생리학 실험실 데모 : 쥐의 사구체 여과 속도

요약

The purpose of this protocol is to demonstrate the principles and techniques for measuring and calculating glomerular filtration rate, urine flow rate, and excretion of sodium and potassium in a rat. This demonstration can be used to provide students with an overall conceptual understanding of how to measure renal function.

초록

Measurements of glomerular filtration rate (GFR), and the fractional excretion of sodium (Na) and potassium (K) are critical in assessing renal function in health and disease. GFR is measured as the steady state renal clearance of inulin which is filtered at the glomerulus, but not secreted or reabsorbed along the nephron. The fractional excretion of Na and K can be determined from the concentration of Na and K in plasma and urine. The renal clearance of inulin can be demonstrated in an anesthetized animal which has catheters in the femoral artery, femoral vein and bladder. The equipment and supplies used for this procedure are those commonly available in a research core facility, and thus makes this procedure a practical means for measuring renal function. The purpose of this video is to demonstrate the procedures required to perform a lab demonstration in which renal function is assessed before and after a diuretic drug. The presented technique can be utilized to assess renal function in rat models of renal disease.

서문

The most important function of the kidney is the homeostatic regulation of extracellular water and electrolyte content. The kidneys closely regulate extracellular water, sodium (Na) and potassium (K) to maintain normal physiological levels. Disturbances in renal function can result in serious metabolic disorders which can be fatal. The basic renal process occurs in the nephron and begins with the filtration of plasma at the glomerulus and ends with the excretion of urine. Other processes that determine the final concentration of water, Na and K in the urine are secretion and reabsorption within the nephron. Measurements of glomerular filtration rate (GFR) and the fractional excretion of Na and K are critical in assessing renal function in health and disease. The reader is referred to previously published review articles and textbooks for a more thorough discussion of kidney function^1-4.

GFR can be measured as the steady state renal clearance of inulin which is filtered at the glomerulus, but not secreted or reabsorbed along the nephron⁵. While this technique requires anesthesia, surgical preparation, and a terminal experiment, it is considered the gold standard of GFR measurement. Using inulin that is tagged with fluorescein-isothiocyanate (FITC), plasma and urine concentration of FITC-inulin can be easily measured in small volumes and used to calculate GFR during multiple time points of an experiment. The fractional excretion of Na and K can be determined from the concentration of Na and K in plasma and urine.

The conceptual understanding of how to measure renal function can easily be demonstrated in a short lab designed to allow students to actively participate in some aspects of the experiment. This video depicts the pre-lab preparation, the renal function demonstration, and the post-lab evaluation of results. The surgical techniques necessary for making measurements of GFR are demonstrated in an anesthetized rat. In addition, example calculations for GFR, and the fractional excretion of Na and K are shown before and after administration of a diuretic drug.

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프로토콜

전에 어떤 동물 절차, 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 프로토콜을 승인해야합니다. 이 프로토콜은 미시간 주립 대학 IACUC 승인을 받았다.

FITC - 이눌린 솔루션 1. 사전 실험 준비

1. 모든 이눌린이 용해 될 때까지 천천히 따뜻한 20 ~ 70 ° C의 식염수 용액 및 FITC - 이눌린 (5 ㎎ / ㎖ FITC - 이눌린) 100 mg을 안으로 약동.
2. 차가운 용액을 RT 및 소 혈청 알부민의 800 mg을 추가 (40 ㎎ / ㎖ BSA, 동결 건조 분말, 본질적으로 아가 로스 겔 전기 영동에 의해 무료, 낮은 내 독소, ≥98 % 순도 글로불린).
3. 여과지 (1 등급)과 이눌린-BSA 솔루션을 필터링합니다. 주사기 팁 필터 (0.2 μm의)와 20 ML의 주사기에서 여과 된 용액을 넣고 빛으로부터 보호하기 위해 호일로 커버한다.

