Вскрытие и наблюдение Honey Bee Спинной сосуд для исследований сердечной функции

Резюме

The abdominal dorsal vessel of the honey bee and other insects serves as the functional equivalent of the mammalian heart and plays an important role in nutrient transport, waste removal, immune function, and more. Here we describe a protocol for the visualization and pharmacological manipulation of bee heart rate.

Аннотация

The European honey bee, Apis mellifera L., is a valuable agricultural and commercial resource noted for producing honey and providing crop pollination services, as well as an important model social insect used to study memory and learning, aging, and more. Here we describe a detailed protocol for the dissection of the dorsal abdominal wall of a bee in order to visualize its dorsal vessel, which serves the role of the heart in the insect. A successful dissection will expose a functional heart that, under the proper conditions, can maintain a steady heartbeat for an extended period of time. This allows the investigator to manipulate heart rate through the application of cardiomodulatory compounds to the dorsal vessel. By using either a digital microscope or a microscope equipped with a digital camera, the investigator can make video recordings of the dorsal vessel before and after treatment with test compounds. The videos can then be scored at a time convenient to the user in order to determine changes in heart rate, as well as changes in the pattern of heartbeats, following treatment. The advantages of this protocol are that it is relatively inexpensive to set up, easy to learn, requires little space or equipment, and takes very little time to conduct.

Введение

Общая цель данной методики является возможность следователю быстро и легко наблюдать и количественно эффект, что фармакологическое средство имеет на частоту сердечных сокращений медоносных пчел. Пчелы, как и другие насекомые, имеют открытую кровеносную систему, которая распространяет гемолимфы, эквивалент насекомых крови, по всей полости тела, известного как hemocoel. Циркуляция гемолимфы имеет важное значение для транспортировки питательных веществ, иммунных факторов, отходов производства, а также нейрогормонов и других сигнальных молекул ^1. Циркуляционный облегчается спинного сосуда, которая проходит вдоль средней линии спины насекомого, а также вспомогательных органов пульсирующим. Спинной сосуд разделен на две функционально различные секции, обозначенная сердце в животе и аорту в грудной клетке и голове. Размножается схватки в гемолимфе сердце насоса по направлению к грудной клетке и голове, в то время как вспомогательные органы пульсирующие обеспечить гемолимфы поток к конечностям.

Насекомое функции сердца можно наблюдать с помощью различных методов, в зависимости от размера, физиологии, или жизненной стадии насекомого. Общий подход для наблюдения частоты сердечных сокращений у личинок насекомых или мелких является использование прижизненной визуализации ^2. Этот метод менее полезным в взрослых пчел, тем не менее, так как это может быть трудно четко увидеть спинного сосуда через брюшную стенку. Установленный подход для записи сердечного ритма в различных насекомых, в том числе пчел, является использование контактной термографии, которая использует термисторы , примененные к внешней поверхности насекомого , чтобы обнаружить сердечные пульсации ^3,4. Частота сердечных сокращений у взрослых пчел также был записан с использованием электрофизиологические методики для измерения электрического сигнала ^4,5 импеданса. Этот метод требует вставки электродов в животное рядом с сердцем и использование преобразователя импеданса для записи сердцебиений ^4. Точно так же, электрокардиограммы были использованы для DETECт электрические сигналы , производимые сердцем и в сочетании с возможностью записи видео пчелы , чтобы наблюдать за изменениями в сердечной деятельности ^6. Отдельным преимуществом этих подходов состоит в том, что частота сердечных сокращений оценивается в неповрежденной, живущего пчелы, а не в расчлененного образца, который помогает обеспечить наличие полного спектра физиологических реакций в субъекте. Проблемы этих подходов включают учет иммобилизации или обезболиванием субъекта, необходимости ограничить внешние переменные и стимулы, которые могли бы изменить частоту сердечных сокращений, а также определение подходящего способа доставки при тестировании фармакологических агентов.

Другой подход , который был использован для изучения пчелиный сердечной деятельности является частично рассекают насекомое, чтобы разоблачить сердце, а затем измерить спинные сокращениями сосудов с использованием датчика перемещения силы ^7. В этом протоколе, сердце постоянно купались с проточной физиологическим раствором и тест-COmpounds может быть растворен в этом растворе для нанесения на предмет ^7. Существенным отличием этого метода и способы , описанные ранее в том , что брюшная нервная цепь удаляется, исключая роль , что центральная нервная система , как было показано , чтобы играть в модуляции сердечного ритма ^5. Результатом является то , что базовый уровень сердцебиение, которое, как правило , довольно неустойчива, стабилизируется на более низкой частоте и амплитуде , чем обычно наблюдается в живом насекомого ^5,7. Что все эти методы имеют в общем, что они требуют узкоспециализированный и часто дорогостоящего оборудования, в дополнение к определенному уровню знаний, для того, чтобы быть проведены. Возможно, самым большим недостатком является то, что ни один из этих подходов не особенно хорошо подходят для экспериментов, которые предусматривают проверку большого количества предметов, таких как скрининг библиотеки потенциально cardiomodulatory соединений.

