JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Колебания фундаментальные свойства сети и модулируются болезни и наркотиков. Изучение мозга ломтик колебания позволяет характеристику выделенных сетей в контролируемых условиях. Протоколы предназначены для подготовки острых срезах мозга для вызывания ca1 γ колебания.

Аннотация

Нейронной сети колебания важные особенности активности мозга в норме и патологии и может модулироваться в диапазоне используемых в клинике препаратов. Протокол предоставляется создать модель для изучения СА1 γ колебания (20 - 80 Гц). Эти γ колебания устойчивы, по крайней мере 30 мин и зависит от возбуждающих и тормозных синапсов деятельности в дополнение к активации кардиостимулятора токов. Tetanically стимулированные колебания имеют ряд воспроизводимых и легко поддающихся количественной оценке характеристик, включая счета спайка, длительность колебаний, задержки и частоты, что доклад по сети государства. Преимущества электрически стимулированных колебаний включают стабильность, воспроизводимость и эпизодический приобретение позволяет надежную характеристику функции сети. Эта модель СА1 γ колебаний может быть использован для изучения клеточных механизмов и систематически исследовать, как нейронная сеть деятельность изменены болезни и наркотиков.Заболевание состояние фармакологии могут быть легко включены с помощью срезах мозга от генетически модифицированных или инвазивных животных моделях для того, чтобы выбор препаратов, которые специально направлены механизмов болезни.

Введение

Мозг сети колебания происходят в пределах отдельных частотных диапазонах, которые коррелируют с поведенческими государств. У грызунов, гиппокампа θ колебания (5 - 10 Гц) наблюдается во время разведочных поведения 1,2, в то время как γ колебания (20 - 80 Гц) ассоциируются с различными когнитивными процессами, в том числе восприятия и внимания 3,4. Синхронный γ сетевую активность также вовлечен в патологии расстройств, таких как эпилепсия, шизофрения 5,6. Например, γ колебания думал соответствуют областям коркового эпилептического очага 5,7,8 и могут быть использованы в качестве маркеров pharmacosensitivity или сопротивления, два важных областей исследования в эпилепсии исследованиях 9.

Гиппокампа ломтик мозг модель, которая была широко используется для исследования сетевой активности 10-12. Различные протоколы были разработаны для создания γ колебания в срезах мозга, что, как правило, яnvolve фармакологическая модуляция таких, как низкая Mg 2+, 4-аминопиридин (4AP), бикукуллина и каиновой кислоты 12-17. Недостатки фармакологически вызвали колебаний в том, что они происходят случайным после применения препарата и не надежно генерируется или стабильным во времени. Электрически срабатывает γ колебания преодолеть многие из этих проблем, а также имеют то преимущество, что временно заблокированы стимулирующего случае позволяет эпизодической записи и анализа. Вот протокол описывается для генерации СА1 γ колебания, предоставляя тетаническое стимуляции рогового ORIENS в гиппокампе срез.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Все эксперименты на мышах были утверждены этики животных комитета Флори институт.

1. Установка для резки Brain фрагменты

  1. Подготовка режущей раствора, содержащего (мм) 125 холин-Cl, 2,5 KCl, CaCl 2, 0,4, 6 MgCl 2, 1,25 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO 3, 20 D-глюкозы, насыщенный карбогена газа (95% O 2 -5 % искусственный спинномозговой жидкости СО 2) и (ACSF) записи раствора, содержащего (мм) 125 NaCl, 2,5 KCl, CaCl 2, 2, 2 MgCl 2, 1,25 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO 3, 10 D-глюкозы, насыщают карбогена. Поместите режущий решение на льду держать его холодно.
  2. Замораживание около 400 мл раствора режущего и смешать вместе с 100 мл размороженной режущего раствора для создания суспензии льда. Пузырь с карбогена (95% O 2, 5% CO 2) при скорости потока приблизительно 0,5 л / мин через небольшой Cтрубки алибер или спеченного стекла, чтобы произвести устойчивый, но мягкий поток пузырьков.
  3. Приготовьте 250 мл химический стакан с повышенной вставкой нейлон сетки, на которой срезах мозга будет размещена. Залейте ACSF, чтобы покрыть сетку примерно на 2 см и пузырь с карбогена, убедившись, что пузыри не непосредственно нарушить область ломтик холдинга. Важно также, что нет пузырьков воздуха в нейлоновую сетку, так что, если они присутствуют удалить их. Это будет удерживающей камеры и выдерживают при комнатной температуре (20 - 25 ° C).
  4. Макет рассекает инструменты в том числе большой ножницами, небольшой ножницами, малых и больших микро шпателей, и больших и малых пар щипцов и охладить их на льду. Поместите vibratome ткани резки блока на льду на площади алюминиевой фольги. Получить 2 части 6 см фильтровальной бумаги, одним лезвием бритвы края, и стакан 25 мл, наполненный суспензии резки решения, а также.
  5. Заполните второй контейнер со льдом, и лежал кусок ткани папэ на льду и поместить 12 см культуры блюдо на вершине. Заполните культуры блюдо с режущим решение суспензии льда и пузырь с карбогена. Это контейнер, в котором осуществляется с рассечение мозга.
  6. Подготовка vibratome. Удалить свежий обоюдоострым лезвием бритвы (использовать свежие лезвия каждый раз) из упаковки и спрей с 80% этанола, затем деионизированной воды. Вырезать 3 мл пластиковой пипетки передачи в точке, где она начинает сужаться. Это будет использоваться для передачи срезах мозга. Изгиб иглы 27 G у основания примерно 45 ° и прикрепить к 1 мл шприца. Это будет использоваться, чтобы управлять во время резки ломтиками.

