동축 노즐을 사용하여 다 능성 줄기 세포의 알긴산 캡슐화

요약

We established a method of encapsulating pluripotent stem cells (PS cells) into alginate hydrogel capsules using a co-axial nozzle. This prevents cells from aggregating excessively and limits the shear stress experienced by cells in suspension culture. The technique is applicable to the mass production of PS cells as well as research on stem cell niche.

초록

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening. However, the development of a mass culture system would be required for using PS cells in these applications. Suspension culture is one promising culture method for the mass production of PS cells, although some issues such as controlling aggregation and limiting shear stress from the culture medium are still unsolved. In order to solve these problems, we developed a method of calcium alginate (Alg-Ca) encapsulation using a co-axial nozzle. This method can control the size of the capsules easily by co-flowing N₂ gas. The controllable capsule diameter must be larger than 500 µm because too high a flow rate of N₂ gas causes the breakdown of droplets and thus heterogeneous-sized capsules. Moreover, a low concentration of Alg-Na and CaCl₂ causes non-spherical capsules. Although an Alg-Ca capsule without a coating of Alg-PLL easily dissolves enabling the collection of cells, they can also potentially leak out from capsules lacking an Alg-PLL coating. Indeed, an alginate-PLL coating can prevent cellular leakage but is also hard to break. This technology can be used to research the stem cell niche as well as the mass production of PS cells because encapsulation can modify the micro-environment surrounding cells including the extracellular matrix and the concentration of secreted factors.

서문

Induced pluripotent stem cells (iPS cells) are currently the source of intense research due to their role in regenerative medicine. However, huge amounts of cells are required for tissue regeneration. For instance approximately one billion pancreatic cells required for a type 1 diabetic patient¹. However, conventional dish culture is only able to obtain 1 × 10⁵ cells/cm², thus requiring 1 m² of culture area to obtain enough stem cell-derived pancreatic cells to treat a type 1 diabetic patient. The development of a system for the mass-culture of pluripotent stem cells, such as microcarrier² and suspension culture is therefore required for regenerative medicine. Suspension culture represents a promising method of mass culture but controlling the aggregation of cells is challenging in direct suspension cultures of human iPS cells³. Indeed, suspended cells are exposed to shear stress, which causes cell damage³ or differentiation⁴.

Research into hydrogel-based encapsulation has been conducted to solve problems associated with suspension culture. In hydrogel capsules, cells are protected from the flow of the medium. Previous reports have documented the use of various types of hydrogel, including agarose⁵, PEG⁶, and alginate (Alg), for cellular encapsulation. Alg-Ca hydrogel is one of the most useful hydrogels for cell encapsulation because Alg−Ca hydrogel is formed immediately after dropping alginate solution into a CaCl₂ solution and is also readily digested by enzymes or chelating reagents.

Here, we have established a stable alginate encapsulation process for iPS cells using a co-axial nozzle. By using N₂ gas flow for forming droplets, it is possible to encapsulate cells into uniform capsules without the need for other reagents such as oil. In this method, the flow rate of N₂ and concentration of both CaCl₂ and alginate are the major operating conditions affecting the size, shape, and uniformity of capsules. This report demonstrates the optimization of these operating conditions through the use of a hi-speed camera and a microscope.

