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요약

진동은 기본적인 네트워크 속성이며 질병과 약물에 의해 조절된다. 뇌 슬라이스 진동을 공부하는 것은 통제 된 조건에서 격리 된 네트워크의 특성을 수 있습니다. 프로토콜은 CA1의 γ 진동을 불러 일으키는 급성 뇌 조각의 준비를 위해 제공됩니다.

초록

신경 네트워크 진동은 건강과 질환에서 뇌 활동의 중요한 특징이며 임상 적으로 사용되는 약물들에 의해 변조 될 수있다. (- 80 Hz에서 20) 프로토콜은 CA1의 γ 진동을 연구하기위한 모델을 생성하기 위해 제공된다. 이러한 γ 진동은 적어도 30 분 동안 안정하고 조정기 전류의 활성화에 추가하여 흥분성 시냅스 활성을 억제 의존한다. Tetanically 자극 진동은 네트워크 상태에보고 스파이크 카운트, 발진 기간, 대기 시간 및 주파수를 포함 재현성 쉽게 정량화 특성들을 갖는다. 전기적 진동 자극의 장점은 네트워크 기능의 강력한 특성화를 가능 안정성, 재현성 및 일시적인 수집을 포함한다. CA1의 γ의 진동이 모델은 셀룰러 메커니즘을 연구하는 체계적 질환과 약제에 의해 변경되는 방법을 신경 네트워크 활동을 조사하는데 사용될 수있다.질병 상태 약리학 용이 구체적 질병 메커니즘을 대상 약물의 선택을 가능하게하기 위해 유전자 변형 또는 중재 동물 모델에서 뇌 조각의 사용에 의해 통합 될 수있다.

서문

뇌 네트워크 진동은 행동 상태에 상관 별개의 주파수 대역 내에서 발생한다. 설치류, 해마 θ 진동 (5-10 Hz에서)를 탐색 행동 1,2 동안 관찰 γ 진동 동안 - 인식과 관심 3,4 등 다양한인지 과정과 (20 ~ 80 Hz에서) 연결합니다. 동기식 네트워크 γ 활성은 또한 정신 분열증, 간질 및 5,6- 같은 장애의 병리학에 관련된다. 예를 들면, γ 진동은 피질 간질 병소 5,7,8의 영역에 해당하는 것으로 생각되고 pharmacosensitivity 또는 저항, 간질 연구 조사 9 개의 중요한 영역의 마커로 사용될 수있다.

뇌 해마 슬라이스 널리 네트워크 활동 10-12을 조사하기 위해 사용 된 모델이다. 다양한 프로토콜은 전형적으로 그 뇌 조각의 γ 진동을 생성하기 위해 개발 된 I저 마그네슘 2 + 4 아미노 피리딘 (4AP), bicuculline 및 kainic 산 12-17로 nvolve 약리 변조. 약리학 트리거 진동의 단점은 약물 신청 후 무작위로 발생하고 안정적​​으로 생성 또는 시간에 안정되지 않습니다 있습니다. 전기적 진동 γ들이 이러한 문제점들을 극복하고 또한 시간적 에피소드 기록 및 분석을 가능 이벤트 자극에 고정되는 이점이 트리거. 다음은 프로토콜이 해마 슬라이스 지층 oriens에 파상풍의 자극을 제공함으로써 CA1의 γ 진동을 생성하는 기술되어있다.

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프로토콜

마우스의 모든 실험은 플로리 연구소의 동물 윤리위원회에 의해 승인되었다.