2. Резка Мозговые фрагменты

  1. Обезболить мышь (P16 - P18) с 2% изофлуран или локально утвержденного метода. После индукции обезглавить животное с большим ножницами и падение головой в 12 см культуры блюдо, которое содержит ыми суспензии резки решение. Суспензия должна полностью погрузиться в головубыстрое охлаждение.
  2. Держите переднюю часть головы с одной стороны пилинг кожи и соединительной ткани вперед к носу. Использование маленькие ножницы сократить соединительной ткани, чтобы выявить основную череп. Затем снимите мышцы вышележащих спинной части черепа и шеи.
  3. Удалить мозг от черепа сначала обеспечить переднюю часть черепа с большими щипцами, а затем сделать две боковые разрезы через кость обе стороны от затылочного отверстия, используя маленькие ножницы (фиг.1, порезы, обозначенные A1 и A2).
    1. Сделайте еще ​​один разрез между глазами (только передняя часть темени) (рис 1, вырезать помечены В) затем тщательно вырезать вдоль стреловидного шва вперед и отражают сокращение черепа разделы, раскрывающие мозг (рисунок 1, вырезать помечены C).
    2. Используйте маленькую лопаточку, чтобы выкопать мозг и место на культуральной чашке. Будьте в курсе CRANМВЛ нервы на нижней аспекте мозга, которые будут должны быть разорваны, это может быть сделано с помощью меньшего размера микро шпателя. Использование больших шпателя передачи мозг в стакан 25 мл, наполненную суспензии резки раствора.
  4. Подготовка полушарие мозга для нарезки.
    1. Поместите один кусок фильтровальной бумаги диаметром 6 см в нижней части свежей культуральной чашке затем заполнить со свежим раствором суспензии резки и пузырь. Использование большего шпателем в положение мозг, вентральной стороной вниз, на фильтровальную бумагу. Возьмите новый и очищенный одного края лезвия бритвы и сократить мозг, чтобы удалить мозжечок, а затем сделать разрез по средней линии, чтобы отделить мозг в двух полушариях.
  5. Подготовка блока vibratome ткани.
    1. Возьмите охлажденную блок vibratome ткани, высушить поверхность, и поместите каплю клея цианакрилатного в середине и равномерно на приблизительный размер мозга. Используйте маленькую лопаточку, чтобы манипулировать одним измозговые полушария на большой микро шпателем так медиальной стороне мозга вниз.
    2. Сенсорный край шпателем на границе головного мозга на второй лист фильтровальной бумаги, чтобы удалить как можно больше раствора, как это возможно. Слайд мозг от крупных шпателем с использованием меньшего шпателя, чтобы направлять его на клей.
    3. Безопасный режущий блок в vibratome камеры и заполнить камеру с режущей раствора суспензии и пузырь, обеспечивая мозг полностью погружен. Поверните режущий блок так, брюшная сторона мозга сталкивается лезвие.
  6. Нарезка мозг.
    Примечание: Каждый vibratome является уникальным, так следуйте инструкциям производителя.
    1. Установите толщину среза до 450 мкм, и обеспечить лезвие вибрирует, как она движется через мозг со скоростью примерно 0,3 мм / с. Вырезать полностью через мозг от брюшной стороны к поверхности коры, это будет производить весь мозг сагиттальных, которые могут бе используется для электрофизиологических записей. Ломтики будет выпускаться в поперечном направлении медиально и, как правило, 3 - 4 ломтики могут быть вырезаны из каждого полушария.
    2. Если база ломтик лифтов использовать согнутую 27 G иглу нежным прессы ломтик вниз. Поскольку каждый ломтик разрезать, используйте пипетки передачи, чтобы переместить его на платформу в удерживающей камере, где они жизнеспособны до 8 часов.

