쥐 대장 점막의 이외에 Microdissection을위한 냉동 절편 방법

요약

Here we describe a simple method for the isolation of spatially distinct murine colonic epithelial surface cells from the underlying crypt-base cells.

초록

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The colonic epithelium is dynamically turned over and epithelial cells are generated in the stem cell containing crypts of Lieberkühn. Progenitor cells produced in the crypt-bases migrate toward the luminal surface, undergoing a process of cellular differentiation before being shed into the gut lumen. In order to study these processes at the molecular level, we have developed a simple method for the microdissection of two spatially distinct regions of the colonic mucosa; the proliferative crypt zone, and the differentiated surface epithelial cells. Our objective is to isolate specific crypt and surface epithelial cell populations from mouse colonic mucosa for the isolation of RNA and protein.

서문

결장 상피 라이닝 상주 ​​줄기 세포가 수일마다 ^한 조직 보급과 고도로 재생 조직이다. 이러한 재생 처리는 증식 성 줄기 세포 구획의 유지 보수를 필요로한다. 시간이 지남에 따라 새로 생성 된 딸 세포는 증식 잠재력을 잃고 장의 내강면을 향해 이동한다. 마이그레이션과 일치는 전구 세포는 성숙한 배리어 형성 장 세포 또는 점액 생산 배 세포로 분화. 이 분화 프로그램의 실패는 염증성 장 질환 및 결장암 ^2,3-에서 관찰 된 바와 같이 상피 장벽을 저하에 기여하는 것으로 생각된다.

위의 과정의 자세한 연구는 토굴베이스 및 표면 세포 인구를 분리하는 방법이 필요합니다. 여러 방법이 고유 한 장점과 단점이 각각 존재한다. 장 상피 세포의 분리를위한 현재의 방법은 채널을 포함실험 조건에 의존하는 전체 ^4,5- 지하실, 상피 시트, 또는 단일 세포의 분리 결과 elating 에이전트 및 기계적 해리. 이러한 높은 수율의 방법이 있습니다, 아직 세포 간 신호의 변화는 네이티브 환경 ^6,7를 대표하지 않을 수 있습니다 이러한 조건에서보고되었다. 레이저 캡처 미세 절제는 공간 별개의 자료의 수집을 허용하지만, 저 분자량 수익률 ^8,9을 달성한다. 인간 결장 조직, 일련의 수평 저온 절편 방법 ^10이 개발되었다. 그러나 쥐의 점막 조직이 기술의 직접 처분에 대한 엄청나게 작다. 사람에서 대장 (지하실베이스 및 표면 세포 사이의 먼) 장 토굴 길이는 μm의 100-1,000 ~ ¹¹ 사이의 ^{다릅니다.} 마우스에서, 지하실 길이는 μm의 50-300 ~ 사이 (그림 1A 참조)이다. 쥐 지하실의 작은 크기는 솔라에 도전을 선물한다기존의 프로토콜을 사용하여 두 세포 집단의 기.

우리는 이제 저렴한 비용으로, 토굴베이스의 분리를위한 높은 수율 방법을 설명하고 쥐의 대장 조직에서 상피 세포 인구 표면. 이러한 방식으로 수확 된 조직을 면역 염색 한 다음, RT-PCR (실시간 중합 효소 연쇄 반응) 또는 웨스턴 블 롯팅을 포함하여 표준 하류 애플리케이션들에 의해 분석 될 수있다.

프로토콜

실험은 나이 10 12 주 사이에 C57BL / 6 마​​우스를 사용했다. 동물을 사용하는 모든 절차를 검토하고에 모리 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 보건 기준의 국립 연구소에 따라 수행 하였다되었다.

