засухам ^4. Очевидно, было бы интересно также культивировать эти засушливые земли с растениями, которые могли бы эффективно способствовать устойчивому производству энергии и материалов. Эти растения должны иметь оптимальную эффективность использования воды и засухоустойчивостью и будет включать в себя дерево табака (Nicotiana Glauca) и видов из рода Агава.

MultiBioPro консорциум стремится реализовывать комплексный Biorefinery трубопровода, используя два важных кроп видов, тополь и табак дерево. Тополь стала многообещающим урожая биотоплива, как это быстро растет, легко клонально размножают и хорошо адаптируется к широкому спектру климатических и почвенных условий. Он также предоставляет широкий спектр древесины, волокна, топливной древесины и других лесных продуктов ^5. Дерево табак также стал подходящим завод на биотоплива и переработке биологических веществ целей. Это, как правило, производит значительное количество биомассы, содержит большое количество неструктурных углеводов ^6, а также имеет редкую способность накапливать большое количество легко извлекаемых непищевых масел (в том числе длинной цепи C _{29-C 31} насыщенных углеводородов и тритерпеноиды), которые подходят для биодизеля производство. Дерево табак, более того, поддаются генетическому улучшению, имеет высокую способность прорастания, и растет счастливо на полузасушливых почв, не используемых для производства продуктов питания. Таким образом, представляется, что и тополя и табак дерево имеют внутреннюю потенциал для MULTIPЗАДАЧА культуры, то есть как новые сырья высокого значения для интегративной биологической основе промышленности. В данной работе мы ориентируемся на разнообразный набор подходов различить, как долго табачные дерево депозиты углеводородов цепи.

В попытке идентифицировать основной молекулярные машины, отвечающий за производство и секрецию насыщенных длинноцепочечных углеводородов на листьях табака, мы применяем современные "омик" технологий. Это включает в себя РНК последующие статьи в развития серии листьев (десять ступеней), и мультиплатформенный метаболит профилирования подходы с использованием LC-и ГХ-МС (для полярных и неполярных метаболитов и lipidomics). Эти данные будут использованы для добычи экспрессии генов, что коррелирует с, или предшествует, начала биосинтеза молекул, указанных выше. Гены и пути, которые кажутся многообещающими от этих усилий будет использоваться для функционального тестирования в модельных видов Arabidopsis и в конечном счете может быть поддаются для биотехнологического машиностроения в табачнойАККО дерево.

протокол

1. Материал завод

Расти Nicotiana Glauca заводы в 30 горшках диаметром см, содержащих M2 профессиональный питательная среда. Выращивания растений в теплице, с дневной температурой 20-25 ° С и ночной температуре 15 ° С. Используйте 16 часов света и 8 часами темноты цикл в качестве дополнительного светового режима.

2. Подготовка образца

1. Для первичных метаболитов:
   1. Урожай растительные материалы (листья и стебли Н. Glauca) и замораживание материала сразу.
   2. Лиофилизации замороженного растительных материалов путем сушки вымораживанием в течение трех дней.
   3. Измельчить лиофилизированных образцов по Вибрационная мельница с металлическими шариками.
   4. Алиготе ячневой сухие материалы в 2 мл трубки центрифуги или стеклянную пробирку.
2. Для вторичных метаболитов:
   1. Урожай растительные ткани и замораживание материала сразу.
   2. Измельчить замороженных тканей растений путем мixer мельница с шариком из нержавеющей стали или с помощью ступки и пестика.
   3. Алиготе ячневой ткани в 2 мл пробирку для центрифугирования (приблизительно 20 мг сырого веса).

