Количественное тяжелых металлов и других неорганических загрязняющих веществ на продуктивность микроводорослей

Резюме

Integration of microalgal cultivation with industrial flue gas will ultimately introduce heavy metals and other inorganic compounds into the growth media. This study presents a procedure used to determine the end fate and impact of heavy metals and inorganic contaminants on the growth of Nannochloropsis salina grown in photobioreactors.

Аннотация

Повышение спроса на возобновляемые виды топлива имеет исследователей, изучающих возможность альтернативных сырья, таких, как микроводорослей. Присущие преимущества включают высокую потенциальную урожайность, использование не пахотных земель и интеграции с потоками отходов. Потребности в питательных веществах масштабной производственной системы микроводорослей потребует сцепление возделывания систем с ресурсами промышленных отходов, таких как двуокись углерода из дымовых газов и питательных веществ из сточных вод. Неорганические примеси, присутствующие в этих отходов может потенциально привести к биоаккумуляции в микроводорослей биомассы негативно повлиять производительность и предельный конечного использования. Это исследование фокусируется на экспериментальной оценки воздействия и о судьбе 14 неорганических загрязнителей (As, Cd, Co, Cr, Cu, Hg, Mn, Ni, Pb, Sb, Se, Sn, V и Zn) на Nannochloropsis роста Салина , Микроводорослей культивируется в фотобиореакторах освещаются в 984 мкмоль м ^-2 с ^-1 и выдерживают при рН 7 в рост мEdia загрязнены неорганических загрязнений на уровне ожидалось на основании композиции, найденного в коммерческих системах угля дымовых газов. Загрязняющих веществ, присутствующих в биомассе и среде в конце периода роста 7 дней были количественно анализировали с помощью холодного пара атомно-абсорбционной спектрометрии для Hg и через индуктивно-связанной плазмы масс-спектрометрии для As, Cd, Co, Cr, Cu, Mn, Ni, Pb, Sb, Se, Sn, V и Zn. Результаты показывают, N. Салина чувствительны к деформации различных металлов окружающей среды с уменьшением статистической биомассы yieldwith введения этих примесей. Методы, представленные здесь, являются достаточными для количественной оценки роста водорослей и определения судьбы неорганических загрязнений.

Введение

По сравнению с традиционными наземными культур микроводорослей были показаны для достижения более высоких биомассы и липидов урожаи из-за присущих более высокой эффективности преобразования солнечной ^1,2. Выращивание микроводорослей при высоких скоростях производительности требует питания различных питательных веществ, включая внешнего источника углерода. Ожидается, что крупные объекты роста будут интегрированы с потоками промышленных отходов, таких как промышленных дымовых газов с целью минимизации издержек производства и в то же время обеспечивает восстановление окружающей среды. Промышленные отходы углерода, как правило, в виде газообразного диоксида углерода и может содержать примеси, которые потенциально могут отрицательно повлиять производства микроводорослей. В частности, дымовой газ получают из угля будет иметь различные загрязнений, включая, но не ограничиваясь ими продуктов сгорания воды и углекислого газа, а также оксиды серы и азота, мелкой пыли, органических примесей, таких как диоксины и фураны, и неорганического Contaminants, такие как тяжелые металлы. Влияние большинства этих загрязнителей, включая неорганических с некоторыми из них известен как тяжелых металлов на продуктивность микроводорослей не были изучены. Некоторые из этих элементов могут быть питательные вещества в соответствующих концентрациях, однако при более высоких концентрациях они могут производить дисфункцию клеток и даже смерть ^3.

Интеграция микроводорослей с промышленной дымовых газов имеет потенциал непосредственно вводить неорганические загрязнения в ростовой среде. Уголь на основе дымовых газов имеет целый ряд неорганических элементов (например, As, Cd, Co, Cr, Cu, Hg, Mn, Ni, Pb, Sb, Se, Sn, V и Zn) в различных концентрациях, некоторые из которых, в странах с низким концентрация, представляют питательные вещества для роста микроводорослей. Неорганические загрязняющие вещества с высоким сродством связывается с микроводорослей и дополнительно сорбируются внутри через питательных перевозчиков. Некоторые неорганические загрязнители (т.е., Co, Cu, Zn и Mn) питательные вещества, которые являются частью ферментов включаютd в процессе фотосинтеза, дыхания и других функций ^3,4. Тем не менее, в избыточных металлов и металлоидов может быть токсичным. Другие элементы, такие как Pb, Cd, Sn, Sb, Se, As и Hg, не известны для поддержки функции клеток в любой концентрации и представляют собой средства питательных веществ металлов, которые могут негативно повлиять на ^3,5,6 роста культуры. Наличие любого из этих загрязняющих веществ имеет потенциал для производства негативное воздействие на функции клеток микроводоросли. Кроме того, взаимодействие нескольких металлов с микроводорослей усложняет динамику роста и имеет потенциал, чтобы влиять рост.