3. Внеклеточные электрофизиологии Записи

  1. Монтаж кусочек в записи камеры.
    1. Использование передачи пипетки, поместите кусочек мозга в погруженном записи камеры перфузии ACSF течет по 1 - 2 мл / мин и нагревали до 32 ° С. ACSF используется для записей отличается от того, в холдинг камеры, как 2+ концентрация Mg увеличивается от 2 до 4 мм.
    2. Закрепите кусок с арфой "" (полукруглой нержавеющей стали с нейлоновыми нитями растянутых по крайней 2 - 3 мм пробелами). Местоарфа, так что пряди идут параллельно СА1. Увеличение скорости перфузии до 8 - 10 мл / мин при 32 ° С.
  2. Под микроскопом рассекает месте стимулирующий электрод и записи электрода (стеклянный электрод заполнен раствором записи ACSF) на поверхности рогового radiatum в СА1 (фиг.2А). Поместите стимулирующий электрод сначала поместите записи электрода.
  3. Стимулировать Шаффер залогов с 120 - 150 мкА амплитуды и 0,1 мс тестового импульса длительностью и наблюдать результирующее поле возбуждающим сообщению синаптическую потенциал (fEPSP) сигнала, чтобы определить здоровье ломтик (рис 2B). Стимулирующее и записи электроды могут должны быть перемещены в часть около 50 - 100 мкм от поверхности среза, чтобы получить fEPSP записи с мелких волокон волейбол и большой амплитудой. Шаффер залога вызвал fEPSPs являются стереотипными и обеспечить хороший показатель здоровья среза. Нealthy ломтики обычно показывают волокна ударом с fEPSP отношение амплитуд менее 0,3.
  4. Перемещение электродов.
    1. Использование рассекает микроскоп, переместить стимулирующий электрод к середине рогового ORIENS и перемещать записи электрод к пирамидальной слоя клеток как можно ближе к регистрирующего электрода, насколько это возможно, как показано на фигуре 3А. Стимулирующее и записи электроды, возможно, потребуется толкнул в срезе примерно 50 - 100 мкм, так что амплитуда ответа fEPSP в 120 - тест мкА импульса 150 составляет примерно 1 мВ.
  5. Создание γ колебания.
    1. Для создания γ колебания стимулируют ткани с поездом 20 х 0,1 мс импульсов поставляемых на 200 Гц. Это тетаническое стимулом может дать ответов воспроизводимых при доставке каждые 5 мин.
  6. Используйте следующие параметры записи.
    1. Масштаб усиления выходного сигнала, чтобы соответствовать диапазон входного напряженияаналого-цифровой преобразователь. Убедитесь, что максимальный ожидаемый экскурсия сигнал использует минимум 30% от диапазона входного напряжения. Будьте осторожны при установке выгоды для высоко, как сигналы могут обрезать. Необходимы для полевых записей типичный пропускная способность составляет 500 Гц с AC связи на 0,1 Гц, чтобы удалить базовой линии.
    2. Оцифровка по крайней мере 4 - 5 раз быстрее, чем угловой частоты фильтра низких частот, чтобы избежать наложения сигнала.
  7. Анализ данных.
    1. Данные фильтр высоких частот на 5 Гц, чтобы удалить любые базовые изменения. Определить шипы, используя порог производной, с минимальным отрывом событий 10 мс, характерное время событий в пике, и регрессия интервалом 7 мс, порог ~ 100 мВ / мс, и разделяющей долины 100%. Рассчитать задержки, как время, необходимое для первого идентифицированного шип происходить после окончания стимуляции артефакт. Этот анализ позволяет для характеристики числа пиков, задержки интервала между событий, и продолжительность рассчитывается какследующим образом:
    2. Рассчитать количество шипов, как общее количество шипов на колебания на каждой развертки определяется.
    3. Рассчитайте задержку колебаний. Для каждого колебания, вычесть время первого идентифицированного шипа от конца стимуляции артефакта.
    4. Рассчитайте средний интервал между событий (ISI). Определите период времени между несколькими обнаруженных шипами и среднего.
    5. Рассчитать продолжительность колебаний. Измерьте время между первым и последним обнаруженным шип в каждом колебании.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Тетанических стимуляция пластовых ORIENS генерируется надежные и воспроизводимые γ колебания (35,4 ± 2,2 Гц), рис 3B. Чтобы продемонстрировать, что колебания были получены в локальной сети СА1 входы от СА3 были разорваны путем разрезания срез в области CA2 с помощью изогнутого 32 G иглу. С...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Надежный метод для генерации ca1 γ колебания в острых срезах мозга описано. Колебания, создаваемые возникают из местного цепи благоприятной лучшую возможность для контроля и понимания нейрофизиологических основ сетевых колебаний 12. АМРА-рецепторы, рецепторы ГАМК A, I ч...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

