Крыса модель фотохимических индуцированного Posterior ишемической оптической невропатии

Резюме

Цель этого протокола заключается в фотохимических вызвать ишемического повреждения в задней зрительного нерва у крыс. Эта модель имеет решающее значение для исследований патофизиологии задней ишемической оптической невропатии и терапевтических подходов для этого и других оптических невропатии, а также другие ЦНС ишемические заболевания.

Аннотация

Задняя ишемическая оптическая нейропатия (ПИОН) это зрелище-разрушительной болезни в клинической практике. Тем не менее, его патогенез и естественной истории остались плохо изучены. В последнее время мы разработали надежный, воспроизводимый животную модель пион и проходят лечебный эффект некоторых нейротрофических факторов в этой модели ^1. Цель этого видео, чтобы продемонстрировать нашу фотохимических индуцированной модели задней ишемической оптической невропатии, и оценить его последствия с ретроградной маркировки ганглиозных клеток сетчатки. После хирургического воздействия на заднем зрительного нерва, фотосенсибилизирующего красителя, эритрозин В, вводят внутривенно и лазерный луч фокусируют на поверхности глазного нерва. Фотохимические взаимодействия эритрозином В и лазера во время облучения повреждений эндотелия сосудов, вызывая закупорку капилляров, опосредованного тромбоцитами тромбоза и отечной сжатия. В результате ишемического повреждения дает постепенное, но pronouncред сетчатки отмирание клеток ганглия, вследствие потери аксонов вход - в пульте дистанционного управления, травмы, вызванной и клинически значимых исходов. Таким образом, эта модель обеспечивает новый платформу для изучения патофизиологического курс ПИОН, и может быть дополнительно оптимизирован для тестирования терапевтических подходов для оптических невропатии, а также других ЦНС ишемических заболеваний.

Введение

У пациентов старше 50 лет, ишемическая оптическая нейропатия (ИОН) является наиболее распространенным типом острого оптической нейропатии ^2. Состояние может представить, как один из подтипов двух в зависимости от источника питания конкретного пострадавшего крови и клинической картины: передней (AION) или задней (ПИОН) ^3. В то время как патогенез и ход AION были изучены ^4-7, пиона были плохо понимал, из-за его низкой распространенности, переменная презентации, плохо определенных диагностических критериев и отсутствием модели животных. Кроме того, нет процедуры не были доказаны, чтобы эффективно предотвратить или обратить вспять потерю зрения из AION или пиона. Таким образом, воспроизводимым и надежная модель животное ПИОН имеет большое значение для изучения процесса болезни в естественных условиях и испытания новых терапевтических схем для нейропротекции и регенерации аксонов.

Фотохимических индуцированных ишемического повреждения микрососудов в результате vasogЕНИК отек и тромбоз эффективно создает региональный ишемии тканей ^8-12. После инъекции в сосудистую обращении, светочувствительный эритрозин краситель B производит реактивную синглетного молекулярного кислорода при активации лазерного облучения мишеней сосудов. Синглетное кислорода непосредственно peroxidizes эндотелия сосудов, стимулируя тромбоцитов сцепления / агрегации и приводит к окклюзионная образование тромбов. Ишемического повреждения распространяется в соседние районы и усугубляется сжатия микрососудов за счет отека вазогенного. Общая цель этого протокола является фотохимически вызвать ишемию в ретробульбарный зрительного нерва, чтобы отразить ущерб, причиненный пиона.

По нашим сведениям, это первая модель ишемического повреждения в задней зрительного нерва ^1. Как эта модель производит ишемию, избегая физическую травму, физиологические процессы задней ишемической оптической невропатии лучше изобразил и учился, Кроме того, эта модель предлагает новый платформу для скрининга кандидатов терапевтических средств для оптических невропатии и других заболеваний ЦНС ишемического. Здесь Подробный протокол бедренной вены катетеризации, зрительного нерва, воздействия внутривенной инъекции эритрозин В и лазерного облучения в модели крысы ПИОН описаны.