Крупномасштабные экономика были непосредственно связаны с производительностью системы культивирования ^7-19. Кроме того, средний утилизация в системе роста микроводорослей для открытых водоемах либо направляющими (ОВП) или фотобиореакторах (PBR) является критическим, поскольку он представляет 99,9 и 99,4% от массы, соответственно ^20. Наличие неорганических загрязнений в средствах массовой информации в конечном счете может ограничить мПроизводительность icroalgae и переработка СМИ в связи с загрязняющей накопления. Это исследование экспериментально определили влияние 14 неорганические загрязнители (As, Cd, Co, Cr, Cu, Hg, Mn, Ni, Pb, Sb, Se, Sn, V и Zn), в концентрациях, ожидаемых от интеграции систем выращивания микроводорослей с угля происходит дымового газа, на продуктивность N. Салина вырос в НРБ воздушных перевозок. Загрязняющие вещества, используемые в данном исследовании было показано, что не только присутствовать в угольной дымовых газов, но твердых бытовых отходов на основе дымовых газов, на основе биогенного топочного газа, городских сточных вод, добываемой воды, нарушение грунтовых вод и морской воды ^21-23. Концентрации, используемые в данном исследовании, основаны на том, что можно было бы ожидать, если бы системы роста микроводорослей были интегрированы с угольной основе СО ₂ источника с захвата эффективности продемонстрировано в коммерческих системах PBR ^20. Подробные расчеты, поддерживающие концентрации тяжелых металлов и неорганических загрязнений представлены в Napanи др. ²⁴ Аналитические методы были использованы, чтобы понять распределение большинства металлов в биомассе, средства массовой информации и среды. Методы, представленные включен оценку производительности потенциала микроводорослей в неорганической загрязнений стресса и количественного их конечного судьбы.

протокол

1. Система Рост

Рисунок 1. Система микроводорослей роста. () Воздуха rotometer, (Б) СО ₂ rotometer, (С) контроллер рН с соленоида (D) регистратор данных (E) в линию воздушных фильтров (F), заголовок распределения воздуха, (G), флуоресцентный свет банк, (Н) рН-метры, система (I), охлаждения (J), водяная баня (К) провод термопары (L), эрлифта фотобиореактор, (М) автономный обогреватель (N), ходить в парах капот, (О) вентиляционные (Р) подачи воздуха капиллярная трубка, (Q) воздушные фильтры (R) трубки для отбора пробы (S) PBR силиконовые крышки, и (Т)рН также в силиконовой крышкой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

1. Постройте следующую микроводорослей экспериментальную систему роста (рис 1).
   1. Приобретать двенадцать воздушных перевозок НРБ, состоящие из стеклянных трубчатых реакторах 4,5 см в диаметре и 80 см в высоту с выращивания мощностью 1,1 л с силиконовыми крышками. Приобретать нарезанные стекла капилляров (5 мм внешний диаметр 1 мм внутренний диаметр) 10 см (3 в PBR) и 85 см (по 1 на PBR) в длину.
   2. Замораживание силиконовые крышки в -80 ° C морозильнике. Смажьте сверло с глицерином и в то время крышки заморожены дрель 3 отверстия для размещения вентиляционные, отбора проб и доставки газа капиллярных трубок и 1 отверстие диаметром 17 мм для размещения рН зонда.
   3. Вставьте 3 капилляров в месте с самой длинной трубы, проходящей на 2 см от дна PBR. В другом капиллярной трубки добавить силиконовой трубки Wiго капиллярной трубки, прикрепленный к другому концу, проходящей в нужную точку дискретизации. Закройте отверстие для рН-метра с размером силикона пробки 21D.
   4. Увлажняйте окружающий воздух путем пропускания его через воду и доставить увлажненный воздух в заголовке распределения воздуха. Пропустите газ через 0,2 мкм фильтр и поставить его в суспензии водорослей через длинный доставки стеклянной капиллярной трубки.
   5. Доставка сжатого CO ₂ в увлажненной воздушного потока с целью поддержания нейтрального рН 7,0 ± 0,1 в культуральной суспензии. Управление скоростью доставки СО ₂ с автоматизированной СО ₂ диспансер системы (контроллер рН), что открывает магнитный соленоид, когда культуры водорослей достигает рН 7.1 и закрывает при рН 6,9.
   6. Обеспечить свет, используя 24 T5 люминесцентных ламп, которые приводят в среднем освещения 984 мкмоль м ^-2 с ^-1, аналогичной пика внешним условиям.
   7. Погружают НРБ на водяной бане, чтобы мAINTAIN постоянную температуру около 25 ° С. Контролировать температуру системы с помощью рециркуляции охладитель и автоматизированную нагрева циркулирующей воды ванны блока управления.
   8. Монитор температуры и рН в режиме реального времени и запись с регистратором данных.
   9. Убедитесь, что все компоненты системы роста микроводорослей правильно работать, особенно до уборки микроводорослей прививочный или подготовки неорганические загрязнения, поскольку они не могут быть сохранены.

2. Лаборатория Посуда Подготовка

1. Вымойте мерных колб, НРБ, бутыли и любые контейнеры, с мылом и водопроводной воды. Промыть деионизированной водой (ДВ).
2. Кислота промыть лабораторное оборудование для того, чтобы устранить любые следы неорганических загрязнений. Это может быть сделано с помощью одного из двух способов:
   1. Замочите лабораторное оборудование O / N в 10% микроэлемент сорта азотной кислоты (Внимание: не дыхание пары, концентрированная азотная кислота может привести к серьезным горения и токсичных паров, работа в вытяжном огоD Использование нитриловые перчатки, защитные очки и халат).
   2. Замочите посуду лаборатории в течение 15 мин в 50% следов металлов сорта азотной кислоты.
   3. Промойте лабораторное оборудование с DW тщательно, по крайней мере в 3 раза, делая, что все кислоту удаляют. Очень важно, что НРБ тщательно промыть, особенно трубы отбора проб и капиллярных трубок. Неспособность сделать это будет производить подкисления среды и возможного ингибирования роста. Испытание рН промывной воды, чтобы проверить все кислоты был удален.
   4. Стерилизовать НРБ, контейнеров и колб в автоклаве их при температуре 120 ° С и стандартном атмосферном давлении в течение по крайней мере 30 мин.

