Cryosectioning Метод микродиссекции мышиной слизистой оболочки толстой кишки

Резюме

Here we describe a simple method for the isolation of spatially distinct murine colonic epithelial surface cells from the underlying crypt-base cells.

Аннотация

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The colonic epithelium is dynamically turned over and epithelial cells are generated in the stem cell containing crypts of Lieberkühn. Progenitor cells produced in the crypt-bases migrate toward the luminal surface, undergoing a process of cellular differentiation before being shed into the gut lumen. In order to study these processes at the molecular level, we have developed a simple method for the microdissection of two spatially distinct regions of the colonic mucosa; the proliferative crypt zone, and the differentiated surface epithelial cells. Our objective is to isolate specific crypt and surface epithelial cell populations from mouse colonic mucosa for the isolation of RNA and protein.

Введение

Ободочной эпителия подкладка высоко регенеративного ткани, с резидентов стволовые клетки пополнения ткани через каждые несколько дней ^1. Этот процесс регенерации требует поддержания пролиферативного стволовых клеток отсеке. Со временем, вновь полученные дочерние клетки теряют пролиферативным потенциалом и мигрируют к поверхности просвета кишечника. Одновременно с миграцией, клетки-предшественники дифференцируются в зрелые барьерных формирования энтероцитов или слизистых бокаловидных клеток, продуцирующих. Отказ эта дифференциация программы, как полагают, внести свой ​​вклад в угрозу эпителиальный барьер, таких как наблюдается при воспалительных заболеваниях кишечника и рака толстой кишки ^2,3.

Детальное изучение этих процессов потребует методологии выделения крипт-базы и поверхности клеточной популяции. Существуют различные методы, каждый со своими уникальными преимуществами и недостатками. Современные методы выделения эпителиальных клеток кишечника включают CHelating агенты и механические диссоциации, в результате изоляции целых склепы, эпителиальных листов, или одиночных клеток, в зависимости от условий эксперимента. ^4,5 Эти методы дают высокие, но изменения в межклеточной сигнализации сообщалось в этих условиях, которые не могут представлять родную среду ^6,7. Лазерная захвата микродиссекции позволяет для сбора пространственной отдельного материала, но достигает низкой молекулярной ^8,9 текучести. В человеческой толстой ткани, последовательные горизонтальные методы cryosectioning были разработаны ^10. Тем не менее, мышиные слизистой ткани чрезмерно мал для непосредственного присвоения этой техники. В людях, длина кишечника склеп (отдаленные между склепа базы и поверхностных клеток) в толстой кишке колеблется от ~ 100-1000 мкм ^11. У мышей, склеп длины между ~ 50-300 мкм (рис 1А). Небольшой размер мышиных склепов представляет проблему для Изолации этих двух клеточных популяций с использованием существующих протоколов.

Опишем низкую стоимость, метод высокого урожая для изоляции склепа базы и поверхности эпителиальных клеток мышиной населения в толстой ткани. Ткань собирали таким образом, может затем быть проанализированы с помощью ряда стандартных последующих применений, в том числе иммунофлуоресценции окрашивания, RT-PCR (в реальном времени полимеразной цепной реакции) или Вестерн-блоттинга.

протокол

Эксперименты использованы мышей C57BL / 6 от 10 до 12-недельного возраста. Все процедуры с использованием животных были рассмотрены и утверждены университета Институциональная комитета Эмори Уход за животными и использование и были выполнены в соответствии с национальными институтами здравоохранения критериев.

1. Экспериментальная установка

1. Настройка криостат
   1. Равновесие криостат до -20 ° С, в том числе лезвия микротома и патронов (проявлять особую осторожность вокруг лезвия!).
   2. Заполните пустой cryomold с октября (оптимальное температуры резания соединение) и уравновешивают до -20 ° С (~ 30 мин). Удалить замороженного октября из формы и закрепить его на патроне с жидким октября Поместите блок / патрон в микротома руку и позволяют ОКТ установить в течение 10 мин.
   3. Установите криостат до 10 мкм на секции и бриться блок октябре, пока он не является плоской. Назад микротоме руку подальше от ножа на несколько сантиметров. На данный момент не отрегулировать лезвие или патрон для оставшейся части Experiment.
2. Подготовка бритвенных лезвий: Подготовка 2 лезвия на образец. Использование металла файл, скучно обостряла край лезвия. Затем удалите алюминия фланец с щипцами.
3. Предварительно охладить блюдо Pyrex или другой плоской поверхности на сухом льду.
4. Подготовка рассечение блюдо с 10-15 булавки рассечение. 10 см культуре ткани блюдо 50% заполнены кремния хватит. Добавляют 5 мл буфера Хенкса при комнатной температуре.