протокол

Все процедуры на животных были одобрены Калифорнийского университета Сан-Диего и Университета Майами институциональной уходу и использованию животных комитетов (IACUC) и осуществляется в соответствии с Заявлением ARVO для использования животных в офтальмологических и визуального исследований. Все реагенты и инструменты, используемые в хирургических процедур являются стерильными.

1. обезболить и подготовка Крыса для хирургии

1. Перед процедурой, Крыс анестезируют внутрибрюшинной инъекцией кетамина (60 мг / кг) и ксилазина (8 мг / кг) в зависимости от веса тела. Адекватная глубина анестезии должны определяться отрицательный ответ на носок щепотку стимула.
2. После того, как под наркозом, потяните язык вперед, чтобы предотвратить удушье и применять смазочные мази в оба глаза, чтобы предотвратить высыхание роговицы во время операции.
3. Бритье хирургические сайты, используя машинку для стрижки волос и протрите три раза 10% провидон-йод раствором моющего средства и 70% этанола.
4. Пелерина тон животное в стерильной зоне. Стерильные перчатки и хирургические инструменты используются во время операции выживания. Re стерилизации кончики инструментов с использованием горячей шарик стерилизатор между животными.

2. Хирургическое подход

1. Индукция ПИОН
   1. Катетеризация бедренной вены
      1. Подготовьте и очистите хирургическую сайт. Бритье правильную внутреннюю бедро, используя машинку для стрижки волос и протрите трижды, каждый раз 10% провидон-йод раствором моющего средства и 70% этанола.
      2. Подготовка трубки. Сокращение 40 см длины полиэтиленовой трубкой (ПЭ 10) стерилизуют в 70% -ном этаноле. Флеш трубки физиологическим раствором и подсоединить его к 1 мл шприц, содержащий предварительно измеренное раствор 2% красителя эритрозин В (1 мг / мкл, получая дозу 20 мг / кг массы тела). Установите шприц в ножного переключателя контролируется инфузионный насос установлен в размере 600 мкл / мин.
      3. Использование № 15 лезвием, сделать небольшой надрез на горизонтальнуюоснование правого бедра. Вырезать и распространять мембраны внутри и чистый район с стерильные ватные тампоны.
      4. Отделите мышцы щипцами, пока ветвь бедренной вены не видно. Оболочка окружает артерию, вену и нервы. Pinch и тянуть эту оболочку вверх щипцами (нормально-наконечник Дюмон щипцы) и вырезать небольшой разрез (2-4 мм обычно достаточно) вблизи основания треугольной формы клина с Vännäs весенних ножницами. Развернуть разрез по мере необходимости.
      5. Отдельные вену и артерию с тупым микрохирургические крюка, параллельном направлению вены. Будьте осторожны, чтобы не повредить нежные мембраны и вены ветви. Затем, осторожно поднимите вены и отделить его от основной соединительной ткани.
      6. Получить безыгольный нейлона шов и поместить его рядом с бедренной вены. Использование микро-хирургическая крюк, поднять вены и передать тонкой кончик пинцетом под дистальной области. Возьмите один конец нити и вытяните ее подвены. Перевязывать дистального вены плотно. Передать второй шов аналогичным образом в соответствии с проксимальной вены и сделать свободную узел.
      7. Сделайте небольшой надрез в вену возле дистального лигирования с Vännäs весенних ножницами. Разверните отверстие, как необходимую с тонкой наконечником пинцетом. Некоторые крови может протекать через разрез. Очистите хирургическую область с холодной, стерильной BSS и стерильным ватным тампоном.
      8. Проведение стенки вены на краю реза, катетер в сосуд с подготовленной физиологическим раствором промыть трубки с помощью иглодержатель. Затянуть ближний узел вокруг вены и трубки. Затем закрепить трубку, привязав его к дальнему шва.
      9. Проверьте качество катетеризации нажатием ножной переключатель, чтобы ввести физиологический раствор, <1 мл является адекватной. Убедитесь, что трубка свободна и не имеет утечек. Временно закрыть разрез со швами, чтобы защитить катетеризации и ткани.
   2. Воздействие зрительного нерва
      1. ДГОе место операции путем протирания предварительно выбритый участок над левым глазом трижды, каждый раз 10% провидон-иод раствором моющего средства и 70% этанола.
      2. Сделайте надрез по коже 2-3 мм позади глаз с № 15 лезвие. Pinch и поднимите соединительной ткани с зубчатыми щипцами, и сделать небольшой разрез с Vännäs весенних ножницами. Этот небольшой разрез, как правило, около 5 мм в длину, но может быть больше, чтобы обеспечить большую экспозицию для хирурга в обучении. Продолжайте прямо рассекать через ткани по соединительной верхней краю орбитальной кости, заботясь, чтобы избежать нарушения кровеносных сосудов. Очистите хирургическую область с ватными тампонами.