3. Н. Салина Средний Подготовка

1. Получение раствора А: Частично заполнить 1 л мерную колбу с DW. Вставка магнитной мешалкой и добавить химические вещества, приведенные в таблице 1, один за другим. Убедитесь, что каждый ингредиент растворяется перед добавлением следующего компонента. Удалить магнит и заполнить тысе колбу на 1 л объема отметки.

Компонент	Сумма добавить (г)	Конечная концентрация (г / л)
Н 3 ВО 3	0.900	0.900
На 2 МоО 4 · 2H 2 O	0,012	0,012
MnCl 2 · 4H 2 O	0.300	0.300
ZnSO 4 · 7H 2 O	0,060	0,060
CuSO 4 · 5H 2 O	0,020	0,020

Таблица 1:. Решение рецепт Количества количества, необходимые для приготовления 1 л концентрированного раствора.

2. Подготовка витамина решения: в трех отдельных обumetric колбы добавляют витамины, как показано в таблице 2. Фильтр каждого витамина раствора через стерильный шприцевой фильтр 0,2 мкм в стерильный контейнер. Сохранить витамины при -4 ° С в темноте.

Витамины	Сумма (мг)	Конечный объем (мл)	Конечная концентрация витамина (мг / л)
Биотин	12.22	500	24.43
Витамин В12	13.50	100	135.00
Тиамин гидрохлорид	977,63	500	1,955.27

Таблица 2:. Витамин решение Рецепт Количества количества, необходимые для приготовления концентрированной Солуния.

3. Частично заполнить 20 л автоклавируемый контейнер с DW и вставьте магнитной мешалкой. Поместите контейнер на верхней части магнитной мешалкой пластины и добавить химические вещества, приведенные в таблице 3 (за исключением витаминов), добавив их один за другим, и после каждого полного растворения. Заполните контейнер для достижения 20 L.

Компонент	Сумма добавить в среде	Блок
NaCl	350.00	г
CaCl 2 · 2H 2 O	3.00	г
KCl	9.60	г
На 2 SiO 3 · 9Н 2 O	1.14	г
MgSO 4 · 7H 2 O	29.60	г
КНО 3	20.40	г
KH 2 PO 4	1.36	г
Аммония железа цитрат	0.10	г
Решение	20.00	мл
Биотин решение *	818.00	мкл
Витамин В12 решение *	296,20	мкл
Тиамин гидрохлорид решение *	521,60	мкл
* Добавить в охлажденном автоклавного СМИ

Таблица 3: Н. Салина среднего рецепт. Количества суммы, необходимые в подготовке 20 л питательной среде.

4. Стерилизацию среды в автоклаве в течение 30 мин при 120 ° С и атмосферном давлении. Пусть средний воркуютл до комнатной температуры.
5. Поместите контейнер на магнитной мешалки пластины. Добавить витамины, полученного на стадии 3.2, и пусть средний тщательно перемешать.

4. Неорганические примеси массоподготовки

1. Частично заполнить мерных колб, указанные в таблице 4, DW и добавить отдельные соли в списке. Залейте DW до требуемой конечного объема и тщательно перемешать. Не сохранять эти запасы, как некоторые элементы адсорбируются на стенках колбы
   ВНИМАНИЕ: Некоторые неорганические загрязнители, используемые в настоящем протоколе являются канцерогенными, тератогенными и мутагенными свойствами, носить маску, перчатки и халат при обращении соли.

Аналит	Соль источник	Объем наличии подготовить (L)	Соль добавить в колбу60; (Мг соли)	Концентрации анализируемого вещества в культуру добавляли (мг анализируемого вещества / л)
В качестве	NAASO 2	0,1	14,8	7.74E-02
CD	CdCl 2	0,5	13,5	1.50E-02
Компания	CoCl 2 · 6H 2 O	0,5	34,7	1.56E-02
Cr	На 2 Cr 2 O 7 · 2H 2 O	0,1	40,6	1.29E-01
Cu	CuCl 2 · 2H 2 O	0,1	38,3	1.30E-01
Ртуть	HgCl 2	1.0	14.6	9.80E-03
Миннесота	MnCl 2 · 4H 2 O	0,1	58,8	1.49E-01
Ni	NiCl 2 · 6H 2 O	0,1	112,0	2.51E-01
Pb	PbCl 2	0,5	39,9	5.41E-02
Sb	Sb 2 O 3	0,5	26,7	4.06E-02
Се	На 2 SEO 3	0,5	11,8	9.80E-03
Sn	SnCl 2 · 2H 2 O	0,5	3.9	3.76E-03
В	V 2 O 5	0,1	22,2	1.13E-01
Zn	ZnCl 2	0,1	99,9	4.36E-01

Таблица 4:. ​​Концентрированный препарат неорганического загрязнения сток добавлением 1 мл этого концентрированного наличии в 1,1 л PBR среды производит конечной концентрации, показанной в последнем столбце.

2. Стерилизация неорганические запасы загрязняющих пропусканием раствора через стерильный шприцевой фильтр 0,2 мкм и собирают фильтрат в стерильную пробирку.