Supported by APA to RJH, NHMRC program grant 400121 to SP, and NMHRC fellowship 1005050 to SP. CAR acknowledges the support of the ARC (FT0990628) and the DOWD fellowship scheme. The Florey Institute of Neuroscience and Mental Health is supported by Victorian State Government infrastructure funds.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
4-(N-Ethyl-N-phenylamino)-1,2- dimethyl-6-(methylamino) pyrimidinium chloride (ZD7288)Sigma-AldrichZ3777
BiucullineSigma-Aldrich14340
6-cyano-7-nitroquinoxa- line-2,3-dione (CNQX)Sigma-AldrichC127
NickelSigma-Aldrich266965
CarbamazepineSigma-AldrichC4024
(2R)-amino-5-phosphonopentano-ate (APV)Tocris Bioscience0105
RetigabineChemPacific150812-12-7
Choline-ClSigma-AldrichC1879-5KG
KClSigma-AldrichP9333-500G
NaH2PO4Sigma-AldrichS9638-250G
NaHCO3Sigma-AldrichS6297-250G
NaClSigma-AldrichS7653-5KG
GlucoseSigma-AldrichG8270-1KG
CaCl2 • 2H2OSigma-Aldrich223506-500G
MgCl2 • 6H2OSigma-AldrichM2670-500G
Electrode glassHarvard Apparatus GC150F-10
Concentric bipolar stimulating metal electrode FHCCBBPF75
Digital IsolatorGetting InstrumentsModel BJN8-9V1 
Model 1800 amplifierA-M systemsModel 1800 amplifier
DigitizerNational IntrumentsNI USB-6211
VibrotomeLeicaVT1200s