Наибольшая сила подхода, описанного здесьявляется его простота. Протокол относительно прост в освоении, установка требует мало места, и лишь минимальный финансовый вклад необходим. Метод требует немного больше, чем некоторые пчелы, несколько хирургических инструментов, изотонический раствор, и либо цифровой микроскоп или традиционный микроскоп с цифровой камерой. Пчелы расчлененный для визуализации спинного сосуда и цифровых видео используются для записи частоты сердечных сокращений до и после лечения с помощью фармакологических средств. Несмотря на то, видеозапись не на самом деле необходимо , чтобы наблюдать изменения в частоте сердечных сокращений, это значительно увеличивает пропускную способность (то есть, количество предметов , которые можно обработать в заданное время). Следователь может максимизировать эффективность путем записи большого количества видео сразу, а потом забил эти видео в более удобное время. Еще одно преимущество этого подхода заключается в том, что видео позволяет следователю начать все сначала, должен процесс подсчета очков быть прерван, и сделать его проще для Viewer ослепить к лечению с целью уменьшения систематической ошибки.

протокол

1. Сбор и подготовка испытуемых

1. Собрать необходимое количество пчел из колонии.
   Примечание: Количество зависит от того, требуется не только от размера и рамки эксперимента, но и от мастерства исследователя. Например, если есть 2 группы лечения с желаемым размером выборки 10 пчел в каждой группе, разумно опытный исследователь может собрать не менее 30 пчел, чтобы объяснить неудачные вскрытий и в конечном итоге с 20 полезных видео, чтобы забить.
2. Сведите к минимуму количество времени, которое проходит между сбором и рассечение.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на то, пчелы могут быть размещены в лаборатории в течение нескольких дней до рассечения, вероятность успеха вскрытий (то есть, вероятность поддержания стабильного сердечного ритма в расчлененный спинного сосуда) наблюдается для уменьшения относительно количества времени, пчелы расположены далеко от колонии.
   1. Обеспечить пчел с источником воды и пищи, в то время размещались в лаборатории. Для EXAmple, как минимум, обеспечить доступ к 50% (вес / объем) раствора сахарозы в воде (этого достаточно для длительностей менее 6 ч). Для более длительных периодов, обеспечивают доступ к пчелам меда.
   2. Дома пчел в лаборатории в течение ночи при температуре около 32 ° C и 60-80% относительной влажности, чтобы уменьшить стресс и избежать обезвоживания.
3. Перед вскрытием, обезболивают пчел на короткое время, чтобы помочь в обработке.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это может уменьшить вероятность успеха вскрытий и уменьшить пропускную способность.
   1. Холод пчел либо путем размещения их на льду или в холодильнике достаточно долго, чтобы уменьшить движение с целью оказания помощи при погрузке и выгрузке.
   2. В качестве альтернативы, на короткое время подвергнуть пчел CO ₂ для того , чтобы помочь в обработке.
      Примечание: Сильное воздействие холода может уменьшить вероятность успеха вскрытий. Extended или повторяющееся воздействие CO ₂ может также уменьшить вероятность успеха вскрытий.

2. Вскрытиеспинномозговых брюшной стенки

Примечание: Пчелы должны быть живы в момент рассечения.

1. Использование щипцов и / или микродиссекции ножницы, удалить ноги и крылья, чтобы облегчить рассечение живота. Сохранить небольшой химический стакан или аналогичный контейнер, заполненный дистиллированной водой рядом с целью промывки инструментов между вскрытий.
2. В то время как сдерживая пчела с пинцетом, использовать микродиссекции ножницы , чтобы вырезать в боковом направлении вдоль спинной брюшной стенки между первым и вторым тергитах (см рисунок 1).

Рисунок 1: Спинной вид пчелиной живота. Первоначальный Разрез должен быть между первым и вторым тергитами, как обозначено красной линией. Шкала бар = 1 мм. Пожалуйста , нажмите еее, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.

3. Слегка захватывая заднего края второго тергита с пинцетом, разрезанные продольно вдоль каждой стороны пчелы от первоначального разреза до жалом (см рисунок 2). Соблюдайте осторожность при резке, чтобы избежать прокалывания желудочно-кишечного тракта.

Рисунок 2: Вид сбоку пчелиного живота. Второй и третий разрезы должны быть сделаны по обе стороны от живота, как обозначено красной линией. Шкала бар = 1 мм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

4. Обмен ножницы для второго набора тонких щипцов и использовать их, чтобы тщательно отделить спинной брюшной стенки от остальной Oе живота. Осторожно удалить жало и любую часть желудочно-кишечного тракта, который остается прикрепленной к спинной брюшной стенки. Избегайте разрывая кишки, а содержимое может покрыть брюшной стенки и препятствуют визуализации спинного сосуда.