5. Н. Салина Инокулят Производство

1. В колбу Эрленмейера на 500 мл добавляют 200 мл среды, полученный на стадии 3, и затем добавляют 3 г агар. Накройте колбу алюминиевой фольги и автоклаве в течение 20 мин при 120 ° С. Залейте раствор в стерильных чашках Петри и дайте ему остыть до тех пор, пока застывает. Это должно быть завершено быть стерильным капотом или по крайней мере рядом с пламенем в чистой окружающей среде, чтобы уменьшить риск заражения.
2. Серия Н. Салина клетки в стерильные чашки-DISHES, полученного на стадии 5.1, используя стерильный посева петлю. Поместите чашку Петри культур на столе, освещенной с огнями T12 поддерживается при комнатной температуре. Пусть микроводорослей расти, пока колонии не видно.
3. Колонии передачи в стерильные толку колб Эрленмейера, содержащих 200 мл питательной богатой среде, подготовленные в шаге 3, и держать их на освещенной шейкер таблице (1000 оборотов в минуту). Давайте культуры растут до тех пор, пока среда становится зеленым.
4. Передача микроводорослей в 1,1 л стерильной PBR. Поместите PBR в посевной водяной бане освещается 200 мкмоль ^{м-2 с-1} с люминесцентными лампами T8 и поддерживается на уровне 23 ° С с помощью рециркуляционного охладителя и автоматизированной нагрева рециркуляционного контроля водяной бане. Отрегулируйте воздух и CO ₂ rotometers 2,5 л мин ^-1 и 25 см мин ^-1, соответственно.
5. После недели сплит рост биомассы в новых 1 .1 L НРБ, содержащих новую среду, и пусть он не расти, пока в общей сложности не менее 28 г сухого веса биомассыполученные между двумя реакторами, которые могут быть определены посредством оптической плотности.
6. Урожай посевной биомассы центрифугированием при 2054 х г в течение 15 мин при 10 ° С с использованием стерильных бутылки центрифуги и стерильные методы, чтобы избежать загрязнения. Утилизацию супернатанта и продолжают концентрации клеток по мере необходимости.
7. После того как все биомассу центрифугируют, повторно приостанавливать клеток в 300 мл свежего стерильной среде.
8. Развести 0,1 мл культуры микроводорослей в 3 мл DW, а затем разбавленную 0,1 мл этом новом растворе в 3 мл DW. Убедитесь, что образец тщательно перемешивают. Измерьте оптическую плотность (ОП) в микроводорослей концентрата на 750 нм () немедленно с помощью спектрофотометра.
9. Используйте уравнение (1) для определения количества биомассы в концентрате.
   Примечание: Уравнение (1) была получена из линейной регрессии между отношению к общей взвешенных твердых частиц (в г / л ^-1) для N. Салина (R ² = 0,9995). Уравнение 1 был разработан для СПЕКТРophotometer модели в таблице материалов, генерировать новую калибровку при использовании другой спектрофотометра модели.
   1. Используя уравнение (2) вычислить объем микроводорослей концентрата (по L), необходимых для получения плотности 4 г / л ^-1 культуры в PBR 1,1 л объема (л).

10. Использование стерильных методов, добавьте объем микроводорослей концентрата нашли на этапе 5.9 на автоклавного PBR достичь начальной плотности культуры 4 г / л ^-1. Заполните PBR со средой до 1,1 L. Повторите этот шаг, пока не 6 НРБ заражают. Поместите НРБ в посевной водяной бане.
11. Пусть микроводорослей в НРБ расти в течение 8 дней, а затем собирать биомассу (по повторяющимся шагом 5,6 до 5,7). Повторите шаг 5,8 для расчета начальнойОбъем инокулята для начальной плотности культуры 1 г / л ^-1.

6. Экспериментальные реакторы

1. С использованием стерильной методики добавить приблизительно 1 л среды, полученного на стадии 3 к каждой из 12-кислотных промывали стерильным НРБ. Поместите НРБ в водяной бане экспериментальной системы роста. Включите Промойте воздух на 1,5 л мин ^-1.
2. Стерилизация калиброванный рН-метр путем очистки его 70% -ным этанолом. Измерить рН среды в PBR и обеспечить рН примерно 7,0; если нет, повторите шаг 2, чтобы удалить кислоту выщелоченного от полоскания кислоты.
3. Калибровка каждого контроллера, используя рН буфера рН 7, дезинфекции зондов с использованием этанола (70%), а затем вставить их в крышках НРБ.
4. Для каждого PBR (за исключением контрольных НРБ) добавить 1 мл каждого из стерильных неорганические загрязнители запасов, подготовленных на шаге 4. Пусть загрязнения тщательно перемешать в PBR. Конечная концентрация неорганических загрязнений в НРБ являются шоуп в последней колонке таблицы 4, и расчетные максимальные концентрации ожидать от угольной электростанции интеграции.
5. Добавить 14 мл стерильного DW с контрольными НРБ.
6. Добавить концентрированного микроводорослей инокулята, полученного на стадии 5.11 экспериментальным НРБ, чтобы получить начальную плотность культуры 1 г / л ^-1. Пусть смесь биомассы тщательно.
7. Включите фары высокие интенсивности света (из 984 мкмоль м ^-2 с ^-1) и контроллеров рН и отрегулируйте CO ₂ до 30 см мин ^1. Увеличьте поток СО ₂ до 50 см мин ^-1 от 3 ​​день после. Начальная скорость потока с низким CO ₂ является критическим для того, чтобы избежать больших изменений в рН-за задержек в газ / жидкость передачи и измерения рН.
8. Измерьте и взять образцы по мере необходимости. Убедитесь, чтобы отметить уровень воды после отбора проб. (ВНИМАНИЕ: некоторые неорганические загрязнители в PBR являются канцерогенными, мутагенными и тератогенными; используйте перчатки и CAPPред контейнеры при работе с образцами).
9. Добавить стерильной DW ежедневно в НРБ с целью компенсации потерь из-за испарения.
10. После 7 дней роста, урожай биомассы путем центрифугирования при 9936 × г и сохранить как, биомассы и надосадочную среду, при -80 ° С.
11. Замораживание сухой биомассы на 0,1 мбар и -50 ° CO / N. Порошок биомассы (используйте шпатель для порошка биомассы внутри центрифуги трубы). Сохранение лиофилизированного биомассы при -80 ° С.