뇌 조각을 절단 1. 설치

  1. (MM) (125) 콜린 CL 2.5의 KCl, 0.4 CaCl2를,도 6의 MgCl 2, 1.25의 NaH 2 PO 4, 26의 NaHCO3 이루어진 절삭 액을 준비 20 D-포도당 carbogen 가스 (95 % O 2 -5 포화 (㎜) 125의 NaCl, 2.5 KCl을,이 CaCl2를, 2의 MgCl 2, 1.25의 NaH 2 PO 4, 26의 NaHCO3 이루어지는 %의 CO 2)와 인공 뇌척수액 (ACSF) 기록 액, 10 D 글루코오스로 포화 carbogen. 감기를 유지하기 위해 얼음에 절단 솔루션을 놓습니다.
  2. 절단 용액을 약 400 ㎖의 동결 및 얼음 슬러리를 만들기 위해 고정 된 절삭 용액 100 ㎖과 함께 블렌드. carbogen와 버블 (95 % O 2 -5 % CO 2의) 작은 C 내지 약 0.5 L / min의 유량에서aliber 튜브 또는 소결 유리 거품의 꾸준한하지만 부드러운 흐름을 생성한다.
  3. 뇌 조각이 배치 될에 제기 나일론 메쉬 인서트 (250) 비이커를 준비합니다. 거품이 직접 조각 수용 지역을 방해하지 않는 것이 보장 carbogen와 약 2cm로 메쉬와 거품 다루 ACSF로 채 웁니다. 그것은 거기 나일론 메쉬 안에 기포가없는, 그래서 어떤 위험이있는 경우이를 제거하는 것이 중요하다. 이것은 유지 실되며 RT로 유지된다 (20-25 ° C).
  4. 가위의 큰 쌍, 가위, 크고 작은 마이크로 주걱과 집게의 크고 작은 쌍의 작은 쌍을 포함 해부 악기를 레이아웃과 얼음에 그들을 진정. 알루미늄 호일의 광장에 얼음에 vibratome 조직 절단 블록을 놓습니다. 6cm 필터 종이, 하나의 에지 면도날,뿐만 아니라 절단 솔루션 슬러리로 채워진 25 비이커 2 개를 얻습니다.
  5. 얼음과 제 2 용기를 입력하고 조직 아빠의 조각을 배치어 및 얼음에 상단에 12cm의 배양 접시를 놓습니다. carbogen와 솔루션 아이스 슬러리 거품을 절단 배양 접시를 채우십시오. 이것은 뇌 해부를 수행 할로하는 컨테이너입니다.
  6. vibratome를 준비합니다. 신선한 양날 면도날 제거의 포장 (신선한 날 때마다 사용) 및 80 % 에탄올 후 탈 이온수로 스프레이. 이 테이퍼 시작 지점에서 3 ㎖ 플라스틱 전송 피펫을 잘라. 이것은 뇌 조각을 전송하는 데 사용된다. 벤드 약 45 °, 1 ML의 주사기에 부착하여 기지에서 27 G 바늘. 이것은 절단시 슬라이스를 조작하는 데 사용된다.

2. 뇌 조각을 절단

  1. 2 % 이소 플루 란 또는 로컬 승인 방법 - 마우스 (P18 P16)를 마취. 유도 후, 가위의 큰 쌍의 동물 목을 벨과 버블 절단 솔루션 슬러리를 포함 12cm 문화 접시에 머리를 놓습니다. 슬러리를 완전히위한 헤드 젖어 있어야급속 냉각.
  2. 한 손으로 피부 앞으로 코쪽으로 결합 조직을 박리와 머리의 앞쪽을 잡고. 결합 조직을 잘라 작은 가위를 사용하면 기본 두개골을 공개합니다. 그런 다음 두개골과 목 등의 측면을 덮는 근육을 제거합니다.
  3. 먼저 큰 집게와 두개골의 전면을 확보하여 두개골에서 뇌를 제거하고 작은 가위 (그림 1, A1과 A2 표지 컷)를 사용하여 난원 매그넘의 뼈 양쪽을 통해 두 가지 측면 컷을합니다.
    1. 눈 사이 다른 컷 (브레 그마의 바로 앞쪽) (그림 1, 절단 표시 B)를 조심스럽게 전방 시상 봉합을 따라 절단을 확인하고 뇌 (그림 1, 컷 라벨 C)를 공개 할 컷 두개골 부분을 반영합니다.
    2. 배양 접시에 뇌와 장소를 특종에있는 작은 주걱을 사용합니다. 크랑의주의필요 뇌의 하부 측면에 IAL 신경이 작은 크기의 마이크로 주걱을 사용하여 수행 될 수 있고, 절단한다. 사용하여 더 큰 주걱은 절단 솔루션 슬러리 가득 25 비이커에 뇌를 전송합니다.
  4. 슬라이스에 대한 뇌 반구를 준비합니다.
    1. 다음 신선한 절단 솔루션 슬러리 거품 채우기 새로운 배양 접시의 바닥에 6cm 필터 종이 한 조각을 놓습니다. 필터 종이에, 아래로 뇌, 복부 측면의 위치를​​ 더 큰 주걱을 사용합니다. 새로운 청소 하나의 에지 면도날을 가지고 다음, 소뇌를 제거 중간 선을 따라 잘라 두 개의 반구로 뇌를 분리 할 수​​ 있도록 뇌를 잘라.
  5. vibratome 조직 블록을 준비.
    1. 상기 냉장 vibratome 조직 블록을 받아 표면을 건조하고, 중간에 시아 노 아크릴 레이트 접착제의 드롭을 배치하고 뇌의 대략적인 크기로 고르게 확산. 중 하나를 조작하는 작은 주걱을 사용하여큰 마이크로 주걱 위에 뇌 반구 뇌의 안쪽면이 아래로 그래서.
    2. 가능한 해결책 중 많이 제거하는 필터 종이 조각에 제 뇌의 계면에서의 주걱 부분을 만지지. 접착제에 그것을 안내하는 작은 주걱을 사용하여 더 큰 주걱 떨어져 머리를 밀어 넣습니다.
    3. 뇌가 완전히 잠기 보장 vibratome 챔버로 절단 블록을 고정 및 절단 솔루션 슬러리 거품 챔버를 입력합니다. 뇌의 복부 측면이 블레이드를 향하도록 절단 블록을 돌립니다.
  6. 뇌 조각화.
    참고 : 각 vibratome 그렇게 제조업체의 지시에 따라 고유합니다.
    1. 450 μm의 슬라이스 두께를 설정하고, 약 0.3 mm / s의 속도로 뇌를 통해 이동함에 따라 블레이드가 진동을 보장한다. 대뇌 피질의 표면에 복부 측면에서 뇌를 완전히 잘라,이 수 b 전체 뇌 시상 슬라이스를 생성합니다전기 생리 녹음에 사용되는 전자. 조각 내측 측방 생성되며 일반적 3-4 슬라이스 각 반구로부터 절단 될 수있다.
    2. 슬라이스 리프트의 기본 슬라이스 다시 아래 부드러운 언론에 구부러진 27 G 바늘을 사용하는 경우. 각 절편이 절단됨에 따라, 그들은 최대 8 시간 동안 생존하다 유지 실에서 플랫폼 상을 이동하는 전송 피펫을 사용한다.

