심장 기능의 연구에 대한 해부와 벌 꿀 지느러미 선박의 관측

요약

The abdominal dorsal vessel of the honey bee and other insects serves as the functional equivalent of the mammalian heart and plays an important role in nutrient transport, waste removal, immune function, and more. Here we describe a protocol for the visualization and pharmacological manipulation of bee heart rate.

초록

The European honey bee, Apis mellifera L., is a valuable agricultural and commercial resource noted for producing honey and providing crop pollination services, as well as an important model social insect used to study memory and learning, aging, and more. Here we describe a detailed protocol for the dissection of the dorsal abdominal wall of a bee in order to visualize its dorsal vessel, which serves the role of the heart in the insect. A successful dissection will expose a functional heart that, under the proper conditions, can maintain a steady heartbeat for an extended period of time. This allows the investigator to manipulate heart rate through the application of cardiomodulatory compounds to the dorsal vessel. By using either a digital microscope or a microscope equipped with a digital camera, the investigator can make video recordings of the dorsal vessel before and after treatment with test compounds. The videos can then be scored at a time convenient to the user in order to determine changes in heart rate, as well as changes in the pattern of heartbeats, following treatment. The advantages of this protocol are that it is relatively inexpensive to set up, easy to learn, requires little space or equipment, and takes very little time to conduct.

서문

이 방법의 전반적인 목표는 연구자 빠르고 쉽게 관찰 및 약리 에이전트가 꿀벌의 심박수에 미치는 영향을 정량화 할 수 있도록하는 것입니다. 꿀벌은 다른 곤충처럼 hemocoel로 알려진 체강, 전반에 걸쳐, 체액, 혈액의 곤충 해당하는 발신 개방 순환 시스템을 가지고있다. 체액의 순환 영양분 면역 인자 폐기물뿐만 아니라 신경 호르몬 및 다른 시그널링 분자 ^(1)의 전송을 위해 필수적이다. 순환은 곤충의 지느러미 중간 선뿐만 아니라 액세서리 타악기 기관을 따라 연장 등의 용기에 의해 촉진된다. 지느러미 용기,이 기능적으로 별개의 섹션으로 나누어 복부에 심장 및 흉부와 머리에 대동맥 지정됩니다. 흉부와 머리를 향해 심장 펌프 체액에 전파 수축, 액세서리 박동 기관 사지에 체액의 흐름을 보장하면서.

곤충 심장 기능은 곤충의 크기 생리학 또는 생명 단계에 따라, 다양한 방법을 이용하여 관찰 될 수있다. 유충 이하 곤충의 심장 박동을 관찰하기위한 일반적인 방법은 생체 내에 ^촬상이 사용된다. 그것은 명확히 복벽을 통해 척수 용기를 확인하기 어려울 수 그러나,이 방법은 성인 꿀벌 덜 유용하다. 곤충 포함 꿀벌 다양한 심박수를 기록하는 방법은 확립 심장 맥동 ^3,4 검출하는 곤충의 외부에인가 서미스터를 이용한 온도 측정 접점의 사용이다. 성인 꿀벌 심박수 또한 온 저항 신호 ^4,5-를 측정하는 전기 생리 학적 기술을 사용하여 기록되었다. 이 방법은 심장 다음 동물에 전극의 삽입 및 하트 비트 ^(4)를 기록하는 임피던스 변환기의 사용을 필요로한다. 마찬가지로, 심전도은 detec하는데 사용되어왔다심장에 의해 생성과 심장 활동 ^(6)의 변화를 관찰하기 위해 꿀벌의 비디오 녹화와 결합 된 전기 신호에서 t. 이러한 접근 방식에 대한 뚜렷한 장점은 심장 박동이 아니라 주제에 생리적 반응의 전체 범위의 가용성을 보장하는 데 도움이 해부 표본,보다, 손상되지 않은, 살아있는 꿀벌에서 평가된다는 점이다. 이러한 방식의 문제점은 피사체 심박수를 변경할뿐만 아니라 약학 제제를 테스트 할 때, 적절한 전송 방법을 결정하는 수 밖에 변수 및 자극을 제한 할 필요가 고정화 또는 마취 회계를 포함한다.

꿀벌 심장 활동을 연구에 사용 된 또 다른 접근은 부분적으로 강제 변위 센서 ^(7)를 사용 등쪽 혈관 수축이어서, 심장을 노출 측정하기 위해 곤충 해부한다. 이 프로토콜에서, 마음은 계속 실행 생리 식염수 및 테스트 공동으로 목욕mpounds 피사체 ⁷ 응용 프로그램이 용액에 용해 될 수있다. 이 방법은 이들 전술 사이에 상당한 차이가 복부 신경 코드는 중추 신경계는 심장 박동 조절 ^5에서 재생되었음을 나타내는 역할을 제거하는 제거된다는 것이다. 그 결과, 일반적으로 매우 불안정하다 기준선 하트 비트가 훨씬 낮은 주파수에서 안정 및 진폭보다 전형적으로 살아있는 곤충 ^5,7-에서 관찰된다는 것이다. 어떻게 이들 모든 방법은 공통점을 실시하기 위하여, 전문이 일정 수준에 더하여, 고도의 전문 종종 고가의 장비를 필요로한다는 것이다. 아마도 가장 큰 단점은 이들 접근법 중 어느 것도 특히 이러한 잠재적 cardiomodulatory 화합물의 라이브러리를 스크리닝 피험자 다수시키는 테스트 실험에 적합하지된다는 것이다.