7. Микроволновая печь Assisted Переваривание образцов

Переваривание образцов биомассы требуется в качестве стадии предварительной обработки для анализа ICP-MS.
Примечание: Эти шаги применять закрытую микроволновой судно системы пищеварения с облегчением регулируемым давлением. (ВНИМАНИЕ: Высокое давление во время разработки кислотного разложения, проверьте физическую целостность сосудов и пищеварения щитов, и изменить крышки микроволновая пищеварения сосудов перед каждым использованием).

1. Вымойте тефлоновые микроволновая пищеварения сосуды с водой и мылом, промыть и пусть ДГ воздушные суда сухой. Для удаления загрязнений следов металлов в сосудах переварить кислоту, как описано в следующих шагах.
2. Реформирование микроволновой пищеварение крышки сосудов и закрыть флаконы плотно.
3. Добавьте 10 мл азотной кислоты на каждый.
4. Представьте судно в безопасности щит. Убедитесь, что не биомасса, вода или любые реагенты остаются на стенках защитного кожуха или в наружных стенах пищеварения сосудов во избежание повреждения защитного кожуха. Закрывают безопасности щит с предохранительным клапаном убедившись весна во флаконе находится на одном уровне. Найдите щит на роторе с крышкой отверстия направлены наружу в наружном ряду, а внутрь во внутренней подряд.
5. На судно номер один, вставьте керамической гильзы и датчика температуры. Этот термометр контролирует фактическую температуру во флаконе и служит в качестве контрольного параметра, чтобы выполнить пищеварения PROGRесть. Убедитесь, что номер один флакон содержит те же реагента и образца суммы, как и другие флаконах.
6. Входные параметры пищеварения показано в таблице 5 и начать пищеварение. Когда программа закончилась, воздух прохладный флаконы, пока они не достигнут RT.

Шаг	Флаконы для ополаскивания			Образец пищеварения
	Температура (° С)	Время (мин)	Максимум мощность (Вт)	Температура (° С)	Время (мин)	Максимум мощность (Вт)
1	RT 190	25	1000	RT 180	15	1000
2	190	10	1000	180	15	1000
Выпускной	-	20	-	-	20	-

Таблица 5: Параметры, используемые в программе микроволновая пищеварения.

7. Внутри вытяжкой, вставьте инструмент сброса давления на крышке экрана с крышкой отверстия направлены от вас. После сброса давления открыть крышку (ВНИМАНИЕ: Всегда открытые флаконы переваривается внутри вытяжного шкафа, поскольку биомасса пищеварения с использованием кислоты образуются токсичные газы).
8. Утилизировать кислоты. Промыть суда тефлоновые с DW 3 раза. Пусть флаконы высохнуть.
9. Для переваривания биомассы, добавить 50 мг сублимированного биомассы СВЧ пищеварения судов. Для контроля качества (КК) подготовить следующие флаконов: в двух разных флаконах добавить либо 5 мл Уровень 7 МСПМС или 5 мл Уровень 7 рт CVAAS стандарта подготовлен в шагах 9.1 и 10.1 (переваренной решения от этого флакона называется лабораторию укрепленный пустым (LFB)), оставьте еще флакон пустой (переваренной решениеиз этого флакона называется лаборатория реагента бланка (ЛРБ)).
10. Для переваривания среду, добавить 10 мл надосадочной среды для сухой кислоты промыть микроволновая пищеварения сосуды. Для контроля качества (КК) подготовить следующие флаконов: В двух разных флаконах добавить 5 мл Уровень 7 МСПМС или CVAAS стандарта металла, полученного на стадии 9.1 и 10.1 (переваренной решения от этого флакона называется LFB), в другой флакон добавить 10 мл DW (переваренный раствор, из этого флакона, называется LRB).
11. Реформирование микроволновой пищеварение крышки сосудов и закрыть флаконы плотно.
12. Добавить 7 мл концентрированной следов металлов класса азотной кислоты и 3 мл перекиси водорода в каждую пробирку. Перемешать содержимое, осторожно вращая решение. Дайджест содержимое флаконов, повторяя шаги 7,4 до 7,7 (использовать параметры СВЧ пищеварения для образца пищеварения в таблице 5).
13. Добавить переваривается образца в 25 мл мерную колбу, полоскание сосуды с DW для повышения восстановления. Заполните мерную колбу с DWдо отметки.
14. Передача переваривается образцы с колпачком контейнера. Сохранение образцов при 4 ° С до анализа не может быть завершена. Для этого анализа исследования делается тот же день на рт.ст. и в течение трех дней для других элементов.

8. Контроль качества (QC) Образцы

Примечание: Анализ образцов КК, чтобы обеспечить надежность результатов экспериментальных образцов.

