Альгинат инкапсуляции плюрипотентных стволовых клеток, используя коаксиальный Насадка

Резюме

We established a method of encapsulating pluripotent stem cells (PS cells) into alginate hydrogel capsules using a co-axial nozzle. This prevents cells from aggregating excessively and limits the shear stress experienced by cells in suspension culture. The technique is applicable to the mass production of PS cells as well as research on stem cell niche.

Аннотация

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening. However, the development of a mass culture system would be required for using PS cells in these applications. Suspension culture is one promising culture method for the mass production of PS cells, although some issues such as controlling aggregation and limiting shear stress from the culture medium are still unsolved. In order to solve these problems, we developed a method of calcium alginate (Alg-Ca) encapsulation using a co-axial nozzle. This method can control the size of the capsules easily by co-flowing N₂ gas. The controllable capsule diameter must be larger than 500 µm because too high a flow rate of N₂ gas causes the breakdown of droplets and thus heterogeneous-sized capsules. Moreover, a low concentration of Alg-Na and CaCl₂ causes non-spherical capsules. Although an Alg-Ca capsule without a coating of Alg-PLL easily dissolves enabling the collection of cells, they can also potentially leak out from capsules lacking an Alg-PLL coating. Indeed, an alginate-PLL coating can prevent cellular leakage but is also hard to break. This technology can be used to research the stem cell niche as well as the mass production of PS cells because encapsulation can modify the micro-environment surrounding cells including the extracellular matrix and the concentration of secreted factors.

Введение

Induced pluripotent stem cells (iPS cells) are currently the source of intense research due to their role in regenerative medicine. However, huge amounts of cells are required for tissue regeneration. For instance approximately one billion pancreatic cells required for a type 1 diabetic patient¹. However, conventional dish culture is only able to obtain 1 × 10⁵ cells/cm², thus requiring 1 m² of culture area to obtain enough stem cell-derived pancreatic cells to treat a type 1 diabetic patient. The development of a system for the mass-culture of pluripotent stem cells, such as microcarrier² and suspension culture is therefore required for regenerative medicine. Suspension culture represents a promising method of mass culture but controlling the aggregation of cells is challenging in direct suspension cultures of human iPS cells³. Indeed, suspended cells are exposed to shear stress, which causes cell damage³ or differentiation⁴.

Research into hydrogel-based encapsulation has been conducted to solve problems associated with suspension culture. In hydrogel capsules, cells are protected from the flow of the medium. Previous reports have documented the use of various types of hydrogel, including agarose⁵, PEG⁶, and alginate (Alg), for cellular encapsulation. Alg-Ca hydrogel is one of the most useful hydrogels for cell encapsulation because Alg−Ca hydrogel is formed immediately after dropping alginate solution into a CaCl₂ solution and is also readily digested by enzymes or chelating reagents.

Here, we have established a stable alginate encapsulation process for iPS cells using a co-axial nozzle. By using N₂ gas flow for forming droplets, it is possible to encapsulate cells into uniform capsules without the need for other reagents such as oil. In this method, the flow rate of N₂ and concentration of both CaCl₂ and alginate are the major operating conditions affecting the size, shape, and uniformity of capsules. This report demonstrates the optimization of these operating conditions through the use of a hi-speed camera and a microscope.

протокол

1. Подготовка материалов

1. Подготовьте 10 мм HEPES буфера. Доводят рН до 7,0 при комнатной температуре и добавляют NaCl до 0,9%.
2. Готовят 5% раствора альгината и раствора 10 мМ ЭДТА, смешивая HEPES-буферный солевой раствор, приготовленный в 1,1. Доводят рН до 7,0 при комнатной температуре.
3. Автоклав реагенты (1.1, 1.2) в течение 20 мин при 121 ° С.
4. Подготовьте желатин покрытием 60 мм блюда, покрытые 1,2 - 2,0 × 10 ⁶ мышиных эмбриональных фибробластов (MEF) клеток, которые рассматриваются как фидерных клеток путем инкубации в течение DMEM, содержащей 10% ES-высококвалифицированных FBS и 10 мкг / мл митомицина С в течение 90 - 120 мин.
5. Поддерживать мыши индуцированной плюрипотентных стволовых (плюрипотентных) клеток на блюдо с питающими клетками в присутствии 5 мл DMEM высокий уровень глюкозы, содержащей 20% ES-квалифицированным FBS, 50 мкМ 2-меркаптоэтанола, несущественные аминокислоты, и антибиотиков ( 100 ед / мл пенициллина G натрия, 100 мкг / мл стрептомицина сульфата и 250 нг / мл amphoteriCIN Б).
6. Семя 4 х 10 ⁵ клеток плюрипотентных на желатин покрытием 60 мм блюдо и инкубировать их при 37 ° С и 5% CO _2. Изменить культуральной среде каждый день во время инкубации. Через 3 - 4 дней культивирования клеток Trypsinize в течение 1 мин с 500 мкл 0,05% трипсина, содержащий 0,02% ЭДТА при 37 ° С и 5% СО _2. После этого отделить клетки нажав культуре блюдо десять раза.
7. Добавить 2,5 мл DMEM с 10% ES-квалифицированный ФБС и антибиотики (следующие плюрипотентных клеток мыши диссоциации в отдельных клеток с помощью пипетки с 1000 мкл микропипетки три раза) центрифуги клеточной суспензии при 160 × г в течение 3 мин и удалить супернатант, и подсчет клеток , После подсчета клеток, повторное заполнение собранных клеток на желатин покрытием блюдо и инкубировать в течение 30 мин, чтобы изолировать клетки плюрипотентных из MEF клеток. После подсчета клеток (обычно 1 - 3 × 10 ⁶ клеток / блюдо могут быть собраны) повторное заполнение 4 × 10 ⁵ плюрипотентных клеток отблюдо.