3. 세포 외 전기 생리학 녹음

  1. 기록 챔버 내의 슬라이스 실장.
    1. 2 ml / 분, 32 ℃로 가열 - 전송 피펫을 사용하여 ACSF 1에서 흐르는 관류 잠수 기록 챔버로 뇌 조각을 배치합니다. 녹음에 사용 ACSF는 Mg를 2 + 4 mM의 농도가 2 mM 내지 증가함에 따라 유지 실에서 그와 다르다.
    2. (- 3 mm의 간격 (2)에 걸쳐 뻗어 나일론 가닥 세미 원형 스테인레스 스틸) "하프"로 슬라이스를 고정합니다. 장소하프 가닥 CA1에 평행하게 실행되도록. 32 ° C에서 10 ml / 분 - 8 관류의 속도를 높입니다.
  2. 해부 현미경 장소 자극 전극과 CA1 (도 2a)의 radiatum 지층의 표면 상에 기록 전극 (ACSF 기록 용액으로 채워진 유리 전극) 아래. 기록 전극을 배치 먼저 자극 전극을 배치합니다.
  3. 샤퍼는 120 담보 자극 - 150 μA의 진폭과 0.1 밀리 초 지속 시간 테스트 펄스와 슬라이스 건강 (그림 2B)를 결정하는 결과 필드 흥분성 시냅스 후 전위 (fEPSP) 파형을 관찰한다. 슬라이스 표면에서 100 ㎛ fEPSP 작은 섬유 발리와 큰 진폭으로 기록 얻을 - 자극과 기록 전극은 약 50 슬라이스로 이동해야 할 수 있습니다. 샤퍼 담보는 fEPSPs이 박힌하고 슬라이스 건강의 좋은 지표를 제공 유발. Healthy 조각은 일반적으로 0.3 미만의 진폭 비율을 fEPSP하는 섬유 발리슛을 보여줍니다.
  4. 전극을 위치 변경.
    1. 해부 현미경을 사용하여, 지층 oriens의 중간 자극 전극을 이동하고도 3a에 도시 된 바와 같이 가능한 기록 전극에 가깝게 피라미드 세포 층에 기록 전극을 이동. 150 μA 테스트 펄스 1 약 MV입니다 - 120 fEPSP 응답 진폭이되도록 100 ㎛ - 자극과 기록 전극은 약 슬라이스로 (50)를 밀어해야 할 수 있습니다.
  5. γ 진동을 발생시킨다.
    1. γ 진동 200 Hz에서 전달 20 × 0.1 밀리 초 펄스의 기차와 조직을 자극 생성합니다. 매 5 분을 배달 할 때 파상풍의 자극이 재현 응답을 얻을 수 있습니다.
  6. 다음과 같은 기록 매개 변수를 사용합니다.
    1. 의 입력 전압 범위와 일치하는 출력 신호의 이득을 스케일아날로그 - 디지털 변환기. 최대 예상 신호 편위는 입력 전압 범위의 30 %의 최소값을 사용하는지 확인. 신호가 클립 수있는 높은으로 이득을 설정할 때주의해야합니다. 필드 레코딩에 필요한 일반적인 대역폭은베이스 라인 드리프트를 제거하는 0.1 Hz에서 AC 커플 링 500 Hz입니다.
    2. 신호의 에일리어싱을 피하기 위해 저역 통과 필터의 코너 주파수보다 5 배 빠른 - 적어도 4 디지털화.
  7. 데이터 분석.
    1. 5 Hz에서 하이 패스 필터 데이터는베이스 라인의 변화를 제거합니다. 10 밀리 최소 이벤트 분리 피크 7 MS의 회귀 간격 ~ 100 MV / 밀리의 임계​​치 전형적인 이벤트 시간, 100 %의 분리 계곡, 유도체 임계치를 이용한 스파이크를 확인한다. 제 스파이크 식별 소요 시간이 자극 인공물의 종료 후 발생하는 지연 시간과 같이 계산한다. 이 분석은 스파이크, 대기 시간, 이벤트 간 간격의 수의 특성을 허용하고, 시간은 다음과 같이 계산다음과 같습니다 :
    2. 각 스윕 발진 당 스파이크의 갯수가 결정된다으로 스파이크의 수를 계산한다.
    3. 발진 대기 시간을 계산합니다. 각각의 진동을 위해, 자극 인공물의 단부로부터 제 식별 스파이크의 시간을 뺀다.
    4. 평균 간 이벤트 간격 (ISI)를 계산합니다. 스파이크와 다중 검출 간의 평균 시간을 결정한다.
    5. 발진 기간을 계산합니다. 각 진동 내의 첫번째와 마지막 검출 스파이크 사이의 시간을 측정한다.