여기에 설명 된 접근 방법의 가장 큰 장점단순이다. 프로토콜은 작은 설치 공간을 필요로 마스터 비교적 용이하고, 단지 최소한의 금융 입력이 필요하다. 상기 방법은 몇몇 꿀벌 몇몇 수술 도구, 등장액보다 조금 더 필요로하고, 디지털 현미경, 디지털 카메라 전통적인 현미경 하나. 꿀벌 지느러미 용기를 시각화하는 해부하고, 디지털 비디오는 이전과 약리 에이전트와 치료 후 심장 박동을 기록하는 데 사용됩니다. 비디오 기록은 심박수의 변화를 관찰하기 위해 실제로 필요한 것은 아니지만 크게 처리량을 증가 (즉, 주어진 시간에 처리 할 수있는 환자 수). 조사관은 한 번에 동영상의 큰 숫자를 기록하고 나중에 더 편리한 시간에이 동영상을 득점하여 효율성을 극대화 할 수 있습니다. 이 방법의 또 다른 장점은 비디오 연구자가 득점 프로세스가 중단되어야한다, 시작 및 V에 대한보다 쉽게 ​​할 수 있다는 것입니다iewer은 바이어스를 감소시키기 위해 처리를 멀게한다.

프로토콜

1. 수집 및 시험 과목의 준비

1. 식민지에서 꿀벌의 해당 번호를 수집합니다.
   주 : 필요한 수의 크기와 실험의 범위뿐만 아니라, 조사원의 기술뿐만 의존한다. 두 치료 그룹은 그룹 당 10 벌의 원하는 샘플 크기가있는 경우 예를 들어, 합리적으로 숙련 된 연구자가 실패 해부을 설명하고 득점 20 유용한 동영상을 끝내고 적어도 30 벌을 수집 할 수 있습니다.
2. 수집 및 절개 사이를 통과하는 시간을 최소화한다.
   주 : 꿀벌이 일전 박리에 대해 실험에 수납 할 수 있지만, 해부의 성공률 (해부 등쪽 용기 안정적인 심박수를 유지할 가능성이 IE) 시간에 대하여 감소하는 것으로 관찰되었음을 꿀벌은 멀리 식민지에서 수용된다.
   1. 실험실에 보관하면서 물과 음식의 소스와 꿀벌을 제공합니다. 엑사에 대한mple 최소한 (이보다 6 시간의 기간에 충분하다) 물 수크로오스 용액 (V / w) 50 %에 대한 액세스를 제공한다. 오랜 기간 동안, 꿀벌은 꿀에 대한 액세스를 제공합니다.
   2. 약 32 ° C 60-80 %의 상대 습도의 온도에서 랩 하룻밤 하우스 꿀벌은 스트레스를 감소시키고 탈수를 방지 할 수 있습니다.
3. 이전 해부에, 처리에 도움을 간략하게 벌을 마취.
   주 :이 해부의 성공률을 감소시키고 처리량을 감소시킬 수있다.
   1. 얼음에 그들을 배치하거나 그냥 충분히 처리에 도움이하기 위해 이동을 감소하기위한 냉장고에 하나 꿀벌을 진정.
   2. 또는 간단히 처리에 도움이하기 위해 CO _2에 꿀벌을 노출.
      참고 : 감기에 확장 노출 해부의 성공률을 감소시킬 수있다. 특별 또는도 해부의 성공 확률을 줄일 수 CO ₂ 노출을 반복했다.

2. 해부지느러미 복부 벽의

참고 : 꿀벌 해부의 시간에 살아 있어야한다.

1. 집게 및 / 또는 미세 절제 위, 제거 다리와 날개를 사용하여 복부의 절개를 용이하게한다. 작은 비커 또는 해부 사이에 악기를 세척하기위한 목적으로 인근 증류수로 채워진 유사한 용기를 보관하십시오.
2. 집게로 꿀벌을 억제하면서, 제 1 및 제 2 tergites의 등쪽 복벽을 따라 횡 방향으로 절단하기 위해 미세 절제 가위를 이용 (도 1 참조).

그림 1 : 꿀벌의 복부 지느러미 볼 수 있습니다. 빨간 선으로 표시된 바와 같이 초기 절개, 제 1 및 제 2 tergites 사이에해야한다. 스케일 바 = 1mm. 그녀를 클릭하세요전자는이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.

3. 가볍게 집게 제 tergite의 후방 모서리를 파지하는 동안 바늘의 초기 절개에서 벌의 각각의 측면을 따라 길이 방향으로 절단 (도 2 참조). 위장관 천공 방지하기 위해 절단시주의하십시오.