Ссылки

  1. Buzsaki, G. Theta rhythm of navigation: link between path integration and landmark navigation, episodic and semantic memory. Hippocampus. 15 (7), 827-840 (2005).
  2. Vanderwolf, C. H. Hippocampal electrical activity and voluntary movement in the rat. Electroencephalogr. Clin. Neurophysiol. 26 (4), 407-418 (1969).
  3. Bartos, M., Vida, I., Jonas, P. Synaptic mechanisms of synchronized gamma oscillations in inhibitory interneuron networks. Nat. Rev. Neurosci. 8 (1), 45-56 (2007).
  4. Buzsáki, G., Wang, X. -J. Mechanisms of gamma oscillations. Annu. Rev. Neurosci. 35, 203-225 (2012).
  5. Kobayashi, K., et al. Cortical contribution to scalp EEG gamma rhythms associated with epileptic spasms. Brain Dev. 35 (8), 762-770 (2013).
  6. Andreou, C., et al. Increased Resting-State Gamma-Band Connectivity in First-Episode Schizophrenia. Schizophr Bull. , (2014).
  7. Alarcon, G., Binnie, C. D., Elwes, R. D., Polkey, C. E. Power spectrum and intracranial EEG patterns at seizure onset in partial epilepsy. Electroencephalogr. Clin. Neurophysiol. 94 (5), 326-337 (1995).
  8. Fisher, R. S., Webber, W. R., Lesser, R. P., Arroyo, S., Uematsu, S. High-frequency EEG activity at the start of seizures. J. Clin. Neurophysiol. 9 (3), 441-448 (1992).
  9. Kwan, P., Brodie, M. J. Early identification of refractory epilepsy. N. Engl. J. Med. 342 (5), 314-319 (2000).
  10. Traub, R. D., Kopell, N., Bibbig, A., Buhl, E. H., LeBeau, F. E., Whittington, M. A. Gap junctions between interneuron dendrites can enhance synchrony of gamma oscillations in distributed networks. J. Neurosci. 21 (23), 9478-9486 (2001).
  11. Traub, R. D., Whittington, M. A., Buhl, E. H., Jefferys, J. G., Faulkner, H. J. On the mechanism of the gamma --> beta frequency shift in neuronal oscillations induced in rat hippocampal slices by tetanic stimulation. J. Neurosci. 19 (3), 1088-1105 (1999).
  12. Whittington, M. A., Stanford, I. M., Colling, S. B., Jefferys, J. G., Traub, R. D. Spatiotemporal patterns of gamma frequency oscillations tetanically induced in the rat hippocampal slice. J. Physiol. 502 (3), 591-607 (1997).
  13. Avoli, M., Panuccio, G., Herrington, R., D’Antuono, M., de Guzman, P., Lévesque, M. Two different interictal spike patterns anticipate ictal activity in vitro. Neurobiol. Dis. 52, 168-176 (2013).
  14. Boido, D., Jesuthasan, N., de Curtis, M., Uva, L. Network Dynamics During the Progression of Seizure-Like Events in the Hippocampal-Parahippocampal Regions. Cereb Cortex. 24 (1), 162-173 (2014).
  15. Gloveli, T., Albrecht, D., Heinemann, U. Properties of low Mg2+ induced epileptiform activity in rat hippocampal and entorhinal cortex slices during adolescence. Brain Res. Dev. Brain Res. 87 (2), 145-152 (1995).
  16. McLeod, F., Ganley, R., Williams, L., Selfridge, J., Bird, A., Cobb, S. R. Reduced seizure threshold and altered network oscillatory properties in a mouse model of Rett syndrome. Neuroscience. 231, 195-205 (2013).
  17. Bracci, E., Vreugdenhil, M., Hack, S. P., Jefferys, J. G. On the synchronizing mechanisms of tetanically induced hippocampal oscillations. J. Neurosci. 19 (18), 8104-8113 (1999).
  18. Main, M. J., Cryan, J. E., Dupere, J. R., Cox, B., Clare, J. J., Burbidge, S. A. Modulation of KCNQ2/3 potassium channels by the novel anticonvulsant retigabine. Mol. Pharmacol. 58 (2), 253-262 (2000).
  19. Wickenden, A. D., Yu, W., Zou, A., Jegla, T., Wagoner, P. K. Retigabine, a novel anti-convulsant, enhances activation of KCNQ2/Q3 potassium channels. Mol. Pharmacol. 58 (3), 591-600 (2000).
  20. Otto, J. F., Kimball, M. M., Wilcox, K. S. Effects of the anticonvulsant retigabine on cultured cortical neurons: changes in electroresponsive properties and synaptic transmission. Mol. Pharmacol. 61 (4), 921-927 (2002).
  21. Pomper, J. K., Graulich, J., Kovacs, R., Hoffmann, U., Gabriel, S., Heinemann, U. High oxygen tension leads to acute cell death in organotypic hippocampal slice cultures. Brain Res. Dev. Brain Res. 126 (1), 109-116 (2001).
  22. Hatch, R. J., Reid, C. A., Petrou, S. Enhanced in vitro CA1 network activity in a sodium channel β1(C121W) subunit model of genetic epilepsy. Epilepsia. 55 (4), 601-608 (2014).
  23. Lord, L. -D., Expert, P., Huckins, J. F., Turkheimer, F. E. Cerebral energy metabolism and the brain/'s functional network architecture: an integrative review. J. Cereb. Blood Flow Metab. 33 (9), 1347-1354 (2013).
  24. Hájos, N., et al. Maintaining network activity in submerged hippocampal slices: importance of oxygen supply. Eur. J. Neurosci. 29 (2), 319-327 (2009).
  25. Hájos, N., Mody, I. Establishing a physiological environment for visualized in vitro brain slice recordings by increasing oxygen supply and modifying aCSF content. J. Neurosci. Methods. 183 (2), 107-113 (2009).
  26. Boido, D., Jesuthasan, N., de Curtis, M., Uva, L. Network Dynamics During the Progression of Seizure-Like Events in the Hippocampal-Parahippocampal Regions. Cereb Cortex. 24 (1), 163-173 (2012).
  27. Antuono, M., Köhling, R., Ricalzone, S., Gotman, J., Biagini, G., Avoli, M. Antiepileptic drugs abolish ictal but not interictal epileptiform discharges in vitro. Epilepsia. 51 (3), 423-431 (2010).
  28. Stenkamp, K., et al. Enhanced temporal stability of cholinergic hippocampal gamma oscillations following respiratory alkalosis in vitro. J. Neurophysiol. 85 (5), 2063-2069 (2001).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

102CA1

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены