Физиология Лаборатория Демонстрация: клубочковой фильтрации у крыс

Резюме

The purpose of this protocol is to demonstrate the principles and techniques for measuring and calculating glomerular filtration rate, urine flow rate, and excretion of sodium and potassium in a rat. This demonstration can be used to provide students with an overall conceptual understanding of how to measure renal function.

Аннотация

Measurements of glomerular filtration rate (GFR), and the fractional excretion of sodium (Na) and potassium (K) are critical in assessing renal function in health and disease. GFR is measured as the steady state renal clearance of inulin which is filtered at the glomerulus, but not secreted or reabsorbed along the nephron. The fractional excretion of Na and K can be determined from the concentration of Na and K in plasma and urine. The renal clearance of inulin can be demonstrated in an anesthetized animal which has catheters in the femoral artery, femoral vein and bladder. The equipment and supplies used for this procedure are those commonly available in a research core facility, and thus makes this procedure a practical means for measuring renal function. The purpose of this video is to demonstrate the procedures required to perform a lab demonstration in which renal function is assessed before and after a diuretic drug. The presented technique can be utilized to assess renal function in rat models of renal disease.

Введение

The most important function of the kidney is the homeostatic regulation of extracellular water and electrolyte content. The kidneys closely regulate extracellular water, sodium (Na) and potassium (K) to maintain normal physiological levels. Disturbances in renal function can result in serious metabolic disorders which can be fatal. The basic renal process occurs in the nephron and begins with the filtration of plasma at the glomerulus and ends with the excretion of urine. Other processes that determine the final concentration of water, Na and K in the urine are secretion and reabsorption within the nephron. Measurements of glomerular filtration rate (GFR) and the fractional excretion of Na and K are critical in assessing renal function in health and disease. The reader is referred to previously published review articles and textbooks for a more thorough discussion of kidney function^1-4.

GFR can be measured as the steady state renal clearance of inulin which is filtered at the glomerulus, but not secreted or reabsorbed along the nephron⁵. While this technique requires anesthesia, surgical preparation, and a terminal experiment, it is considered the gold standard of GFR measurement. Using inulin that is tagged with fluorescein-isothiocyanate (FITC), plasma and urine concentration of FITC-inulin can be easily measured in small volumes and used to calculate GFR during multiple time points of an experiment. The fractional excretion of Na and K can be determined from the concentration of Na and K in plasma and urine.

The conceptual understanding of how to measure renal function can easily be demonstrated in a short lab designed to allow students to actively participate in some aspects of the experiment. This video depicts the pre-lab preparation, the renal function demonstration, and the post-lab evaluation of results. The surgical techniques necessary for making measurements of GFR are demonstrated in an anesthetized rat. In addition, example calculations for GFR, and the fractional excretion of Na and K are shown before and after administration of a diuretic drug.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

До любой процедуры животных, уход за животными институциональная и использование комитет (IACUC) должен утвердить протокол. Этот протокол был одобрен Университет штата Мичиган IACUC.

1. Предварительная подготовка лаборатории FITC-инулин решения

1. Теплые 20 мл физиологического раствора до 70 ° С и медленно перемешивают в 100 мг FITC-инулин (5 мг / мл FITC-инулин), пока все инулин не растворится.
2. Холодный раствор до комнатной температуры и добавить 800 мг бычьего сывороточного альбумина (40 мг / мл БСА, лиофилизированный порошок, по существу, глобулина, низкое эндотоксин, ≥98% чистоты электрофорезом в агарозном геле).
3. Фильтр инулин-BSA решение с фильтровальной бумаги (сорт 1). Поместите отфильтрованного раствора в 20 мл шприц с шприц-фильтр наконечника (0,2 мкм) и накрыть фольгой, чтобы защитить от света.