3. Добыча Протокол метаболитов профилирования для первичных метаболитов ГХ-МС

1. Алиготе земля сухая растительный материал (10 мг листа и 20 мг стволовых материалов) в 2 мл, винтовой крышкой, с круглым дном трубки.
2. Добавить 1400 мкл 100% метанола и вихря в течение 10 сек.
3. Добавить 60 мкл рибит (0,2 мг / мл на акции в H ₂ O) в качестве внутреннего количественного стандарта и вихря в течение 10 сек.
4. Добавить один из нержавеющей стали (или диоксида циркония) мяч и гомогенизации материала с Вибрационная мельница течение 2 мин при 25 Гц.
5. Центрифуга смесь в течение 10 мин при 11000 х г.
6. Передача супернатант в стеклянный флакон.
7. Добавить 750 мкл хлороформа.
8. Добавить 1500 мкл H ₂ O и вихрь смесь в течение 10 сек.
9. Трансфер 150 мкл отВерхнюю фазу (полярная фаза) в свежую 1,5 мл центрифужную пробирку.
10. Сухие образцы, используя скорость переменного тока. Крайне важно, чтобы образцы сводятся к сухости для между 3 и 24 часов, пока не остаточная жидкость не присутствует.
11. Добавить 40 мкл метоксиамина гидрохлорида (20 мг / мл в пиридине).
12. Взболтать смесь в горизонтальном тепла блока шейкере в течение 2 ч при 37 ° С.
13. Добавить 70 мкл N-метил-N - (триметилсилил)-трифторацетамид MSTFA смеси.
14. Встряхнуть смесь в течение 2 часов при 37 ° С
15. Спином вниз капли на крышке с помощью короткого центрифугирования ~ 1 мин при 11000 х г.
16. Передача жидкости в стеклянных флаконах, пригодных для анализа ГХ-МС.

4. Добыча для метаболитов профилирования для вторичных метаболитов ЖХ-МС

1. Добавить 500 мкл метанола в замороженных образцах грунта.
2. Встряхнуть с термомиксер течение 15 мин при 70 ° C (1000 сек ^-1).
3. Центрифуга образцов (5 мильN, 20000 XG) и жидкую фазу переносили в 1,5 мл центрифужную пробирку.
4. Лиофилизации жидкой фазы с помощью центробежного испарителя (SpeedVac).
5. Добавить 100 мкл циклогексан и 100 мкл MilliQ воды к сухой гранул.
6. Взболтать образцы в течение 5 мин при комнатной температуре (использование вихревой).
7. Центрифуга образцов (5 мин, 20000 XG).
8. Передача 80 мкл водной фазы (ниже фаза) в ЖХ-МС флаконах для инъекций с коническим днищем для анализа LC-MS.

5. Анализ данных

1. Настройка Xcalibur, MarkerLynx, Metalign ⁷ или XCMS ⁸ и выберите анализ данных, подлежащих обработке.
2. Подготовьте таблицу обнаруженных пиков ваш интерес в соответствии с соединением класса в таблице 1.
3. Определение пики при совместном элюировании стандартных соединений.
4. Впоследствии комментировать обнаруженные пики с помощью MSN анализ, структурные алгоритмы характеризации ^9,10, литература секurvey и метаболит поиск по базе ^11,12.

6. Углеводородов Добыча ¹³

1. Погрузите свежесобранных N. Glauca листьев (~ 200 мг) в растворителе (метанол, этанол, хлороформ, гексан или петролейный эфир (температура кипения 40-60 ° С или 60-80 ° C) (5 мл; ВЭЖХ) от 2 до 20 мин.
2. Удалите листья и высушить растворители полностью на роторном испарителе.
3. Образцы Ресуспендируйте в гексан (1 мл; ВЭЖХ).
4. Выполнить анализ GC-MS с использованием газовой хроматографии и дефис к 5973MSD. Рабочие условия должны быть следующими; Газ-носитель гелий с расходом 0,9 мл мин ^-1 / 11 фунтов на квадратный дюйм. Введите образцов (1 мкл) с без деления потока инжектора при 280 ° С. Удерживая газовой хроматографии печи при 70 ° С в течение 5 мин, после чего наращивают при 4 ° С / мин до 320 ° C. Удерживая конечную температуру в течение еще 10 мин, делая общее время 67,5 мин. Установите интерфейс с MS при 280 ° С и рerform МС в режиме полного сканирования с использованием 70 эВ EI + и сканируется от 10 до 800 D.
5. Первоначально обрабатывать компоненты хроматограмме автоматизированной MS деконволюции и системы идентификации, и те, которые идентифицируются с помощью MS библиотеки NIST 98.
6. Подтвердите идентификацию насыщенных длинноцепочечных алканов углеводородов (hexacosenol, nonacosane, triacontane, octacosenol, nonacosonal, hentriacontane, dotriacontane и tritriacontane) путем сравнения времени удерживания и классические образцы фрагментации с известными аутентичными стандартами.
7. Количественно определить углеводородов путем сравнения комплексных пиков с кривой доза-ответ (от 0,07 до 2,5 мг), построенных из аутентичных стандартов.
8. Рассчитать средства и стандартную ошибку средств (SEM) с использованием программного обеспечения Excel.