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결과

지층 oriens의 파상풍의 자극이 강력하고 재현 γ 진동 (35.4 ± 2.2 Hz에서) 생성, 그림 (b)를 참조하십시오. 진동은 CA3로부터 입력이 구부러진 32 G 바늘을 사용 CA2 영역 슬라이스를 절단하여 절단 된 CA1 로컬 네트워크 내에서 생성되었다는 것을 증명한다. 진동 로컬로 생성되는 것을 나타내는, (포경 조각 5.89 ± 0.8 스파이크를, N = 6;, 절단 조각 6.16 ± 1.1 스파이크 N = 6 P = 0.85) 절단 조각의 진?...

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토론

급성 뇌 조각의 CA1의 γ 진동을 생성하는 강력한 방법을 설명한다. 생성 된 진동은 제어 및 네트워크 (12)의 진동 신경 생리 학적 근거를 더 잘 이해하기위한 기회를 가능 지역 회로로부터 발생한다. AMPA 수용체, GABA 수용체, 나는 H와 T 형 칼슘 채널은 모든 모델에서 γ 진동 필요합니다. 여기에 설명 된 로컬 CA1 진동 견고하게 생성 될 수 있지만 이는 뇌 조각은 건강 ?...

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공개

저자가 공개하는 게 없다.

감사의 말

Supported by APA to RJH, NHMRC program grant 400121 to SP, and NMHRC fellowship 1005050 to SP. CAR acknowledges the support of the ARC (FT0990628) and the DOWD fellowship scheme. The Florey Institute of Neuroscience and Mental Health is supported by Victorian State Government infrastructure funds.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
4-(N-Ethyl-N-phenylamino)-1,2- dimethyl-6-(methylamino) pyrimidinium chloride (ZD7288)Sigma-AldrichZ3777
BiucullineSigma-Aldrich14340
6-cyano-7-nitroquinoxa- line-2,3-dione (CNQX)Sigma-AldrichC127
NickelSigma-Aldrich266965
CarbamazepineSigma-AldrichC4024
(2R)-amino-5-phosphonopentano-ate (APV)Tocris Bioscience0105
RetigabineChemPacific150812-12-7
Choline-ClSigma-AldrichC1879-5KG
KClSigma-AldrichP9333-500G
NaH2PO4Sigma-AldrichS9638-250G
NaHCO3Sigma-AldrichS6297-250G
NaClSigma-AldrichS7653-5KG
GlucoseSigma-AldrichG8270-1KG
CaCl2 • 2H2OSigma-Aldrich223506-500G
MgCl2 • 6H2OSigma-AldrichM2670-500G
Electrode glassHarvard Apparatus GC150F-10
Concentric bipolar stimulating metal electrode FHCCBBPF75
Digital IsolatorGetting InstrumentsModel BJN8-9V1 
Model 1800 amplifierA-M systemsModel 1800 amplifier
DigitizerNational IntrumentsNI USB-6211
VibrotomeLeicaVT1200s

참고문헌

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