2. Анестезия и хирургия

1. Поместите крысу в индукционной камере, заполненной 5% изофлуран для индукции анестезии. Запись Совет директорову вес (250-350 г) и поместить крысу на платформе хирургической нагретого предназначена для поддержания 37 ° С температуру тела в течение всего эксперимента. Аккуратно закрепите крысу на платформу с лабораторным ленты на лапах. Поддержание анестезии с 1-2% изофлуран с медицинской ранга 100% O ₂ при скорости воздушного потока 0,8-1,0 л / мин.
2. Вставьте коническую катетер (внутрисосудистого наконечник OD, 2.7F) в бедренную артерию для кровяного давления и сердечного ритма мониторинга и отбора проб крови.
3. Вставьте катетер (РЕ-50) в бедренную вену для инулина инфузии. Закрепите катетер окружающие ткани с 5-О плетеные шелковой хирургической нити ^6.
4. Прикрепите артериальный катетер с тензометрическим избыточного давления. Запись кровяное давление и частоту сердечных сокращений с помощью программного обеспечения сбора данных и отображение на экране компьютера в режиме реального времени. Этот метод показал подробно на видео ^6.
5. Expose мочевого пузыря с помощью надлобковой разрез. Вырезать небольшойотверстие в кончике мочевого пузыря и вставить канюлю (РЕ-190) с тепловой вспыхнул наконечник внутри мочевого пузыря для сбора мочи. Закрепите канюли мочевого пузыря с кошелька струн шва.

3. Моча и забор крови

1. Поместите шприц FITC-инулин в шприцевой насос с расходом набор 1 мл / ч на 100 г массы тела (3 мл / ч для крысы весом 300 г). Прикрепите шприц к бедренной вены катетер. Начните инулина настой и позволяют период уравновешивания 1-2 ч. Держите шприц покрытый фольгой, чтобы защитить от света.
2. Определить, если скорость потока мочи является стабильным и достаточно для анализа образца (20 мкл / мин) путем сбора мочи в предварительно взвешенную пробирку для сбора в течение 10 мин. Определить объем мочи гравиметрическим с цифровой шкалой. Адекватный объем мочи в течение 10 мин сбора составляет 0,2 мл. Продолжайте собирать образцы мочи до двух последовательных коллекции не указать скорость потока мочи от 20 мкл / мили более.
3. Образцы предварительно наркотиков
   1. Соберите образец мочи в течение периода 20 мин. Собирают пробы крови (0,5 мл) с артериальным катетером в середине периода сбора мочи. Будьте осторожны, чтобы полностью очистить артериального катетера физиологического раствора перед сбором образца крови в пробирку, содержащую сбора 1 U гепарина. Используйте сбора флаконов с маркировкой объема для облегчения сбора 0,5 мл артериальной крови.
   2. Флеш артериальный катетер с гепарин-физиологический раствор (20 ед / мл), чтобы удалить катетер крови (прибл. 0,1 мл). Длина артериальный катетер должен быть как можно короче, чтобы ограничить объем физиологического раствора гепарин-необходимого для очистки.
      Примечание: Разведенные образцы крови производят неточные расчеты СКФ и фракционной экскреции Na и К.
   3. Подождите 10 мин, и повторить сбор мочи второго предварительного наркотиков и пробы крови.
4. После сбора двух образцов Предварительная наркотиков, администрировать мочегонным Дрюг, фуросемид (10 мг / кг), через артериальный катетер. Промойте артериальный катетер с гепарином физиологического раствора, чтобы очистить катетер препарата. Позаботьтесь, чтобы предотвратить инъекции воздуха через артериальный катетер. Запишите время на фуросемид инъекции.
5. Образцы после наркотиков: На каждом из 3 временных точках ниже, собирают мочу в течение периода сбора 10 мин, и пробы крови (0,5 мл) в середине периода сбора мочи.
   1. Для пост-наркотическими образца 1 - собрать пять минут после фуросемида.
   2. Для пост-наркотическими Пример 2 - собрать десять минут после фуросемида.
   3. Для образца Сообщение с наркотиками 3 - собрать пятнадцать минут после фуросемида.
6. После того как все образцы были собраны, усыпить крысу в соответствии с институциональными процедурами по торакотомии и удаления сердца. Снимите обе почки. Decapsulate (удалить окружающий мембрану) и промокните почки, чтобы удалить лишнюю кровь. Взвесьте почки.