1. 실험 설정

1. 의 저온는 설정
   1. 마이크로톰 블레이드와 척을 포함, -20 ° C의 저온 유지 장치를 평형 (블레이드 주위에 극단적 인주의를 기울여야!).
   2. 10월와 빈 cryomold (최적의 절단 온도 화합물)를 작성하고 -20 ° C (~ 30 분)에 평형. 금형에서 냉동 OCT를 제거하고 액체 월에 척에 고정합니다. 마이크로톰 팔 블록 / 척을 배치하고 OCT를 10 분 동안 설정할 수 있습니다.
   3. 섹션 당 10 μm의 저온 유지 장치를 설정하고 평면 때까지 OCT의 블록을 면도. 몇 센티미터 떨어진 날로부터 마이크로톰 팔을 백업합니다. 이 시점에서 EXPER의 나머지 날 또는 척을 조정하지 마십시오iment.
2. 면도날을 준비 : 샘플 당 2 면도날을 준비합니다. 금속 파일을 사용하여, 블레이드 에지의 sharped 무딘. 다음, 집게와 알루미늄 플랜지를 제거합니다.
3. 드라이 아이스에 파이렉스 접시 또는 기타 평평한 표면을 사전 진정.
4. 10 ~ 15 해부 핀 해부 접시를 준비합니다. 실리콘 가득 10cm 조직 배양 접시 50 %는 충분합니다. 실온에서 행크스 버퍼의 5 ML을 추가합니다.

원위부 대장 조직의 2 해부

1. 이소 플루 란 흡입 자궁 전위에 의해 장소 밀폐 된 챔버에 마우스 및 마우스 안락사 후 복부와 흉부 ^(12)에 70 % 에탄올을 스프레이.
2. 가위로 복부의 피부에 작은 절개를 한 후 절개가 복강을 노출 할 수 있습니다. 비슷한 절차는 여기에 ¹² 설명 찾을 수 있습니다.
3. 항문에서 대장을 잘라 대장이 될 때까지 장간막을 떨어져 애타게.
4. 원위 결장을 절제항문에서 0 ~ 6cm 사이의 세그먼트. 여기서, 토굴 깊이 ~ 150 μm의 (도 1b 참조). 가위를 사용하여 길이 방향으로 결장을 열고 배설물 내용을 제거 컷.
5. 점막면이 위를 향하도록 해부 접시에 조직을 핀입니다. 행크스 완충액 실리콘 접시 조직 절개하여 핀 늘려서 RT (도 1C)에서 10 분 동안 휴식을 보자. 이 조직에서 주름을 제거하고 근육 층 휴식 할 수 있습니다.

단면 용의 저온 3. 마운트 조직

1. 조직의 원하는 섹션에서 면도날을 밀어 다음 행크스 버퍼를 붓는다. 샌드위치를​​ 만들고, 상단에 다른 면도날을 추가합니다. 조직 세그먼트를 잘라 핀을 제거합니다. 드라이 아이스에 면도날 / 조직 샌드위치를​​ 전송합니다. (5 ~ 10 분, 그림 1D) 조직이 동결하도록 허용합니다.
2. 면도기 / 조직 샌드위치를​​ 들고는 상단 (BL)에 손가락을 배치하여 약간 따뜻하게 할 수ADE (점막면이 위로. 이것은 기저 근육층 먼저 절단되도록 조직 배향.). 샌드위치 분리하여 조직 세그먼트의 가장자리 주위 잘랐다. 조직 세그먼트 약 0.5 센티미터 X 1cm를 잘라. 엣지 영역이 직렬 섹션 많은 조직층을 포함하는 원인 컬링하는 경향이있다. 이상 절단에서 절단보다 더 사용한다는 점에 유의주의의 측면에 잘못.
3. 조직의 상단에있는 얼음이 녹기 시작 때까지 조직을 따뜻하게 할 수 있습니다. 이 시점에서 신속하고 신중하게 저온 유지 장치에 OCT의 블록으로 조직을 누릅니다.
4. 샘플을 통해 손가락을 배치하여 블레이드를 분리합니다. 열 전달은 조직을 방해하지 않고 블레이드를 제거 할 수 있습니다.
5. 코트 OCT를 가진 조직과는 5 분 동안 평형. 10 μm의 (그림 1E, F)에서 섹션을 잘라. 지하실이 볼 때까지 시각적으로 섹션을 검사합니다. 1.5 ml의 튜브 또는 슬라이드에 배치 섹션.
6. 의 mRNA 또는 단백질, 장소 (T)의 분석을 위해5 토굴베이스, 과도 (5), 및 튜브 당 5 표면 섹션 튜브에 그 샘플. RNA 수집을위한 1 ml의에게 상업 분리 시약을 추가하고 실온에서 10 분 동안 품어. 제조업체의 지침에 따라 RNA 정화를 수행합니다. cDNA의 생성을 위해 전체 RNA의 5 ~ 10 μg의를 사용합니다.
7. 단백질 정제의 경우, 차가운 RIPA 0.5 ml의 5 섹션 당 버퍼 (플러스 단백질 분해 효소 억제제)를 용해 추가합니다. 얼음에서 70 % 주기로 3 회 초음파 처리.
   1. SDS 페이지 로딩 버퍼 (램 믈리 버퍼)에 샘플을 추가하고 10 분 동안 100 ° C에서 품어. SDS 페이지 및 전송에 따라 샘플은 다음 2 시간 동안 5 % 우유 / PBS에 차단합니다. (500 1) 4 ℃에서 O / N KLF4 항체와 인큐베이션 웨스턴 블롯 분석을 수행합니다.