2. Сотовый инкапсуляции в альгината гидрогеля капсул

1. Сбор клеток по той же методике, описанной в 1.5 и 1.6. После центрифугирования при 160 × г в течение 3 мин, промыть осадок клеток IPS с HEPES-буферным раствором трижды. После повторного суспендирования клеток в HEPES-буферным раствором, фильтр клеточной суспензии через 40 мкм ячейки фильтра, чтобы удалить крупные агрегаты, которые в противном случае могут засорить сопло.
2. Смешайте 2 мл клеточной суспензии в течение HEPES-буферным раствором и 3 мл 5% -ного раствора Na-Alg. Наконец 5 мл суспензии клеток в пределах 3% -ным раствором Alg-Na получают. Плотность клеток желательно более 10 ⁶ клеток / мл.
3. После сбора клеток суспензии в 5 мл шприц, установить коаксиальный сопло (рис 1а, б) на шприц и установите их на шприцевой насос. Испустите N ₂ поток газа (ниже, чем 1 л / мин) через внешнюю иглу коаксиального сопла иизгнать клеточной суспензии через внутреннее сопло.
4. Сбор капель в 250 мл 0,5% -ного раствора CaCl ₂ и ждать 10 - 20 мин для образования геля при перемешивании при 60-90 оборотов в минуту.

3. Лечение альгината капсул (по желанию)

1. Инкубируйте Alg-CA капсулы в 0,05% (вес / объем) поли-L-лизин (PLL) раствор в течение 5 мин при 37 ° С и 5% СО _2.
2. После промывки капсулы с HEPES-буферным раствором, инкубируют их в среде DMEM, содержащей 10% FBS с целью нейтрализации электрического заряда на их поверхности. Используйте их как капсул, покрытых (рис 1в).
3. Инкубируйте капсулы в HEPES-буферным раствором, содержащим 10 мМ ЭДТА в течение 5 мин. В обработанной ЭДТА капсул используются как полые капсулы (рис 1c).

4. Культура и сбора клеток в альгината капсул

1. Инкубируйте инкапсулированные клетки при 75 оборотах в минуту при встряхивании при 37 ° С и 5% CO ₂на 10 дней.
2. Сбор и инкубировать капсулы в 10 мМ ЭДТА при 37 ° С и 5% СО ₂ в течение 10 мин. Собирают клетки из альгинатных капсул без обработки ФАПЧ центрифугированием при 1000 х г в течение 3 мин.
3. Если альгината капсулы обрабатывают с PLL, сломать мембрану Alg-PLL с помощью пипетки вверх и вниз около десяти раз с иглой со шприцем и центрифуги это при 1000 - 5000 × г в течение 5 мин. Диаметр иглы должен быть ниже, чем размер капсулы и 25 г игл (260 мкм) использовали в этом эксперименте (600 мкм)
4. После центрифугирования собирают осадок клеток строго с разбитыми мембран Alg-PLL, если вы хотите, чтобы собрать образцы мРНК из клеток. Остальные Alg-PLL мембраны, возможно, предотвратить очистку мРНК.

Результаты

В протоколе 2.5 исключен альгинат решение образует сферическую форму сразу после изгнания (рис 2A - H). Если суспензию исключили со скоростью потока N ₂ ниже, чем 1 л / мин, размер капель равномерна (рис 2I). Тем не менее, если поток Н ₂ выше 1 л / мин, капли ломается

Обсуждение

Инкапсуляция культура может быть по сравнению с прямыми суспензионных культур. Суспензионной культуре является более простой способ получения больших количеств плюрипотентных стволовых клеток, чем способов инкапсулирования. Тем не менее, управление агрегацию клеток в суспензио?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mouse embryo fibroblast	Cell Biolabs	SNL 76/7
Mouse induced pluripotent stem cell	RIKEN Bio resorce centre	iPS-MEF-Ng-20D-17
DMEM high-glucose	GIBCO	11995
ES qualified  FBS	GIBCO	16141079
Antibacterial Antibiotics	GIBCO	15240
Nonessential Amino Acid	GIBCO	11140
2-mercaptoethanol	GIBCO	21985-023
ESGRO Leukemia Inhibitory Factor	Merck Millipore	ESG1107
Trypsin/EDTA	GIBCO	25300
26 G/16 G needle	Hoshiseido
10 ml Syringe	TERUMO	SS-10ESZ
Sodium  Chloride	Wako	191-01665
HEPES	SIGMA	H4034
Sodium Alginate	Wako	194-09955
Calcium Chloride	Wako	039-00475
Poly-L-lysine (MW = 15,000 - 30,000)	SIGMA	P7890
EDTA	DOJINDO	345-01865
Sylinge pump	AS ONE
Microscope	Olympus	IX71
Microscope	Leica	DM IRB
Hispeed camera	nac image technology	Memrecam HX-3