프로토콜

1. 준비 재료

1. 10 mM의 HEPES 버퍼를 준비합니다. 실온에서 7.0으로 pH를 조정하고 0.9 %의 염화나트륨을 추가합니다.
2. 1.1 준비 HEPES 완충 식염수를 혼합하여 5 % 알긴산 용액 10 mM의 EDTA 솔루션을 준비합니다. 실온에서 7.0으로 pH를 조절합니다.
3. 121 ℃에서 20 분 동안 시약 (1.1, 1.2)를 압력솥.
4. DMEM 10 % ES-자격 FBS와 90 마이 토마 이신 C의 10 ㎍ / ㎖의를 포함하는 내 배양 피더 세포로 처리됩니다 2.0 × 10 ⁶ 마우스 배아 섬유 아세포 (MEF) 세포, - 1.2 계층화 젤라틴 코팅 60mm 요리를 준비합니다 - 120 분.
5. (ES-정규화 FBS 20 % 2- 머 캅토 에탄올, 비 필수 아미노산 및 항생제 50 μM을 함유하는 5 ㎖의 DMEM 고 글루코오스의 존재 하에서 피더 세포와 접시에 세포 (IPS) 마우스 유도 된 다 능성 줄기 유지 페니실린 G 나트륨, 황산 스트렙토 마이신 100 μg의 / ㎖의 100 단위 / ㎖ 및 250 ng를 amphoteri / ㎖CIN의 B).
6. 시드 4 × 10 ⁵ 만능 줄기 젤라틴 코팅 60mm 접시에 세포 및 CO _2를 37 ° C에서 그들을 품어 5 %. 배양시 배양 배지 매일을 변경합니다. 3 후 - 문화의 4 일, 37 ° C에서 0.05 % 트립신은 0.02 %의 EDTA를 포함하는 500 μL와 1 분 5 % CO ₂ 세포를 Trypsinize. 그 후, 배양 접시에 10 번을 두드려서 세포를 분리.
7. 3 분 동안 160 × g에서 원심 분리기 세포 현탁액 (세 번 1,000 μL 마이크로 피펫과 피펫 팅하여 단일 세포로 분리 마우스 IPS 세포 다음) FBS와 항생제 ES-자격의 10 % DMEM의 2.5 ML을 추가하고 상층 액을 제거하고 세포를 계산 . 셀 카운팅 후, 젤라틴 코팅 접시에 세포를 수집하고 시드 MEF 세포로부터 만능 줄기 세포를 분리하기 위해 30 분 동안 배양한다. 세포를 카운팅 한 후 (일반적으로 1 - × ¹⁰⁶ 세포 / 접시가 수집 될 수 있음), 4 × ¹⁰⁵ IPS 세포를 시드요리.

알긴산 하이드로 겔 캡슐에 2 셀 캡슐화

1. 1.5 및 1.6에 기재된 방법과 동일한 방법에 의해 세포를 수집. 3 분 동안 160 × g에서 원심 분리 후, 세 번 HEPES 완충 식염수와 유도 만능 줄기 세포 펠렛을 씻는다. HEPES 완충 식염수에 세포를 다시 현탁 한 후, 별도로 노즐을 막히게 할 수있는 큰 응집체를 제거하기 위해 40 μm의 셀 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 필터.
2. HEPES 완충 식염수 내에서 세포 현탁액 2 ㎖ 및 5 % Δ1g의-나트륨 용액 3 mL를 섞는다. 마지막으로 3 % Δ1g의-나트륨 용액 내 세포 현탁액 5 ml를 얻을 수있다. 셀 밀도는 바람직하게 10 개 이상 ⁶ 세포 / ml이다.
3. 5 ML의 주사기로 세포 현탁액을 수집 한 후, 주사기에 동축 노즐 (그림 1A, B)를 설치하고 주사기 펌프를 설정합니다. 발광 N ₂ 가스 유동 (저급 1L / 분 이하) 동축 노즐의 외 바늘 통해내부 노즐을 통해 세포 현탁액을 추방.
4. 0.5 % _CaCl2를 250 ml의 용액에 방울을 모아서 10 기다려 - 60-90 rpm에서 교반하면서 겔을 20 분.

알긴산 캡슐 3. 치료 (선택 사항)

1. 0.05 %에서 Δ1g의 - 칼슘 캡슐 부화 폴리 -L- 라이신 (PLL) 37 ° C에서 5 분 동안 5 % 용액 (/ V w) CO _2.
2. HEPES 완충 식염수와 캡슐을 세척 한 후, DMEM는 그 표면에 전하를 중화하기 위해 10 % FBS를 함유하는 배양에서 그들을. 코팅 캡슐 (그림 1C)로 활용.
3. 5 분 동안 10 mM의 EDTA를 함유하는 HEPES 완충 식염수에서 캡슐 부화. EDTA 처리 된 캡슐 빈 캡슐 (그림 1C)로 사용된다.