2. Препарирование дистальной ободочной ткани

1. Место мышей в герметичной камере и усыпить мышей ИФ ингаляции и шейных позвонков, затем спрей 70% этанола на животе и грудной клетки ^12.
2. Сделайте небольшой надрез в коже живота с ножницами, а затем сделать разрез, чтобы обнажить брюшную полость. Аналогичные процедуры могут быть найдены описано здесь ^12.
3. Вырезать толстую кишку на грани анального и дразнить друг от друга брыжейки толстой кишки до не свободен.
4. Акцизный дистальный толстой кишкиСегмент между 0 и 6 см от заднего прохода. Здесь глубина крипт составляет ~ 150 мкм (см фиг.1В). Разрежьте продольно толстой кишки с помощью ножниц и удалить содержимое фекальные.
5. Прикрепите ткань к рассечение блюдо с поверхности слизистой оболочки вверх. Стретч ткани с помощью булавки рассечение на кремниевой блюдо в Хэнкс буфера и оставьте на 10 мин при комнатной температуре (рис 1в). Это устраняет складки из ткани и позволяет мышечные слои, чтобы расслабиться.

3. Установите ткани на криостат для секционирования

1. Слайд лезвие под нужный раздел ткани, а затем вылейте буфер Хэнкса. Добавить еще лезвие к вершине, делает бутерброд. Вырезать сегмент ткани и удалить штифты. Перевести бутерброд лезвие / тканей к сухим льдом. Разрешить ткани, чтобы заморозить (5-10 мин, рис 1D).
2. Возьмите бритвы бутерброд / ткани и дайте ему прогреться слегка касаясь пальцем на верхнем блADE (слизистой стороной вверх. Это ориентирует ткани так, что базальные слои мышц подразделяются в первую очередь.). Отдельные бутерброд и вырезать вокруг краев сегмента ткани. Вырезать сегмент ткани примерно 0,5 см х 1 см. Краевые участки имеют тенденцию к скручиванию, в результате чего серийные срезы содержат много слоев ткани. Обратите внимание, что более-резки лучше, чем под резки, так ошибаться в сторону осторожности.
3. Разрешить ткани, чтобы нагреть, пока лед в верхней части ткани не начинает плавиться. В этот момент быстро и тщательно нажать ткани в блоке октября в криостате.
4. Удалить лезвие, расположив пальцы по образцу. Теплопередачи позволит вам удалить лезвие, не нарушая ткани.
5. Пальто ткани с октября до равновесия в течение 5 мин. Сокращение на секции 10 мкм (рис 1E, F). Осмотрите секции до тех пор, склепы не видел. Место участки в 1,5 мл пробирки или на слайдах.
6. Для анализа мРНК или белка, место тон пробует в трубах с 5 склепа базы, 5 переходный и 5 участков поверхности в трубке. Для сбора РНК добавить 1 мл реагента коммерческой изоляции и инкубировать при комнатной температуре в течение 10 мин. Выполните очистку РНК в соответствии с инструкциями изготовителя. Использование 5-10 мкг общей РНК для генерации кДНК.
7. Для очистки белка, добавить 0,5 мл холодного буфера для лизиса RIPA (плюс ингибиторы протеазы) за 5 разделов. Разрушать ультразвуком 3 раза по 70% цикла, на льду.
   1. Добавить примеры для SDS-PAGE загрузки буфера (буфера Лэммли) и инкубируют при 100 ° С в течение 10 мин. Предметные образцы в ДСН-ПААГ и передачи, то блок, в 5% молоке / PBS в течение 2 часов. Выполнение Вестерн-блоттинга с последующей инкубацией с Klf4 антител (1: 500) O / N при 4 ° С.

Результаты

Разделы толстой кишки ткани были обработаны для гистологического оценки и Н & Е окрашивания ^13. Традиционный разрез слизистой оболочки видно на фиг.2А. Базальные области содержат наружный мышечный, состоит в основном из круговых мышечной. Исходя сторону просвета, мышечной слизистой очевидно, прилегающих к Crypt-база эпителиальных клеток, переходные клетки находятся в середине ткани, и, наконец, популяции клеточной поверхности сталкиваются просвета кишечника. Последовательный метод секционирования описано здесь сохраняет ориентацию таким образом, чтобы продольные и круговые мышечной встречаются первый (фиг.2В), а затем в мышечной слизистой (фиг.2с). Обратите внимание на внешний вид немышечных интерстициальных клеток в верхнем левом углу изображения. Для анализа на выходе описано ниже, участки мышц, отбрасываются. Последующие разделы содержат эпителиальные клетки и интерстициальной ткани (собственная пластинка), Начиная с склеп-базовых элементов (рис 2D). Обратите внимание на отсутствие центрального просвета в наиболее склепы, которые темнее из-за плотно упакованных ядер. Эти слои содержат пролиферативную отсек. Переходные клетки появляются, как плотно железы с выдающимися центральных люмен (рис 2E). Наконец, население клеточной поверхности имеют неправильную структуру, с участками эпителия монослоя смотреть анфас (рис 2F).