7. Анализ изопреноиды ¹⁴

1. Выполните гомогенизации, как описано в разделе 2. Взвешивание 10 мг гомогенизированный сублимационной сушке порошка в пробирку для центрифугирования.
2. Добавить последовательно 250 мл метанола на порошок, смешать его, затем добавьте 500 мл хлороформ (лаборатория химически чистой), и смешайте его встряхиванием.
3. Оставьте образцы на льду в темноте в течение 20 мин.
4. Добавить 250 мл трис-НСl-буфера (100 мМ, рН 7,5) или воды (ВЭЖХ) к суспензии и перемешивают на вортексе.
5. Центрифуга смеси при 12000 оборотов в минуту (13523 мкг) в течение 5 мин, чтобы отделить неполярных из водных фаз. Неполярной фазы хлороформом, содержащим изопреноидные экстракты находится в нижней части.
6. Передача фазы в новую пробирку центрифуги.
7. Добавление дополнительного 500 мл хлороформа к водной фазе, и провести вторую экстракцию с помощью вихря и центрифугированием, как описано выше.
8. Объединяют экстракты хлороформа и принести образцы досуха не используя испаритель и хранить при -20 ° С до анализа.
9. Добавить 50 мл этилацетата (ВЭЖХ) в высушенном изопреноидов экстракта для повторного растворения материала.
10. Введите 3 мл на C18колонка с использованием модуль разделения UPLC ACQUITY. Градиент, используемый для разделения пигменты должны включать; : Метанол / H ₂ 0 (50:50) и B: ацетонитрил / этилацетат (75:25), и начальные условия должны быть 30% (объем / объем) и B 70% (объем / объем) собирается 100 % В в течение 6 мин. Использование скорости потока 0,6 мл / мин.
11. Монитор элюата непрерывно с массива фотодиод (PDA) детектора от 250 до 600 нм.
12. Определите компоненты путем совместной хроматографии и спектральных сравнений между аутентичными стандартами, бета-каротин (провитамин А), фитоена, ликопин, лютеин и зеаксантин.
13. Выполнение количественного кривых доза-ответ.
14. Подтверждение соединений с помощью ЖХ-МС; использовать аналогичные условия хроматографического. Обнаружение должно быть сделано с помощью APCI ионизации в положительном режиме с инструмента Q-TOF.
15. У модификации для определения токоферола с 25 мг лиофилизированного материала, который был извлечен и омыления в 6% КОН при 50 ° С в течение 1,5 часов.

8. Экстракция РНК для РНК Seq

Этот протокол сочетает тризола выделения РНК с Kit RNeasy получить высокое качество РНК.