1. Частично заполнить кислоты промыть 1 л мерную колбу с DW. Добавить 280 мл концентрированной трассировки металла марки азотной кислоты и тщательно перемешать (это решение также называется пустым раствор) (ВНИМАНИЕ: всегда добавлять кислоту в воду, не добавляйте воду в кислоту, как экзотермическая реакция может быть жестоким). Пусть решение остыть до комнатной температуры.
2. В дополнение к образцам КК, подготовленных в шагах 7,9 и 7,10, подготовить следующие образцы КК.
   1. Для продолжения проверки калибровки (CCV): Заполните полистирола трубки с калибровочной (для подготовки смшаг 9.2 и 10.1). Поставьте стандартное решение Hg на стойке CVAAS и МСПМС стандартного раствора в пробоотборник МСПМС.
   2. Для продолжения калибровки заготовки (БУВ): Заполните два полистирольные пробирки (16 мл) с пустой (раствора, полученного на стадии 8.1). Поместите один образец в CVAAS стойки и другой образец в пробоотборник МСПМС.
   3. Для лабораторного укрепленный матрицы (ЛЧМ): Случайный выбор 1 образец каждые 12 образцов для каждого типа образца (то есть, биомассы или средней) и использовать его для подготовки LFM. Для МСПМС, добавить 0,5 мл МСПМС стандартном уровне 7 и 3 мл переваренной экспериментального образца (либо из биомассы или среды) с полистирольной трубки.
   4. Смешайте содержимое и поместите флаконы на МСПМС пробоотборник. Для CVAAS, добавляют 2 мл Hg стандартный уровень 7 и 6 мл переваренной экспериментального образца (либо из биомассы или среды) с полистирольной трубки. Смешайте содержимое флакона и место на CVAAS стойки.
   5. Для дубликатов проб: Случайный выбор 1 образец когда-либоу 12 образцов для каждого типа матрицы (например, биомасса, средний, ЛЧМ или любой разбавляют матрица) и дублировать флакон. Поместите повторные флаконов в пробоотборник МСПМС или стойки CVAAS.
   6. Для дубликатов проб: Случайный выбор 1 образец каждые 12 образцов для каждого типа матрицы (например, биомассы, среде, МЛС или любой разбавленной матрицы) и дублировать флакон. Поместите повторные флаконов в пробоотборник МСПМС или стойки CVAAS.
3. Определить критерии качества данных для исследования. Для настоящего исследования дублировать критериям качества, установленным Eaton, Clesceri, Райс и Гринберг ^25. Параметры, установленные для контроля качества являются: процент разница (% D) для ККТ в пределах ± 10% ²⁵ (за исключением свинца и сурьмы, увидеть дискуссию), LFB восстановления процента (% R) в ± 70-130% ^25, ЛСМ процентов Восстановление (% R) в течение 75-125% ^25, и относительная разность процентов (РПД) в пределах ± 20% ^25, и продолжает CAлибрации пустым (БКК) ниже предела метод отчетности (МПО), ^25. См расчета уравнения в шаге 9.7.

9. Количественная индуктивно связанной плазмой Масс-спектрометрия (ICPMS)

1. В день анализа, передачи приблизительно 5 мл переваренной образца полистирола труб и поместите их в автоматический пробоотборник МСПМС. Добавить примерно 15 мл переваренной образцов полистирола труб и поместите их в CVAAS стойки.
2. В тот же день из анализа подготовить калибровочных стандартов. Добавить приобрели МСПМС стандартный раствор и залейте пустой (раствор, приготовленный на шаге 8.1), как описано в таблице 6 (см стандартное описание решения в таблице материалов) к кислотно-мерных колб ополаскивают.

Параметр	1-Й Уровень	Уровень 2	Уровень 3	Уровень 4	Уровень 5	Уровень 6	Уровень 7
Приобретенные стандарт будет добавлен (мл)	-	-	-	-	-	-	10.0
Уровень 7, которые будут добавлены (мл)	0.0	1.0	2.5	5.0	20,0	25,0	-
Конечный объем * (мл)	-	50,0	50,0	50,0	100,0	50,0	100,0
Конечная концентрация (мкг / л)
75 Как	0.0	2.0	5.0	10.0	20,0	50,0	1000,0
111 Cd	0.0	1.0	2.5	5.0	10.0	25,0	50,0
59 Со	0.0	10.0	25,0	50,0	100,0	250,0	500,0
52 Кр	0.0	2.0	5.0	10.0	20,0	50,0	100,0
63 Cu	0.0	5.0	12,5	25,0	50,0	125,0	250,0
55 Мп	0.0	3.0	7.5	15,0	30,0	75,0	150,0
60 Ni	0.0	8.0	20,0	40,0	80,0	200,0	400,0
208 Pb	0.0	1.0	2.5	5.0	10.0	25,0	50,0
121 Sb	0.0	12,0	30,0	60,0	120,0	300,0	600,0
51 V	0.0	10.0	25,0	50,0	100,0	250,0	500,0
66 Zn	0.0	4.0	10.0	20,0	40,0	100,0	200,0
* Достичь этого объема путем добавления раствора, полученного на стадии 8.1

Таблица 6: Концентрация калибровочных Уровни 1 до 7..

3. Удалить конусы из МСПМС и разрушать ультразвуком их в течение 1 мин в DW. Высушите конусов и положил их обратно в прибор.
4. Включите чиллера, газы (Ar, H _2, He), МСПМС, подключаемые к линии внутреннего стандарта, и заполнить автоматического пробоотборника полоскания контейнеров (DW, 10% азотной кислоты, 1% азотной кислоты + 0,5% соляной кислоты) ,
5. Откройте программное обеспечение MassHunter Workstation и включите плазмы, мелодии МСПМС и загрузить метод установки с параметрами в таблице 7.