Серийные срезы, как описанные выше, также могут быть обработаны для иммунофлуоресцентного маркировки и конфокальной микроскопии (как описано здесь, ^14). Рисунок показывает 2G изолированные крипты фиксированные и проницаемыми в 100% метанола, а затем окрашивали в течение ядер (синий) и клетка-клетка соединительной белка блокатора малой зоны Occludens 1 (ZO-1, зеленый). В традиционной ориентации срезов, склеп и клеточной поверхности можно рассматривать одновременно (рис 2G ). Обратите внимание, что в ЗО-1 узловой пятно линий просвет толстой склепе. Это Z0-1 прокладка просвет можно также рассматривать в последовательных секционных образцов переходных клеточных популяций, в центре круглого желез (рис 2G). Расширенные ZO-1 пятно видно в популяциях поверхность клеток (рис 2I и J).

Несколько факторов дифференциации, как известно, выражается в пространственно-временной моды вдоль оси крипта-поверхность. Это включает транскрипционный фактор Kruppel-подобный фактор 4 (Klf4), который, как известно, обогащенный популяций клеточной поверхности. При использовании традиционных способов секционирования, KLF4 находится в ядрах просвет, стоящих население поверхности клетки (рис 2K). Поэтому мы предположили, что KLF4 мРНК будет преимущественно экспрессируется в популяциях поверхности клеток. Чтобы проверить это, серийные срезы были собраны и сгруппированы в поверхностные, в переходный период, и склеп-базовых образцов. Subsequently, РНК собирали при помощи стандартного извлечение тризола, с дополнительным Очистка колоночной RNeasy и лечения ДНКазы. РНК была получена из 5 объединенных последовательных секций, которые дали между 5-10 мкг общей РНК в образце. Эти образцы были затем подвергнуты полуколичественный ПЦР в реальном времени и для KLF4 и контрольного гена, ТАТА-блок связывающего белка 1 (ТБФ-1) (рис 2 л) ^14. Как показано на рисунке 2 л, после нормализации до ТБФ-1, на поверхности клетки экспрессируют вплоть до 8 раз KLF4 мРНК, что выражается в клеток крипт. Аналогичным образом, уровень белка KLF4 было обнаружено обладают пространственной регулирование вдоль оси крипты поверхности. Серийные срезы были объединены, как описано выше, а затем инкубировали в буфере для лизиса в течение 20 мин при 4 ° С. Это давало между 200-250 мкг белка в образце. Затем образцы подвергали анализу с помощью SDS-PAGE (рис 2М) ^15. Как показано на рисунке 2М, KLF4 рУровни rotein являются значительно выше в популяциях клеточной поверхности. Вышеуказанные результаты показывают способность этого протокола, чтобы изолировать большое количество поверхности и эпителиальных клеток крипт из мышиного слизистой оболочки толстой кишки.

Рисунок 1: () Схематическое изображение мышиный слизистой оболочки толстой кишки и внешние слои мышц. Наш метод направлен на сбор отдельные группы клеточной поверхности и склеп-базовые сотовые последовательным cryosectioning (10 мкм каждый). Внешние слои мышц, отбрасываются. Высота (В) Crypt изменяется вдоль длины ободочной кишки (расстояние между крипт-базовых и поверхностных слоев). Точки данных указывают отдельные измерения склеп и символы указывают на биологические повторов (N = 4). (C) сегментов толстой кишки собирают, пополам, и удержал на кремниевую рассекает блюдо. (D) тканей себеgment примерно 3 см от заднего прохода нажата между ними, чтобы бритвенных лезвий и замораживали на сухом льду. (Е) ткани затем монтируется на предварительно выровнена блока Октябрь. (F) криосрезах удаляют и визуально.