2. 마취 및 수술

1. 마취를 유도하기 위해 5 %의 이소 플루 란 가득 유도 챔버에서 쥐를 놓습니다. 기록 죽인다Y 중량 (250~350g)와 실험을하는 동안 37 ° C의 체온을 유지하기위한 가열 외과 플랫폼 쥐 놓는다. 조심스럽게 발을 통해 실험실 테이프로 플랫폼에 쥐를 고정합니다. 0.8-1.0 L / 분의 공기 흐름 속도로 의료 학년 100 % O _2와 1 ~ 2 %의 이소 플루 란으로 마취를 유지한다.
2. 혈압과 심장 박동 모니터링, 혈액 샘플링에 대한 대퇴 동맥에 테이퍼 카테터 (혈관 팁 외경, 2.7F)를 삽입합니다.
3. 이눌린 주입에 대한 대퇴 정맥에 카테터 (PE-50)를 삽입합니다. 5-O 꼰 실크 수술 봉합사 ^(6)와 주변 조직에 카테터를 고정합니다.
4. 스트레인 게이지 압력 변환기에 동맥 카테터를 연결. 녹음 혈압 실시간으로 컴퓨터 스크린상에서의 데이터 수집 소프트웨어를 이용하여 디스플레이 및 심박수. 이 기술은 비디오 ^6에 상세하게 설명된다.
5. 치골 상부 절개를 통해 방광을 노출. 작은 컷방광의 끝 부분에 구멍 열을 캐 뉼러 (PE-190)를 삽입 소변 수집 방광 내부의 팁 플레어. 지갑 문자열 봉합과 방광에 캐 뉼러를 고정합니다.

3. 소변 및 혈액 수집

1. (300g 무게 쥐에 대한 3 ㎖ / 시간)를 체중 100g 당 1 ㎖ / hr의 유량 설정 주사기 펌프에 FITC - 이눌린의 주사기를 놓습니다. 대퇴 정맥 카테터에 주사기를 연결합니다. 이눌린의 주입을 시작하고 1 ~ 2 시간의 평균 기간을 허용합니다. 빛으로부터 보호하기 위해 호일로 덮여 주사기를 유지합니다.
2. 소변 유량이 안정하고 10 분 동안 예비 칭량 수집 바이알에 소변 시료를 수집하여 분석 샘플 (20 μL / 분)에 적합한 지 여부를 결정. 디지털 규모 중량 측정 소변의 양을 결정합니다. 10 분 동안 수거 적절한 소변 부피는 0.2 ml 인 것을. 두 개의 연속 콜렉션 20 μL / m의 소변 유량을 나타낼 때까지 소변을 채취 계속또는 더.
3. 사전 의약품 샘플
   1. 20 분 기간 동안 소변 시료를 수집. 소변 수집 기간의 중간 지점에서 동맥 카테터로부터 혈액 시료 (0.5 ml)에 수집. 1 U 헤파린를 포함한 컬렉션 유리 병에 혈액 샘플을 수집하기 전에 식염수 완전히 명확 동맥 카테터에주의해야합니다. 동맥혈 0.5ml의 수집을 용이하게하기 위해 볼륨 표시와 수집 튜브를 사용한다.
   2. 피 (약. 0.1 ㎖)의 카테터을 취소 헤파린 식염수 (20 U / mL)로 동맥 카테터를 플래시합니다. 플러시 할 필요 헤파린 식염수의 부피를 제한하기 위해 가능한 동맥 카테터의 길이가 짧아야한다.
      참고 : 희석 된 혈액 샘플은 사구체 여과율과 나 그리고 케이의 분수 배설의 부정확 한 계산을 생산
   3. 10 분을 기다린 두 번째 사전 약물 소변과 혈액 샘플의 수집을 반복합니다.
4. 두 사전 약물 샘플의 수집을 따르면, 이뇨제 DRU 관리g, 푸로 세 미드 (10 ㎎ / ㎏), 동맥 카테터를 통해. 약물의 카테터을 취소 헤파린 식염수 동맥 카테터를 플래시합니다. 동맥 카테터를 통해 공기의 주입을 방지하기 위해주의해야합니다. 푸로 세 미드 주입의 시간을 기록한다.
5. 포스트 - 약물 샘플 아래 3 시점들 각각에서, 10 분간 수거 기간 소변 샘플 및 뇨 수집 기간의 중간 지점에서 혈액 샘플 (0.5 ㎖)에 모은다.
   1. 후 약물 샘플 1 - 후 푸로 세 미드 다섯 분을 수집합니다.
   2. 후 약 샘플 2의 - 후 푸로 세 미드 십 분을 수집합니다.
   3. 후 약물 샘플 3의 - 후 푸로 세 미드 십오 분을 수집합니다.
6. 모든 샘플을 수집 한 후, 개흉하고 심장을 제거함으로써 제도적 절차에 따라 래트를 안락사. 모두 신장을 제거합니다. 디 캡슐은 (주변 막 제거) 및 초과 혈액을 제거하는 신장시킨다. 신장의 무게를.