Параметры	Ценности
Внутренние стандарты	72 Се, 115 В
ВЧ-мощность	1500 Вт
Расход газа с плазменным	14.98
Расход газа-распылителя	1,1 л / мин (носитель и разбавление газа в сочетании - 0,6 + 0,5 л / мин)
Отбор конусная	Никель на х линзы
Скиммер конус	Никель
Образец скорость поглощения	0.3 RPS
Ингалятор насос	0.1 RPS
S / С Температура	2 ° С
Сканирование состояние	Выдержка времени 1 сек, количество повторных 3
Поток 2 газа Н	N / A
Он расхода газа	4,3 мл / мин

Таблица 7: МСПМС условия эксплуатации.

6. Поместите калибровочный стандарт, образцы КК и экспериментальные образцы в пробоотборник. В программном обеспечении МСПМС добавить последовательность анализа и анализа проб. Аспирируйте образец внутри прибора к плазме, где элементы ионизированной. Затем вакуум отзывает ионы в счетчике. Ионы будут отделять в зависимости от их атомного веса от легких к тяжелым.
   ВНИМАНИЕ: Сбор МСПМС отходов в опасных сдерживания и обрабатывать соответствующим образом для утилизации.
7. Убедитесь, что значение коэффициента корреляции (R) для калибровочной кривой для каждого металла или металлоида больше 0,995 ^24.
8. Во время анализа проб, рассчитать% R,% D и RPD, как описано в уравнениях 3 до 6 ²⁶ и сравнить результаты с критериями качества данных проекта в 8,3.
   1. Рассчитать процентное восстановление (% R), чтобы определить потери / обретения из лабораторного укрепленный блапк (LFB) и матрица помехи от лабораторного укрепленный матрицы (ЛЧМ).

2. Рассчитать процентное различие (% D) для определения изменений производительности инструмент со временем при работе образцы ККТ.

3. Рассчитать относительную разницу процентов (RPD) для определения изменений в точности метода со временем при работе экспериментальные образцы.

9. Для уменьшения помех матрицы (% R из допустимого диапазона), разбавить образцы для бедных% R в соотношении 1: 3 (образец: DW).

10. Рт количественное от холодного пара атомно-абсорбционной спектрофотометра (CVAAS)

1. Подготовка калибровочных стандартов тот же день анализа. Развести выбирают Hg стандарт добавлением 1 мл стандартного раствора приобретенного рт.ст. к 100 мл мерную колбу и залить раствора, полученного на стадии 8.1.
   1. Добавить 2,5 мл этого раствора в 100 мл мерную колбу и залить раствора, полученного на стадии 8.1 (это новое решение Уровень 7 рт.ст. стандарт). Добавить разбавленный Уровень 7 рт стандарт мерных колб и заполнить пустой (раствор, приготовленный на шаге 8.1.), Как описано в таблице 8 (см приобрели рт стандартное описание решения в таблице материалов).

Параметр	1-Й Уровень	Уровень 2	Уровень 3	Уровень 4	Уровень 5	Уровень 6
L7 рт стандарт будет добавлен (мл)	0	1	2.5	5	20	25
Конечный объем * (мл)	-	50	50	50	100	50
Конечная концентрация (мкг / л)	0	0,5	1.25	2.5	5	12,5
* Достичь этого объема путем добавления раствора, полученного на стадии 8.1

Таблица 8: Концентрация ртути калибровочного стандарта Уровни 1 до 6..

2. Открыть газовый Ar и воздушный клапан, включите атомной Absorpния спектрофотометр и впрыска потока по атомной спектроскопии (ФИАС). Откройте программное обеспечение CVAAS WINLAB, включите рт лампы и дайте ему прогреться до тех пор, энергетический параметр программного обеспечения не достигнет 79. Нагрузка по программам рт анализа с параметрами в таблице 9. Отрегулируйте светлый путь в приборе, чтобы дать максимальное пропускание.

Параметры	Ценности
Газ-носитель	Аргон, 100 мл / мин
Лампа	Рт безэлектродную газоразрядных ламп, установка на 185 мА
Длина волны	253,7 нм
Щель	0,7 нм
Температура сотовый	100 ° С
Объем пробы	500 мкл
Носитель	3% HCl, 9,23 мл / мин
Восстановитель	10% SnCl 2, 5,31 мл / мин
Измерение	Пик высота
Читайте повторов	3

Таблица 9: CVAAS условия эксплуатации.

3. Подключите линию к решению носителя из 3% следов металла марки соляной кислоты.
4. Подключите линии к восстановителя раствора, приготовленного из 10% хлорида олова (подходит для анализа ртути) в 3% класса микроэлемент соляной кислоты. Подготовьте это решение в тот же день анализа, он склонен к атмосферному окислению (ВНИМАНИЕ: хлорид олова очень опасно, используйте защитную одежду при работе с ним собирать CVAAS отходов в опасных сдерживания и правильно распоряжаться.).
5. Поместите стандарты ртути, образцы КК и экспериментальные образцы в стойке CVAAS и ввода последовательности в программном обеспечении CVAAS WINLAB. Запустите стандарты и генерировать уравнение калибровки.
6. Выполнить КК СэмПлес и экспериментальные образцы. CVAAS потребляет приблизительно 5 мл образца в прибор, уменьшает Hg присутствует в образце до элементарной ртути (Hg ⁰⁾ газа и продувает газ из раствора с газом-носителем (Ar) в замкнутой системе. Рт пар проходит через ячейку в пути лампа накаливания в рт. Детектор определяет свет, поглощенный в 253,7 нм и соотносит его концентрации. (ВНИМАНИЕ: паров ртути является токсичным, обеспечить инструмент вытяжка на месте).
7. Рассчитать% R,% D и RPD в шаге 9.7 во время анализа и сравнения результатов к критериям качества данных проекта.