1. Измельчите 100 мг замороженного растительного материала в 2 мл центрифужные пробирки с металлическим шариком в смесителе мельнице.
2. Добавить 1 мл Trizol.
3. Центрифуга материал течение 10 мин при 12000 х г при 4 ° С.
4. Передача супернатант в новую реакционную трубку.
5. Добавить 200 мкл хлороформа, инвертировать трубки несколько раз, и инкубировать 3 мин при комнатной температуре.
6. Центрифуга смесь в течение 15 мин при 12000 х г при 4 ° С.
7. Трансфер верхнюю водную фазу (примерно 700 мкл) в новую реакционную трубку.
8. Добавить приблизительно 2,5 объемов этанола (100%), инвертировать трубки несколько раз, и инкубируют в течение 30 мин при -80 ° С.
9. Перемещение образца в том числе любой осадка в колонну спина от комплекта.
10. Центрифуга столбец в течение 15 сек при 8000 мкг в, и выбросьте енизкий до конца.
11. Добавить 700 мкл буфера RW1 к колонке спина и центрифуги в течение 15 сек при 8000 х г. Откажитесь от потока через.
12. Добавить 500 мкл буфера НПП в колонну спина и центрифуги столбец на 15 сек в 8000 х г. Откажитесь от потока через.
13. Добавить 500 мкл буфера НПП в колонну спина и центрифуги в течение 2 мин при 8000 х г.
14. Поместите колонку спина в новый 1,5 мл реакционную трубку и добавить 50 мкл РНКазы без воды.
15. Центрифуга столбец течение 1 мин при 8000 х г дл элюировани РНК.
16. Удалите остатки ДНК с помощью ДНК-бесплатно комплект Ambion в соответствии с инструкциями изготовителя.
17. Определить качество РНК. РНК должны иметь номера целостности РНК (RIN) выше 8.
18. Отправить от РНК к следующей последовательности поколения.

Результаты

Профиль HPLC на рисунке 1 показан репрезентативный результат изопреноидов анализа N. Glauca экстракты листьев. Различные изопреноидов из C40 и выше были обнаружены с использованием массива фотодиод (PDA) детектора. Пики аннотированный на основе сотрудничества хроматографии и спектрального сравнения подлинных стандартов, бета-каротин (провитамин А), фитоена, ликопин, лютеин и зеаксантин. Два хроматограммы MS на рисунке 2 показаны результаты первичного анализа метаболита из N. Glauca листья и стебель материала соответственно. Масс-спектр пика, соответствующего серина (обозначенном стрелкой) также приведен в качестве примера. 3 показана Bioanalyzer используется для определения качества РНК и представительный выход из устройства. Две основные пики на хроматограмме, соответствующие 18 S и 25 S рибосомальной РНК, что указывает на неповрежденную РНК в образце. Дополнительные пики фрагментированной ребраosomal РНК появится в случае с частично или сильно деградировавших РНК.

Рисунок 1. ВЭЖХ профиль показывая изопреноиды присутствующие в листовых выписок из N. Glauca. Большинство изопреноиды из С40 и выше не поддается анализу ГХ-МС. Поэтому мы использовали ВЭЖХ разделения с обнаружением фотодиод массива. Типичная хроматограмма записывается при 450 нм показана. Каротиноидов пигменты типичны фотосинтезирующих тканей с лютеином изделиями. Также присутствует, зеаксантин, который редко встречается в ткани листа, если не помещается под высоким света стресса. Уровни зеаксантина делают его хорошим источником этого дорогостоящего соединения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенное Version этой фигуры.

Рисунок 2. MS хроматограммы и спектр N. экстракты тканей Glauca. Общая ионная МС хроматограмма (ТИЦ) из листьев и стеблей экстракты измеренные ГХ-МС представлена ​​(70-600 м / г). Анализ методом ГХ-МС проводили, как описано ранее в ^15. Обнаруженные пики аннотированный с использованием библиотеки масс-спектрометрии теги. Масс-спектр серина (2TMS) показан в качестве примера. МС хроматограмма: ось X и Y оси указывают время удерживания (мин) и интенсивность (изобилие) сигнала, МС-спектр: ось X и Y оси указывают M / Z отношения и интенсивность (изобилие) сигнала, соответственно. Нажмите здесь, чтобы увеличитьизображения.