4. 샘플 분석

1. 모든 중량 측정 디지털 스케일과 소변 샘플 볼륨, 기록의 무게를 측정한다.
2. 테이블 탑 원심 분리기 (1800 XG)와 원심 전혈 시료는 혈장을 분리한다. 작은 유리 병 라벨에 플라즈마 샘플을 전송합니다.
3. 나트륨 / 칼륨 분석기 소변과 혈장 시료에서 나와 K 농도를 분석합니다.
4. 혈장과 소변에서 FITC - 이눌린의 측정
   1. 전 소변 약물을 희석하고 HEPES 완충액 (500 mM의, pH 7.4의)와 후 약물 소변 (1시 10분) (1 : 400 : 200-1).
   2. 96 웰 플레이트 (물론 당 하나의 샘플)에 HEPES 버퍼의 표준 또는 샘플 60 μL의 40 μl를 추가하고 알루미늄 호일로 덮여 동안 10 분 동안 혼합 할 수 있습니다.
   3. 농도에 대한 FITC - 이눌린에 대한 표준 곡선을 생성 6.25, 12.5, 25, 50, 100, 200, 400 μg의 / ㎖ (도 1). EX와 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 시료와 표준에 FITC - 이눌린 형광을 결정각각 485과 538 나노 미터의 인용 및 방출 파장.
   4. 4 있었던 파라미터 물류 기능 회귀 분석 표준에 대한 형광 값을 맞 춥니 다. 회귀 함수 파라미터는 플라즈마 및 소변 샘플 (표 1)에 FITC-이눌린 농도를 계산하는데 사용된다.

결과 5. 후 실험실 분석 : 계산

1. (UV를; ㎖ / 분) 소변 유량을 계산한다 [소변 수집 부피 (㎖)] ÷ [콜렉션의 시간 (분)]
2. 사구체 여과 속도 계산 (GFR을, ml / 분) ÷ [플라즈마 이눌린 진한 [소변 이눌린 농도 (μg의 / ㎖) UV (ml / 분) X]를. (μg의 / ㎖)]
3. 혈장 나트륨 농도 (μmol / ㎖) × GFR (㎖ / 분) : 필터링 나트륨로드 (μmol / 분)을 계산
4. 나트륨 배설 속도 (U _나 V를; μmol / 분) 계산 : 소변 나트륨 농도 (μmol / ㎖) (㎖ / 분)을 X UV
5. 계산 나트륨의 소수 배설 (FE 나, %)[U _나 V (μmol / 분)] ÷ [필터링 나트륨로드 (μmol / 분)] × 100
6. 필터링 칼륨로드 (μmol / 분)를 계산 : 혈장 칼륨 농도 (μmol / ㎖ 것은) GFR을 X (ml / 분)
7. 칼륨 배설 속도 (U V를 _K; μmol / 분) 계산 : 소변 칼륨 농도 (μmol / ㎖) (㎖ / 분)을 X UV
8. 계산 칼륨의 배출율 (FE K; %) : [U V _K (μmol / 분)] ÷ [필터링 칼륨로드 (μmol / 분)] × 100

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결과

실험실 데모에 사용되는 이뇨제는 매우 신속하게 약물 투여의 분 이내에 증가 나, K의 결과 신장, 물 배설에 의해 필터링 나와 K의 재 흡수를 억제 푸로 세 미드이었다. 그것의 기본 메커니즘에 의해, 푸로 세 미드는 사구체 여과율과 나 그리고 K의 필터링 된 부하에 최소한의 영향을해야하지만, 나 그리고 케이의 소변 흐름과 분수 배설을 증가

마취 된 래트에서, GFR위한 예비 ?...