Результаты

Доходность биомассы

Производство N. заИпа в системе PBR, используемого в этом исследовании выросли с 1 г / л ^-1 до 8,5 ± 0,19 г / ^{л-1 (N} = 12) для управления реакторами и 4,0 ± 0,3 г / л ^-1 (N = 12) мульти-металл загрязнены в течение 7 дней. Эксперименты производятся повтор?...

Обсуждение

Соленая микроводорослей Н. Салина можно с успехом выращивать в проектируемой системе роста с повторяемых результатов и высоких урожаев биомассы. Воздушные перевозки перемешивание допускается для хорошо смешанной приостановлено культуры с минимальной оседания или обрастания в ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals
Sodium chloride	Fisher Scientific	S271-3
Calcium chloride dihydrate	Fisher Scientific	C79-500
Potassium chloride	Fisher Scientific	P217-500
Sodium meta silicate nonahydrate	Fisher Scientific	S408-500
Magnesium sulfate heptahydrate	Fisher Scientific	M63-500
Potassium nitrate	EMD Chemical	PX1520-5
Potassium phosphate monobasic	Fisher Scientific	P285-500
Ammonium ferric citrate	Fisher Scientific	I72-500
Boric acid	Fisher Scientific	A73-500
Sodium molybdate, dihydrate	EMD Chemical	SX0650-2
Manganese chloride tetrahydrate	Fisher Scientific	M87-500
Zinc sulfate heptahydrate	Fisher Scientific	Z68-500
Cupric sulfate pentahydrate	Fisher Scientific	C489-500
Biotin	Acros Organics	230090010
Thiamine	Acros Organics	148990100
Vitamin B12	Acros Organics	405920010
Copper (II) chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	221783-100G	Irritant, Dangerous to the Environment
Lead (II) chloride	Sigma-Aldrich	268690-250G	Toxic, Dangerous to the Environment
Sodium dichromate dihydrate	Sigma-Aldrich	398063-100G	Oxidizing, Highly Toxic, Dangerous to the Environment
Cobalt (II) chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	255599-100G	Toxic, Dangerous to the Environment
Nickel (II) chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	223387-500G	Toxic, Dangerous to the Environment
Sodium (meta) arsenite	Sigma-Aldrich	71287	Toxic, Dangerous to the Environment
Cadmium chloride	Sigma-Aldrich	202908-10G	Highly Toxic, Dangerous to the Environment
Mercury (II) chloride	Sigma-Aldrich	215465-100G	Toxic, Dangerous to the Environment
Tin (II) chloride dihydrate	Fisher Scientific	T142-500	Corrosive. Suitable for Hg analysis. Very hazardous.
Manganese chloride tetrahydrate	Fisher Scientific	M87-500
Vanadium (V) oxide	Acros Organics	206422500	Dangerous to the Environment
Carbon dioxide	Air Liquide	I2301S-1	Compressed
Hydrogen peroxide	H325-500	Fisher Scientific	30% in water
ICP-MS standard	ICP-MS-6020	High Purity Standards
Mercury standard	CGHG1-1	Inorganic Ventures	1000±6 µg/mL in 5% nitric acid
Argon	Air Liquide		Compressed
Helium	Air Liquide		Compressed, ultra high purity
Hydrogen	Air Liquide		Compressed, ultra high purity
Nitric acid	Fisher Scientific	A509-P212	67-70% nitric acid, trace metal grade. Caution: manipulate under fume hood.
Hydrochloric acid	Fisher Scientific	A508-P212	35% hydrochloric acid, trace metal grade. Caution: manipulate under fume hood.
Equipment
Scientific prevacuum sterilizer	Steris	31626A	SV-120
Centrifuge	Thermo Fisher	46910	RC-6 Plus
Spectrophotometer	Shimadzu	1867	UV-1800
pH controller	Hanna	BL981411	X4
Rotometer, X5	Dwyer	RMA-151-SSV	T31Y
Rotometer, X5	Dwyer	RMA-26-SSV	T35Y
Water bath circulator	Fisher Scientific	13-873-45A
Compact chiller	VWR	13270-120
Freeze dryer	Labconco	7752020
Stir plate	Fisher Scientific	11-100-49S
pH lab electrode	Phidgets Inc	3550
Inductively coupled plasma mass spectrometer	Agilent Technologies	7700 Series ICP-MS	Attached to autosampler CETAC ASX-520
FIAS 100	Perkin Elmer Instruments	B0506520
Atomic absorption spectrometer	Perkin Elmer Instruments	AAnalyst 800
Cell heater (quartz)	Perkin Elmer Instruments	B3120397
Microwave	Milestone		Programmable, maximum power 1,200 W
Microwave rotor	Milestone		Rotor with 24-75 ml Teflon vessels for closed-vessel microwave assisted digestion.
Materials
0.2 μm syringe filter	Whatman	6713-0425
0.2 μm syringe filter	Whatman	6713-1650
0.45 μm syringe filter	Thermo Fisher	F2500-3
Polystyrene tubes	Evergreen	222-2094-050	17 x 100 mm w/cap, 16 ml, polysteryne
Octogonal magnetic stir bars	Fisher scientific	14-513-60	Magnets encased in PTFE fluoropolymer