결과

대장 조직 섹션은 조직 학적 평가와 H & E ^(13)를 염색 처리했다. 점막 전통적인 단면도는도 2a에서 볼 수있다. 기저 영역은 주로 원형 근층 구성 근층의 실외가 포함되어 있습니다. 루멘을 향해 진행되어, 근층 점막이 토굴 계 상피 세포에 인접 명백, 전이 세포는 조직의 중간에 있고, 마지막으로 표면 세포 집단은 장내 루멘에 직면한다. 여기에 설명 된 일련 절편 방법은 점막 근육 판 (도 2C)이어서 종 및 원형 근층 처음 (도 2B)에 발생되도록 배향을 유지한다. 화상의 상부 좌측 비 - 근육 간질 세포의 모양을 참고. 다운 스트림 분석 아래에 설명을 위해, 근육 부분은 삭제됩니다. 다음 섹션은 상피 세포 및 간질 조직을 포함 (고유 층), 토굴 기반 세포 (그림 2D)로 시작. 인해 치밀한 핵으로 어둡게 나타나는 지하실, 대부분의 중앙 루멘의 부재를 참고. 이 층은 증식 성 구획을 포함합니다. 전환 세포는 단단히 눈에 띄는 중앙 루멘 (그림 2E)과 땀샘을 포장 나타납니다. 마지막으로, 표면의 세포 집단은 얼굴 (그림 2 층) KO 볼 상피 단층 지역으로, 불규칙적 인 구조를 가지고있다.

(여기에서 ^(14)의 설명 참조) 전술 한 바와 같이 직렬 섹션은 또한 면역 표지 및 공 초점 현미경에 대해 처리 될 수있다.도 2G는 핵 (청색) 및 세포 - 세포 접합 단백질 Zonula 스테인드이어서 고정 및 100 % 메탄올 투과성이 고립 된 소낭을 보여 Occludens 1 (ZO-1, 녹색). 기존의 단면 방향에서, 지하실 및 표면 세포 (그림 2G를 동시에 볼 수 있습니다 ). 참고 ZO-1 접합부 얼룩 라인이 대장 토굴의 루멘. 루멘이 Z0-1 라이닝 또한 원형 땀샘 (도 2G)의 중심에, 이행 세포 개체군의 직렬 단면 시료에서 볼 수있다. 향상된 ZO-1 얼룩 표면 세포 집단 (그림 2I 및 J)에서 볼 수있다.