Рисунок 2:. Представительные данные () толстой ткани окрашивали гематоксилин-эозином в поперечном сечении, показывающий циклические мышечной (см), мышечной слизистой (мм), крипты-Базовые элементы, переходные клетки, и поверхностные клетки. (В - С) толстой слои мышц. (D) Склеп-базовые клетки. Обратите внимание на отсутствие центрального просвета. (Е) Переходные клетки. (F) поверхности клетки. (G), иммунофлуоресценции окрашивание изолированных кишечных крипт. ZO-1 (зеленый) и ядра (синий) наблюдаются в поперечном сечении. (HI) ZO-1 и ядерного окрашивание в переходных и поверхностных клеток. (J), увеличенный вид ZO-1 окрашивания. (К) KLF4 (зеленый) обогащен населения клеточной поверхности. (L), ПЦР в реальном времени оценка уровня мРНК KLF4 между тремя отделениями. (М) Вестерн-блот-анализ уровней белка Klf4 в этих клеточных популяций.

Обсуждение

Молекулярные механизмы, участвующие в толстой пролиферации эпителиальных клеток и дифференцировки плохо изучены. Это включает в себя пробелы в нашем понимании клеточной среде передачи сигналов из стволовых клеток отсеке в основании ободочной эпителиальных криптах. Существует также растущий интерес к процессам, которые лежат в основе дифференциации энтероцитов. Например, более глубокое понимание дифференциации в естественных условиях требуется в качестве ориентира для исследований, направленных на производство в пробирке первичных кишечных систем ^16.

Выше процедура состоит из нескольких шагов, которые требуют особого внимания. Во-первых, удаление ребра вокруг замерзшего участка ткани (как описано в разделе 3.2) требуется как ткани краев скручиваться во время вскрытия и замерзания. Несоблюдение этих краях двигаться результатов является смешанное население наземных и склеп базовых клеток. Монтаж ткани на предварительно охлажденной, сравняли октября блок также имеет важное значение. Тего протокол может быть адаптирован для других областей дистального отдела толстой кишки, изменяя количество секций в каждом пуле. Например, как показано на фиг.1В, через слизистую оболочку длина крипт варьирует между 150-300 мкм. Таким образом, при изучении область между 4 см-6 см от заднего прохода, количество секций должна быть увеличена с 15 до 30. Важно отметить, что этот протокол не предложил для проксимального двоеточия (7 см-9 см) из-за складок ( смятия obliquae), которые проходят в полость делает невозможным отдельных поверхностных и крипт-базовых клеток путем последовательного секционирования.

Последовательные методы срезов были исследованы Crypt-базу и поверхности эпителиальных клеточных популяций в организме человека. Тем не менее, наш протокол добавляет дополнительные шаги, которые необходимы из-за небольшого размера мышиного ткани. Мы полагаем, что выше протокол позволит расследования склепа базы и населения поверхность эпителиальных клеток генетически послушными систем мыши. Действительно, объединенные разделы YieLD белок высокого качества и РНК подходит вниз анализ. Будущие приложения могут включать в себя изучение сигнальных путей клетки или иммунопреципитации хроматина. Тем не менее, следует отметить, что, как и некоторые из альтернативных методов, описанных выше, в результате участки содержат смесь эпителиальных и интерстициальных клеток собственной пластинки. В заключение, протокол, описанный здесь, обеспечивает быстрое, высокую урожайность метод для анализа молекулярных процессов в пространственно отдельных регионах мышиного слизистой оболочки толстой кишки.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microtome	Leica Biosystems, Nussloch Germany	CM 1510-3
MyiQ real time PCR detector	BioRad
LSM 510	Carl Zeiss		Confocal microscope
OCT	Tissue-Tek, Sakura Finetek, Torrance CA	4583
cryo-mold	Tissue-Tek, Sakura Finetek, Torrance CA	4557	25mmx20mmx5mm
High profile microtome blade	Leica Biosystems, Nussloch germany	818
GEM industrial blades	American Safety Razor Blades	62-0314
Sylgard silicon elastomere base	Dow Corning, Midland MI	3097358
27 1/2 g needle	Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ	305109	pins for dissection
TRizol	Life Technologies	15596018
Rneasy	Qiagen	74104
DNAse	Qiagen	79254
Antibody ZO-1	Invitrogen	187430
Antibody KLF4	Cell Signaling	4038S
Antibody mGAPDH	Sigma	G8795
Antibody Secondary Alexa conjugate	Invitrogen	A11034	488 anti-rabbit
Antibody Secondary HRP conjugate	Jackson	111/115-001-003	rabbit/mouse
Topro-3	Invitrogen	T3605
HANKs balanced salt buffer	Life Technologies	14025092
RIPA lysis buffer			50mM Tris-HCl pH 7.4 150mM NaCl 1% NP40 0.25% Na-deoxycholate
primer TBP 3'			GGAATTGTACCGCAGCTTCAAA
primer TBP 5'			GATGACTGCAGCAAATCGCTT
primer KLF4 3'			TGTGACTATGCAGGCTGTGGCAAA
primer KLF4 5'			ACAGTGGTAAGGTTTCTCGCCTGT