      3. Проанализируйте вниз через конъюнктиву, пока превосходит прямая мышца не видно. Pinch и анализировать через мышцу; мышцы будут освобождены от глубоко внутри орбиты. Теперь окружающие ткани могут быть использованы, чтобы помочь в отводе и высоты глаза для простоты визуализации.
      4. Ретракта лоскут кожи и соединительной ткани в поперечном направлении и вниз, и удерживать на месте с шва и кровоостанавливающего. Это будет вращать глаза вперед и наружу для того, чтобы выявить содержанием жира оболочку, которая окружает зрительный нерв.
      5. Осторожно вставить пару острых щипцов и расширения параллельно зрительного нерва, чтобы отделить соединительной ткани, окружающей оболочку. Не прикасайтесь зрительный нерв с острыми кончиками пинцета.
      6. Теперь Длина 5 мм зрительного нерва и окружающей оболочки должны быть видны. Сеть микрососудов на поверхности оболочки окружает зрительный нерв. Они будут направлены в процессе лазерного облучения.
   3. Внутривенное введение эритрозин В и лазерного облучения
      1. Носите оранжевых защитные очки на все времена во время работы лазерного излучения аппарата, чтобы оградить себя от зеленого лазерного света. Включите лазер, открыть затвор и отрегулируйте пик и средний НАЗRS лазера по мере необходимости. Закройте затвор.
      2. Расположите крысу в лазерного излучения аппарата. Для обеспечения правильного размещения света, слабый луч направленный производится пространственно фильтрации лазера через отверстие диаметром 100 мкм, пробуренной в закрытом лезвия затвора. Re-подвергайте зрительный нерв с парой тонких щипцов наконечник, и положение прицеливания луча на внутриорбитального зрительного нерва между 3 мм и 4 мм позади зрительного нерва.
      3. Вводят раствор 2% эритрозин В с помощью активации инфузионного насоса. Это может циркулировать в течение нескольких секунд, пока хирург добавляет небольшую каплю BSS, чтобы увлажнить поверхность зрительного нерва.
      4. Проверьте положение прицельной луча, а затем нажмите ножной выключатель, чтобы начать облучение. Обеспечением безопасности фильтр оранжевого цвета, который добавляется в оптическом пути микроскопом, будет немедленно срабатывает последовало открытие затвора с задержкой в ​​1 сек.
      5. Облучают зрительный нерв для 90 сек с максимальной мощностью 135mW и средней мощности 18mW создается пучком вертолет вращающейся на 250 Гц с рабочим циклом 15% (это сводит к минимуму тепловые эффекты). Желтый флуоресценции, визуализируется как ярко-оранжевого через фильтр безопасности, будут, излучаемый из верхней поверхности зрительного нерва и достаточно, чтобы гарантировать, что луч облучает нерв симметрично.
      6. После облучения, фильтр безопасности оранжевого цвета откроется автоматически. Microhemorrhage можно наблюдать в некоторых случаях.
      7. Сбросьте сцепление на дополнительных глазных мышц и вернуть глаза в нейтральное положение. Закрыть разрез с узловыми швами. Затем снять катетер и галстук бедренную вену плотно, чтобы предотвратить утечку; закрыть с узловыми швами. Применять мазь с антибиотиком для обеих разрезов. Проверьте глазного дна для проверки целостности сосудов центральной вены сетчатки и артерии.
2. Ретроградная Маркировкаганглиозных клеток сетчатки (РГК). Примечание: Для того, чтобы оценить RGC выживание, ретроградной маркировки с fluorogold (FG) должен быть завершен за неделю до пиона. Метод подробно описан в протоколе JOVE 819 ^13.
   1. Вкратце: анестезию животного кетамином (60 мг / кг) и ксилазина (8 мг / кг) и брить голову.
   2. Хирургическим скраб разрез сайт и сделать срединный разрез по голове, чтобы выставить череп.
   3. Дрель двусторонние отверстия в черепе (O 2x2 мм) 0,5 мм с обеих сагиттальной и поперечной швов.
   4. Тщательно аспирата мозговой контент, который лежит на спинной поверхности двухолмия (СК) с помощью вакуумного насоса. Затем поместите небольшой кусочек Gelfoam смоченную 4% FG на поверхности КА.
   5. Закрыть разрез со швами и уход за животным с помощью стандартного послеоперационный уход.
3. Послеоперационный уход и Эвтаназия
   1. После операции, поместите животное в отдельной клетке чистой на вершине рециркуляции нагретая вода площадку, пока животное не будет восстановлен.
   2. Послеоперационные анальгетики (бупренорфин HCl, 0,01 мг / кг) следует вводить два раза в день в течение трех последовательных дней, чтобы минимизировать дискомфорт.
   3. Крыса должна быть храниться отдельно и наблюдали, пока они не в состоянии поддерживать грудины лежачее положение и восстановить достаточно сознание.
   4. Признаки восстановления и здоровья не контролируется ежедневно в течение по крайней мере 5 дней после операции, или до тех пор, снятия швов и адекватного исцеления хирургической сайте, что наступит позднее.
   5. Усыпить животных от перфузии с 4% PFA на научно обоснованных временных точках после операции в соответствии с следственного интереса.