몇몇 분화 인자 토굴 투면 축을 따라 시공간 방식으로 발현되는 것으로 알려져있다. 이것은 표면의 세포 집단이 풍부한 것으로 알려진 전사 인자 크 룹펠 같은 인자 4 (KLF4)를 포함한다. 전통적인 단면 처리 방법을 사용하여, KLF4 표면 세포 집단 (도 2K)를 대향 루멘의 핵에서 발견된다. 따라서 우리는 KLF4 mRNA를 주로 표면의 세포 집단으로 표현 될 것이라고 추측했다. 이를 테스트하려면, 직렬 섹션 수집 및 표면, 전이, 그리고 토굴베이스 샘플로 분류 하였다. Subsequently, RNA를 분리하고, RNeasy 열 및 DNase의 처리에 의해 추가로 정제하여, 표준 트리 졸 추출을 사용하여 수확했다. RNA를 샘플 당 총 RNA의 μg의 5 ~ 10 사이에 굴복 5 풀링 연속 섹션에서 수집되었다. 이 샘플은 다음과 KLF4 기준 유전자, TATA 박스 결합 단백질 1 (TBP-1) (도 2L) ⁽¹⁴⁾ 모두에 대해 반 정량적 실시간 PCR을 실시 하였다. 도 2L에 나타내는 바와 같이, TBP-1로 정규화 한 후, 세포 표면 토굴 세포에서 발현되는 8 배까지 KLF4 mRNA를 발현하는 것으로 확인되었다. 마찬가지로 KLF4 단백질 수준 토굴면 축을 따라 공간적 조절을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 4 ° C에서 20 분 동안 용해 완충액에서 상술하고 인큐베이션 시리얼 섹션 모았다. 이 샘플 당 단백질의 200-250 μg의 사이에 굴복. 샘플은 SDS-PAGE (도 2M) ^(15)에 의해 분석을 실시 하였다. 도 2M에 도시 된 바와 같이, 피 KLF4rotein 레벨은 극적 표면 세포 집단에서 더 높다. 상기 결과는 뮤린 결장 점막 표면과 토굴 상피 세포 대량 분리하는이 프로토콜의 능력을 입증한다.

그림 1 : (A) 도식 보여주는 쥐의 대장 점막 및 외부 근육 층. 우리의 방법은 시리얼 냉동 절편 (10 μm의 각)에 의해 분리 된 표면 셀과 토굴 기반 세포 인구를 수집하는 것을 목표로하고있다. 외부 근육 층은 삭제됩니다. (B) 크립트 높이가 콜론 (토굴베이스 및 표면 층 사이의 거리)의 길이를 따라 달라집니다. 데이터 포인트는 개별 토굴 측정 및 심볼 생물학적 복제를 나타내는 표시 (N = 4). (C) 결장 세그먼트 수집 타개 및 실리콘 해부 접시 상에 고정. SE (D) 조직항문에서 약 3cm가 면도날에 사이에 누를 드라이 아이스에 냉동되어 gment. (E) 조직은 사전 평탄화 OCT 블록에 장착된다. (F) 저온부 제거하고 시각적으로 검사한다.

그림 2. 대표 데이터 원형 근층 (cm)를 보여주는 단면도 헤 마톡 실린 - 에오신 염색 (A) 결장 조직 근층 점막 (mm), 토굴 계 세포 전이 세포 및 표면 세포. (B - C) 대장 근육 층. (D) 크립트 기반 세포. 중앙 루멘의 부재를 참고. (E) 과도 세포. (F) 표면 세포. 격리 된 대장 지하실의 (G) 면역 형광 염색법. ZO-1 (녹색) 및 핵 (청색)의 단면이 관찰된다. (안녕) ZO-1과 이행 및 표면 세포에서 핵 염색. (J) ZO-1 염색의 확대도. (K) KLF4 (녹색)는 표면의 세포 집단에 충실. (L) 세 구획 사이의 KLF4 mRNA 수준의 실시간 PCR 평가. (M)이 세포 집단에서 KLF4 단백질 수준의 웨스턴 블롯 분석.

토론

대장 상피 세포 증식 및 분화에 관여하는 분자 메커니즘이 제대로 이해된다. 이 대장 상피 지하실의 기지에서 줄기 세포 구획의 세포 신호 환경에 대한 우리의 이해의 간격을 포함한다. enterocyte 분화의 기초 처리에 대한 관심의 증가가있다. 예를 들어, 생체 내 분화의 이해 체외 차 장 시스템 ^(16)을 생산하기위한 연구에 대한 벤치 마크 필요 증가했다.