4. Анализ проб

1. Измерьте все объемы проб мочи гравиметрически с цифровой шкале, и записывать вес.
2. Центрифуга образцы цельной крови с настольной центрифуге (1800 XG), чтобы отделить плазму. Перевести образцы плазмы малых маркированных флаконах.
3. Анализ концентрации Na и К в моче и плазме образцов с помощью анализатора натрия / калия.
4. Измерение FITC-инулина в плазме и моче
   1. Развести мочу до наркотиков (от 1: 200 до 1: 400) и моче после лекарственной (1:10) с HEPES буфера (500 мМ, рН 7,4).
   2. Добавить 40 мкл стандарта или пробы и 60 мкл HEPES буфера в 96-луночный планшет (один образец на лунку) и позволяют смешиваться в течение 10 мин, а покрытые алюминиевой фольгой.
   3. Создание стандартной кривой для FITC-инулин для концентрации 6,25, 12,5, 25, 50, 100, 200, 400 мкг / мл (рис 1). Определить FITC-инулин флуоресценции в образцах и стандартам с использованием планшетного с эксцитата и выбросов длины волн 485 и 538 нм, соответственно.
   4. Установите флуоресцентные значения стандартов в 4-параметра Я логистической функции регрессионного анализа. Параметры функции регрессии используются для вычисления концентрации ФИТЦ-инулин в плазме и моче образцов (таблица 1).

5. После лабораторного анализа результатов: Расчеты

1. Рассчитать скорость потока мочи (UV; мл / мин): [объем собранной мочи (мл)] ÷ [время сбора (мин)]
2. Рассчитать клубочковой фильтрации (СКФ; мл / мин): [Моча концентрация инулина (мкг / мл) х UV (мл / мин)] ÷ [плазменным инулин конц. (Мкг / мл)]
3. Рассчитать Filtered нагрузки натрия (мкмоль / мин): концентрация натрия плазмы (мкмоль / мл) х СКФ (мл / мин)
4. Рассчитать натрия экскреции Оценить (U _Na V; мкмоль / мин): Моча концентрация натрия (мкмоль / мл) х UV (мл / мин)
5. Рассчитать фракционная экскреция натрия (Na FE;%): [U _Na V (мкмоль / мин)] ÷ [Отфильтрованный нагрузки натрия (мкмоль / мин)] х 100
6. Рассчитать Отфильтровано калия Load (мкмоль / мин): концентрация калия в плазме (мкмоль / мл) х СКФ (мл / мин)
7. Рассчитать калия экскреции Оценить (U _K V; мкмоль / мин): Моча концентрация калия (мкмоль / мл) х UV (мл / мин)
8. Рассчитать фракционная экскреция калия (K FE;%): [U _К V (мкмоль / мин)] ÷ [с фильтром калия нагрузки (мкмоль / мин)] х 100