Результаты

В результате ишемического повреждения индуцируется этой техники дает постепенное, но выраженное смерть ганглиозных клеток сетчатки после ишемического повреждения аксонов. Это клинически значимых результат аналогичен тому, что наблюдается в человеческих болезней. Ф. ретроградной ма...

Обсуждение

Here we describe in detail a method for inducing PION in a rat model. The most critical part of the protocol is the exposure and irradiation of the optic nerve – to expose the nerve as long as possible while avoiding damage caused by the sharp fine tip forceps or from stretching. In rats, the ophthalmic artery enters the optic nerve ≤1 mm from the optic nerve head. Therefore, irradiation of the optic nerve 3-4 mm away from the optic nerve head should only result in ischemia of the capillaries feeding the nerv...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
532-nm Nd:YAG laser	Laser glow	LRS-532-KM-200-3
Beam chopper	custom-made	custom-made
Mechanical shutter and corresponding shutter drive timer	AAM Vincent Associates	SD-10
25-cm focal length spherical lens	CVI/Mellles-Griot	01 LPX 293	plano-convexBK7 glass lens with HEBBARTM antireflection coating
Erythrosin B	MP Biomedicals	190449
Fluorogold	Fluorochrome,LLC
Gelfoam	Cardinal Health	CAH1203421
Polyethylene tubing (PE10)	BD Intramedic	427400
No. 10 Blade	Miltex	4-110
Fine Forceps	F.S.T.	91150-20	DUMONT #5 RUSTLESS NON-MAGNETIC
Forceps with Teeth	F.S.T.	11153-10	Germany stainless
Forceps	F.S.T.	18025-10	Germany stainless
Vannas spring scissors	F.S.T.	2-220	JJECK Stainless
Polyglactin suture	Ethicon	J488G	7-0 suture
hemostat	F.S.T.	12075-12	Germany stainless