위의 절차를 추가 작업이 필요한 여러 단계가 포함되어 있습니다. 첫째, 냉동 조직 세그먼트 주위의 가장자리를 (3.2 절에서 논의 된 바와 같이)를 제거하는 해부 및 동결시 컬 조직의 가장자리로 필요합니다. 이 가장자리 결과를 이동하지 않으면 표면과 토굴 기본 세포의 혼합 인구입니다. 미리 냉장, 수평 10월 블록에 조직을 설치하는 것은 필수적이다. 티그 프로토콜은 각 풀 섹션 번호를 변경하여 원위 결장의 다른 영역에 적용 할 수있다. 도 1b에 도시 된 바와 같이 예를 들어, 점막 토굴 길이는 150-300 μm의 사이에서 변화한다. 항문에서 4cm-6cm 사이의 영역을 공부할 때 따라서, 섹션의 수가 중요한 것은 30 15 증가한다,이 프로토콜은 근위 대장에 대한 제안되지 않는다 (7 CM-9cm)에 의한 주름에 ( 시리얼 절편에 의한 별도의 표면과 토굴 기반 세포를 할 수 없도록 루멘으로 확장 plicae obliquae).

직렬 단면 기법 토굴 계를 연구 및 인간 상피 세포 집단을 표면에 사용되어왔다. 그러나, 우리의 프로토콜에 의한 쥐의 조직의 작은 크기에 필요한 추가 단계를 추가합니다. 우리는 상기 프로토콜 유전자 취급 용이 마우스 시스템에 토굴 계 및 표면 상피 세포 집단의 조사를 허용 것이라고 제안한다. 실제로, 풀 섹션 yieLD 고품질 단백질 및 RNA 적합한 하류 분석. 미래의 응용 프로그램은 세포 신호 전달 경로 또는 크로 마틴 면역의 연구를 포함 할 수있다. 그러나, 전술 한 다른 방법의 여러 원한다면, 결과 섹션 상피와 점막 고유 간질 세포의 혼합물을 포함하고 있음을 주목해야한다. 결론적으로, 여기에 설명 된 프로토콜은 뮤린 대장 점막의 공간적으로 별개의 영역에서 분자 수준의 분석을위한 신속하고 높은 수율의 방법을 제공한다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microtome	Leica Biosystems, Nussloch Germany	CM 1510-3
MyiQ real time PCR detector	BioRad
LSM 510	Carl Zeiss		Confocal microscope
OCT	Tissue-Tek, Sakura Finetek, Torrance CA	4583
cryo-mold	Tissue-Tek, Sakura Finetek, Torrance CA	4557	25mmx20mmx5mm
High profile microtome blade	Leica Biosystems, Nussloch germany	818
GEM industrial blades	American Safety Razor Blades	62-0314
Sylgard silicon elastomere base	Dow Corning, Midland MI	3097358
27 1/2 g needle	Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ	305109	pins for dissection
TRizol	Life Technologies	15596018
Rneasy	Qiagen	74104
DNAse	Qiagen	79254
Antibody ZO-1	Invitrogen	187430
Antibody KLF4	Cell Signaling	4038S
Antibody mGAPDH	Sigma	G8795
Antibody Secondary Alexa conjugate	Invitrogen	A11034	488 anti-rabbit
Antibody Secondary HRP conjugate	Jackson	111/115-001-003	rabbit/mouse
Topro-3	Invitrogen	T3605
HANKs balanced salt buffer	Life Technologies	14025092
RIPA lysis buffer			50mM Tris-HCl pH 7.4 150mM NaCl 1% NP40 0.25% Na-deoxycholate
primer TBP 3'			GGAATTGTACCGCAGCTTCAAA
primer TBP 5'			GATGACTGCAGCAAATCGCTT
primer KLF4 3'			TGTGACTATGCAGGCTGTGGCAAA
primer KLF4 5'			ACAGTGGTAAGGTTTCTCGCCTGT