알긴산 캡슐 4. 문화 및 수집 세포

1. 37 ℃ 및 5 % CO _2에서 진탕 75 rpm에서 캡슐화 된 세포를 부화십일합니다.
2. 수집하고 10 분 동안 CO _2, 37 ℃에서 10 mM의 EDTA에 캡슐을 배양하고, 5 %. 3 분 1,000 × g에서 원심 분리하여 PLL을 처리하지 않고 알긴산 캡슐에서 세포를 수집합니다.
3. 5 분 동안 5,000 ×의 G - 알지네이트 캡슐이 PLL로 처리하는 경우, 최대 피펫 아래로 열 배 1,000에서 주사기와 원심 분리기를에 부착 된 바늘에 의해 ALG 파일-PLL 막을 휴식. 니들 직경은 캡슐의 크기 및 25 G (260 μm의) 바늘이 실험에서 사용되는보다 낮아야한다 (600 μm의)
4. 당신이 세포에서 mRNA의 샘플을 수집 할 경우 원심 분리 후, 깨진 Δ1g의-PLL 막으로부터 엄격하게 세포 펠렛을 수집합니다. 남은 Δ1g의-PLL 막은 가능한 mRNA의 정제를 방지한다.

결과

프로토콜 2.5에서 추방 알지네이트 솔루션은 추방 후 즉시 구형 (- H 그림 2A)를 형성한다. 현탁액을 1L / 분 이하 N ₂ 유량으로 배출되는 경우, 액 적의 크기가 균일 한 (도 2I)이다. N ₂ 흐름은 1L / 분보다 큰 경우, 액체 방울 (도 2G, 흰색 화살표로)을 분해 및 액 적의 크기가 불균일 (도 2J)를하게된다. 이 주어지면,이 방법을 사용하여 500 ...

토론

캡슐화 배양 직접 현탁 배양 물과 비교 될 수있다. 현탁 배양은 캡슐화 방법보다 다 능성 줄기 세포를 대량으로 얻을 수있는 간단한 방법이다. 그러나, 현탁 배양 세포의 집계를 제어하는​​ 것은 여전히​​ 어렵습니다. 밀봉 방법에서, 세포 응집은 캡슐에 제한되며, 따라서 잘 제어 할 수있다. 이전 간행물은 큰 세포 덩어리가 자유 현탁 배양 ^7에 등장하는 반면 캡슐화 된 세포, 균?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mouse embryo fibroblast	Cell Biolabs	SNL 76/7
Mouse induced pluripotent stem cell	RIKEN Bio resorce centre	iPS-MEF-Ng-20D-17
DMEM high-glucose	GIBCO	11995
ES qualified  FBS	GIBCO	16141079
Antibacterial Antibiotics	GIBCO	15240
Nonessential Amino Acid	GIBCO	11140
2-mercaptoethanol	GIBCO	21985-023
ESGRO Leukemia Inhibitory Factor	Merck Millipore	ESG1107
Trypsin/EDTA	GIBCO	25300
26 G/16 G needle	Hoshiseido
10 ml Syringe	TERUMO	SS-10ESZ
Sodium  Chloride	Wako	191-01665
HEPES	SIGMA	H4034
Sodium Alginate	Wako	194-09955
Calcium Chloride	Wako	039-00475
Poly-L-lysine (MW = 15,000 - 30,000)	SIGMA	P7890
EDTA	DOJINDO	345-01865
Sylinge pump	AS ONE
Microscope	Olympus	IX71
Microscope	Leica	DM IRB
Hispeed camera	nac image technology	Memrecam HX-3