Рисунок 3: Вид спинного сосуда. После того, как кишечник и Стингер были удалены, спинной сосуд виден вдоль средней линии расчлененный спинного брюшной стенки. Шкала бар = 1 мм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

5. Устройте спинной брюшной стенки в нужной ориентации под камерой так , что спинной сосуд видна (смотри рисунок 3). Использовать микродиссекции ножницы, чтобы обрезать лишнюю абdominal стена, которая препятствует визуализации спинного сосуда. Форма спинном брюшной стенки должна напоминать неглубокую чашку или миску, когда правильно расположен.
   1. Поскольку спинной сосуд не распространяется на стопы заднего сегмента брюшка пчелы, удалить окончательный тергит с целью улучшения визуализации спинного сосуда.
6. Используя регулируемый объем микропипетки, накрыть спинной сосуд с 10 мкл изотонического раствора для поддержания физиологических условий и облегчения устойчивый сердцебиение.
   Примечание: Рекомендуемое решение прочности четверть раствор Рингера (0,120 г хлорида / л кальция, 0,105 г / л хлорида калия, 0,050 г / л бикарбоната натрия и 2,250 г / л хлорида натрия), которое было установлено для облегчения стабильной, непрерывное сердцебиение.

3. Наблюдение и модуляция частоты сердечных сокращений

1. Разрешить спинной сосуд, чтобы сидеть спокойно, пока стабильное, непрерывное сердцебиение не будет достигнуто(Как правило, в течение 300 сек).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Heartbeat визуализируется как ритмических сокращений спинного сосуда. Первоначально может возникнуть, нет сердцебиение, особенно если пчела наркоз, а сердце, как правило, после того, как возобновить биение отдыхает в изотоническом растворе в течение нескольких минут и может продолжаться в течение нескольких часов избивать, при условии, что по-прежнему купаются в растворе.
2. Измерьте частоту сердечных сокращений с точки зрения количества ударов в минуту (BPM).
   1. Записывают число сокращений, наблюдаемых в течение периода 60 сек. Используйте счетчик бирки руки и таймер, чтобы облегчить этот процесс.
3. Измерить изменение частоты сердечных сокращений путем записи наблюдаемого ВРМ до и после лечения с cardiomodulatory соединением.
   Примечание: Несмотря на то, время, необходимое для наблюдения эффекта на частоту сердечных сокращений, может изменяться в зависимости от соединения испытывается, изменение частоты сердечных сокращений, как правило, можно наблюдать в течение нескольких минут.
   1. Определить базовую частоту сердечных сокращений непосредственно переддобавление любого испытуемого соединения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После лечения частота сердечных сокращений обычно может быть определена после того, как от 90 до 120 сек.
   2. Подготовка потенциальных cardiomodulators (например, октопамина) путем растворения соединения в той же изотоническом растворе купалась спинного сосуда.
   3. Добавьте тестируемые соединения в растворе, окружающем спинного сосуда путем использования micropipetter.
4. Для большей точности и высокой пропускной способности, сделать видеозапись каждого испытуемого, а затем использовать видео, чтобы набрать частоту сердечных сокращений в более позднее время.
   Примечание: Это позволяет одному исследователю шататься диссекции, с тем, чтобы облегчить почти непрерывное производство видео. При записи видео, минимальная рекомендуемая длина составляет примерно 240 сек с любым тестируемым соединением добавляется на отметке 60 сек. Это гарантирует, что следователь имеет окно 60 сек для озвучивания базовой частоты сердечных сокращений, а затем еще одно окно 60 сек для озвучивания после лечения частота сердечных сокращений 120 секпосле лечения.

Результаты

Так как многие из фармакологически активных соединений, которые могут быть испытаны с использованием этого протокола, не растворимы в воде, необходимо иметь надежный растворитель, который позволит тестируемые соединения должны быть доставлены с помощью изотоническ...

Обсуждение

The protocol presented here provides a simple and effective approach to testing pharmacological compounds for their effects on honey bee heart rate. As observed in prior experiments that either transect the ventral nerve cord of a living insect⁵ or dissect out the ventral nerve cord when exposing the dorsal vessel⁷, the loss of central nervous system regulation results in a stable, low frequency heartbeat. The low frequency of beats allows the investigator to visually assess heart rate without havin...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dino-Lite Edge digital USB microscope	Dino-Lite	AM4815ZT	Any digital microscope or similar setup will suffice
Microscope stand	Dino-Lite	RK-10	Any stand appropriate for the digital microscope
Laptop or PC			Necessary for digital microscope
Microdissection scissors (Vannas, 8 cm, Straight, 5 mm Blades)	World Precision Instruments	14003	Any similar scissors suitable for microdissection will suffice
Microdissecting Forceps, 10.2 cm, Angled (2 pair)	World Precision Instruments	504482	Any similar forceps suitable for microdissection will suffice
Ringers solution 1/4 strength tablets	Sigma-Aldrich	96724-100TAB
Dissecting tray			Any surface suitable for microdissection
Single channel 10 µl pipette			Any device capable of accurately delivering 10 µl volume
Pipette tips
Small beaker or container of water			Used to rinse instruments between subjects
Hand tally counter	Office Depot	295033	Any similar product will suffice
Timer	Office Depot	644219	Any similar product will suffice
Deionized water			Preparation of Ringers solution and rinsing instruments