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토론

4 가지 기준을 충족시켜야 GFR 측정 적절한 마커 : 자유롭게 사구체에서 여과 될, 혈장 단백질에 결합되지 않은, 그리고 둘 흡수하지도 네프론으로 분비 될 수있다. 이눌린은 이러한 기준을 만족 과당 중합체이다. 그 결과, 신장 이눌린 클리어런스 GFR ⁷ 측정 금 표준 여겨진다. 입증 기술은 이눌린 ^8,9의 지속적인 주입하는 동안 시간 제한 소변 컬렉션을 사용하여 이눌린의 신장 클리?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-0 Braided Silk Surgical Suture	Surgical Specialties Corp	SP1033
Assay Plate, 96-Well	Costar	3922
Bovine Serum Albumin	Sigma Chemical Co	A2934-25G
Centrifuge	Beckman Coulter	MicroFuge 18, 357160
Conical Sample Tubes	Dot Scientific Inc.	#711-FTG
Cotton Tipped Applicators	Solon Manufacturing Co	56200
Data Acquisition Software	ADInstruments	LabChart Pro 7.0
Digital Scale	Denver Instrument	APX-4001
FITC-Inulin	Sigma Chemical Co	F3272-1G
Gauze Sponges	Covidien	2146
Heated Surgical Bed	EZ-Anesthesia	EZ-212
Heparin	Sagnet	NDC 25021-402-10
HEPES	Sigma Chemical Co	H3375
Isoflurane	Abbott Animal Health	IsoFlo, 5260-04-05
Isoflurane Vaporizer	EZ-Anesthesia	EZ-190F
Micro Dissecting Forceps	Biomedical Research Instruments Inc.	70-1020
Microplate Reader - Fluoroskan	ThermoScientific	Ascent FL, 5210460
NOVA 5+ Sodium/Potassium Analyzer	NOVA BioMedical	14156
Olsen-Hegar Needle Holders with Scissors	Fine Science Tools	12002-12
PE-190 (for bladder catheter)	BD Medical	427435
Pressure Transducer	ADInstruments	MLT1199
Pyrex Culture Tubes	Corning Inc.	99445-12
Rat Femoral Tapered Artery Catheter	Strategic Applications Inc.	RFA-01
Salix Furosemide 5%	Intervet	#34-478
Strabismus Scissors	Fine Science Tools	14075-11
Student Surgical Scissors	Fine Science Tools	91402-12
Surgical Gloves	Kimberly-Clark	Sterling Nitrile Gloves
Syringe pump	Razel Scientific	R99-E
Tissue Forceps	Fine Science Tools	91121-12
Tissue Scissors	George Tiemann  Co	105-420
5-0 Braided Silk Surgical Suture Surgical Specialties Corp SP1033 Assay Plate, 96-Well Costar  3922 Bovine Serum Albumin Sigma Chemical Co A2934-25G Centrifuge Beckman Coulter MicroFuge 18, 357160 Conical Sample Tubes Dot Scientific Inc.  #711-FTG Cotton Tipped Applicators Solon Manufacturing Co 56200 Data Acquisition Software ADInstruments LabChart Pro 7.0 Digital Scale  Denver Instrument APX-4001 FITC-Inulin Sigma Chemical Co F3272-1G Gauze Sponges Covidien 2146 Heated Surgical Bed EZ-Anesthesia EZ-212 Heparin Sagnet NDC 25021-402-10 HEPES Sigma Chemical Co H3375 Isoflurane Abbott Animal Health IsoFlo, 5260-04-05 Isoflurane Vaporizer EZ-Anesthesia EZ-190F Micro Dissecting Forceps Biomedical Research Instruments Inc. 70-1020 Microplate Reader - Fluoroskan ThermoScientific Ascent FL, 5210460 NOVA 5+ Sodium/Potassium Analyzer NOVA BioMedical 14156 Olsen-Hegar Needle Holders with Scissors Fine Science Tools 12002-12 PE-190 (for bladder catheter) BD Medical 427435 Pressure Transducer  ADInstruments MLT1199 Pyrex Culture Tubes Corning Inc. 99445-12 Rat Femoral Tapered Artery Catheter Strategic Applications Inc. RFA-01 Salix Furosemide 5% Intervet #34-478 Strabismus Scissors Fine Science Tools 14075-11 Student Surgical Scissors Fine Science Tools 91402-12 Surgical Gloves Kimberly-Clark Sterling Nitrile Gloves Syringe pump Razel Scientific R99-E Tissue Forceps Fine Science Tools 91121-12 Tissue Scissors George Tiemann  Co 105-420