Рисунок 3. Bioanalyzer измерение РНК, полученной для РНК и след от N. Glauca лист материала. Для получения высокой степени чистоты, необходимой для РНК РНК-SEQ мы извлеченной РНК с использованием тризола реагента и затем очищали РНК с использованием колонок с RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany). Мы определили качество РНК с помощью Bioanalyzer (Agilent, Waldbronn, Германия) отображается слева. Пример вывода Bioanalyzer дается справа. Два основных пиков в образце представляют 18 S и 25 S рибосом РНК. Наш образец показал РНК количество целостности (РИН) 9,2, что является намного выше требуемого значения 8. Нажмите еее, чтобы увеличить изображение.

Обсуждение

Протоколы, представленные здесь, обеспечивают всеобъемлющие рамки для анализа табачных листья деревьев для метаболитов и стенограммы. Предусматривается, что эти объединенные усилия должны предоставить нам новое понимание процессов, лежащих в основе синтеза и экструзию углеводородов и соединений высоких значений, присутствующих в этой ткани. Таким образом, эти подходы должны дать нам лучшее понимание того, как синтезируются соединения. В дополнение к табачных деревьев аспектах работы, он также направлен на улучшение тополя биомассы, особенно в интересах лигнификацию вторичной структуры стены, но и для изучения, можем ли мы использовать кору для извлечения ценных соединений.

Методы, представленные в данном документе, являются небольшие модификации стандартных методов метаболита профилирования. Эти методы, конечно, ограничен известных метаболических профилей, и вполне возможно, что несколько новых метаболических пиков могут быть получены для WHICH никакого соединени не известно. Мы надеемся поставить эти соединения в контексте с другими метаболитов путем объединения поведение метаболитов и стенограммы над развитием временных рядов.

Ни один из методов, представленных здесь не существенно изменилась от методов, обычно используемых для растительных материалов. Интересный аспект заключается в сочетании методов, чтобы понять основную структуру для основном длительного производства цепь углеводородов и внесении изменений в табачных листьев. Одним из важнейших шагов для получения этой информации является последующее сочетание различных типов данных. Мы предполагаем, что данные как первой оценки будут разделены на различных кластеров на основе поведения метаболитов / транскриптов более развития и что эти данные будут использованы для вывода стенограмму против метаболитов поведения, а также потенциально назначить определенные метаболиты в пути . Кроме того, более сложные сетевые анализы то предусмотрено то эксплуатировать причинно-следственные связи.

Аналитические протоколы, представленные здесь, также обеспечивают основу для полевых испытаний и промышленной эксплуатации биомассы. Чтобы достичь этого, консорциум MultiBioPro содержит несколько промышленных партнеров, которые имеют способности для дальнейшего изучения биомассы, с целью доставить биодизеля, биоэтанола и других соединений с высокой добавленной стоимостью. Эти типы эксплуатации биомассы будет оцениваться на основе; (1) проверка надежности и качества био продуктов, произведенных (типичные промышленности стандартные тесты будут проводиться для обеспечения получаемые продукты имеют хорошую рыночную стоимость), (2), экономического, социального и экологического оценка технологий будет осуществляться с помощью литературных источников, интервью и материал, который создается во время полевых испытаний и оценок по переработке биологических веществ на пилотной установке. Эти мероприятия будут включать затрат и выгод и анализ жизненного цикла, генерацию экологической досье и рынка и деловосс стратегии. Мы считаем, что этот трубопровод станет полезным сочетание научных кругов, прикладной науки и промышленной эксплуатации к дальнейшему тополя и табака биомассы дерева на потребительские конечных продуктов.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Trizol reagent	Invitrogen	15596-026
Chloroform	Merck	102445
Ethanol	Merck	101986
Rneasy Mini Kit	Qiagen	74104
TURBO Dnase	Invitrogen	AM2238
RNA 6000 Nano Kit	Agilent	G2938-90034
2100 Electrophoresis Bioanalyzer	Agilent	G2939AA
1.5 ml and 2 ml safe-lock tubes	Eppendorf	0030 120.086, 0030 120.094
Steel balls	Geyer Berlin GmbH	VA2mm
Mixer mill MM 300	Retsch	YO-04182-09
Microcentrifuge	Eppendorf	5424