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Мочегонное используется в лабораторной демонстрации был фуросемид, который очень быстро ингибирует реабсорбцию Na и K фильтруется почками, что приводит к увеличению Na, К и воды экскреции в течение нескольких минут введения препарата. По его основного механизма, фуросемид должна иметь м...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Соответствующий маркер для измерения СКФ должны соответствовать четырем критериям: быть свободно фильтруется в клубочках, несвязанного быть с белками плазмы, и ни поглощается ни секретируется в нефрона. Инулин фруктозы полимер, который удовлетворяет этим критериям. В результате, поч?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-0 Braided Silk Surgical Suture	Surgical Specialties Corp	SP1033
Assay Plate, 96-Well	Costar	3922
Bovine Serum Albumin	Sigma Chemical Co	A2934-25G
Centrifuge	Beckman Coulter	MicroFuge 18, 357160
Conical Sample Tubes	Dot Scientific Inc.	#711-FTG
Cotton Tipped Applicators	Solon Manufacturing Co	56200
Data Acquisition Software	ADInstruments	LabChart Pro 7.0
Digital Scale	Denver Instrument	APX-4001
FITC-Inulin	Sigma Chemical Co	F3272-1G
Gauze Sponges	Covidien	2146
Heated Surgical Bed	EZ-Anesthesia	EZ-212
Heparin	Sagnet	NDC 25021-402-10
HEPES	Sigma Chemical Co	H3375
Isoflurane	Abbott Animal Health	IsoFlo, 5260-04-05
Isoflurane Vaporizer	EZ-Anesthesia	EZ-190F
Micro Dissecting Forceps	Biomedical Research Instruments Inc.	70-1020
Microplate Reader - Fluoroskan	ThermoScientific	Ascent FL, 5210460
NOVA 5+ Sodium/Potassium Analyzer	NOVA BioMedical	14156
Olsen-Hegar Needle Holders with Scissors	Fine Science Tools	12002-12
PE-190 (for bladder catheter)	BD Medical	427435
Pressure Transducer	ADInstruments	MLT1199
Pyrex Culture Tubes	Corning Inc.	99445-12
Rat Femoral Tapered Artery Catheter	Strategic Applications Inc.	RFA-01
Salix Furosemide 5%	Intervet	#34-478
Strabismus Scissors	Fine Science Tools	14075-11
Student Surgical Scissors	Fine Science Tools	91402-12
Surgical Gloves	Kimberly-Clark	Sterling Nitrile Gloves
Syringe pump	Razel Scientific	R99-E
Tissue Forceps	Fine Science Tools	91121-12
Tissue Scissors	George Tiemann  Co	105-420
5-0 Braided Silk Surgical Suture Surgical Specialties Corp SP1033 Assay Plate, 96-Well Costar  3922 Bovine Serum Albumin Sigma Chemical Co A2934-25G Centrifuge Beckman Coulter MicroFuge 18, 357160 Conical Sample Tubes Dot Scientific Inc.  #711-FTG Cotton Tipped Applicators Solon Manufacturing Co 56200 Data Acquisition Software ADInstruments LabChart Pro 7.0 Digital Scale  Denver Instrument APX-4001 FITC-Inulin Sigma Chemical Co F3272-1G Gauze Sponges Covidien 2146 Heated Surgical Bed EZ-Anesthesia EZ-212 Heparin Sagnet NDC 25021-402-10 HEPES Sigma Chemical Co H3375 Isoflurane Abbott Animal Health IsoFlo, 5260-04-05 Isoflurane Vaporizer EZ-Anesthesia EZ-190F Micro Dissecting Forceps Biomedical Research Instruments Inc. 70-1020 Microplate Reader - Fluoroskan ThermoScientific Ascent FL, 5210460 NOVA 5+ Sodium/Potassium Analyzer NOVA BioMedical 14156 Olsen-Hegar Needle Holders with Scissors Fine Science Tools 12002-12 PE-190 (for bladder catheter) BD Medical 427435 Pressure Transducer  ADInstruments MLT1199 Pyrex Culture Tubes Corning Inc. 99445-12 Rat Femoral Tapered Artery Catheter Strategic Applications Inc. RFA-01 Salix Furosemide 5% Intervet #34-478 Strabismus Scissors Fine Science Tools 14075-11 Student Surgical Scissors Fine Science Tools 91402-12 Surgical Gloves Kimberly-Clark Sterling Nitrile Gloves Syringe pump Razel Scientific R99-E Tissue Forceps Fine Science Tools 91121-12 Tissue Scissors George Tiemann  Co 105-420