그림 2 : 꿀벌의 복부의 측면보기. 적색 선으로 나타낸 바와 같이 두번째와 세번째 절개는 복부 쪽 함께 이루어져야한다. 스케일 바 = 1mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

4. 미세 집게의 두 번째 세트 가위를 교환하고주의 깊게 나머지 오에서 지느러미 복부 벽을 분리하도록 활용복부 바. 조심스럽게 바늘과 지느러미 복부 벽에 부착 된 상태로 유지 위장관의 일부를 제거합니다. 내용이 지느러미 용기의 시각화를 방해 코트 복벽을하고 같이 장을 파열하지 마십시오.

그림 3 : 지느러미 용기의보기. 창자와 바늘이 제거되고 나면, 지느러미 용기는 해부 등의 복부 벽의 중간 선을 따라 볼 수 있습니다. 스케일 바 = 1mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

5. 지느러미 용기 볼 수 있도록 카메라 밑의 원하는 방향으로 지느러미 복벽을 배열 (도 3 참조). 초과 AB를 멀리 트림하는 미세 절제 가위 활용지느러미 용기의 시각화를 방해 dominal 벽. 제대로 자리 잡고 때 지느러미 복부 벽의 형태는 얕은 컵이나 그릇과 유사합니다.
   1. 지느러미 선박이 꿀벌의 후퇴 한계 복부 세그먼트로 확장되지 않기 때문에, 지느러미 용기의 시각화를 개선하기 위해 최종 tergite를 제거합니다.
6. 조정 볼륨 마이크로 피펫을 활용, 생리적 조건을 유지하고 지속적으로 심장 박동을 촉진하기위한 등장 성 용액 10 μL와 지느러미 선박을 커버합니다.
   주 : 권장 해결책이 분기 강도 링거 용액 (0.120 g / 리터, 칼슘 클로라이드, 0.105 g / L 염화칼륨, 0.050 g / L 중탄산 나트륨, 및 2.250 g / L 염화나트륨) 안정을 촉진하는 것으로 밝혀졌다, 연속 하트 비트.

3. 관측 및 심박수의 변조

1. 안정적이고 지속적인 심장 박동이 달성 될 때까지 등의 용기는 그대로 앉아 허용(일반적으로 300 초 이내).
   참고 : 하트 비트는 등의 용기의 리듬 수축으로 가시화된다. 처음에는 꿀벌이 마취 된 특히, 하트 비트 수없는 것으로 나타날 수 있지만, 마음은 보통 몇 분 동안 등장 성 용액에 휴식 후 박동을 다시 시작하고 시간 동안 구타를 계속할 수 있습니다,이 용액에 목욕을 유지 제공.
2. 분 (BPM) 당 비트 수의 측면에서 심장 박동수를 측정한다.
   1. 60 초의 시간 동안 관찰 수축의 수를 기록한다. 이 과정을 촉진하기 위해 손 집계 카운터 및 타이머를 사용합니다.
3. 전과 cardiomodulatory 화합물로 처리 한 후에 관찰 BPM을 기록하여 심박수의 변화를 측정한다.
   주 : 시간은 시험되는 화합물에 따라 달라질 수 심장 박동수에 영향을 관찰하기 위해 필요하지만, 심박수의 변화는 일반적으로 분 이내에 관찰 할 수있다.
   1. 직전 기준 심박수를 결정어떠한 시험 화합물의 첨가.
      주 : 치료 후 심박수는 일반적으로 90 내지 120 초 후에 결정될 수있다.
   2. 지느러미 용기를 목욕하는 데 사용되는 같은 등장 성 용액에 화합물을 용해하여 잠재적 cardiomodulators (예를 들면, 옥토 파민)을 준비합니다.
   3. micropipetter를 이용하여 지느러미 용기 주변의 용액에 시험 화합물을 추가한다.
4. 높은 정확도 및 높은 처리량의 경우, 각 시험 대상의 비디오 녹화를 만든 다음 나중에 심장 박동의 점수에 동영상을 사용합니다.
   참고 :이 동영상의 거의 연속 생산을 촉진하기 위해 해부를 비틀 수있는 단일 조사를 할 수 있습니다. 비디오를 녹화 할 경우, 최소 권장 길이는 시험 화합물과 약 240 초 60 초 마크에서 추가되는 것입니다. 이 조사는베이스 라인 심박수 다음 후 처리 심박수 120 초를 기록하는 또 다른 60 초 창을 처치 60 초 창이 있는지 확인합니다치료 후.

결과

이 프로토콜을 이용하여 테스트 될 수있는 약리학 적 활성 성분의 대부분은 물에 용해되지 않기 때문에, 이는 시험 화합물이 등쪽 용기 목욕 사용 등장액을 통해 전달 될 수 있도록 신뢰성있는 용매를 가질 필요가있다. 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)는 일반적으로 동물 ⁸ 실험 약물 및 다른 화합물을 전달하기위한 수단으로 사용되는 용매이며, 꿀벌 심장 활동 ⁹...

토론

The protocol presented here provides a simple and effective approach to testing pharmacological compounds for their effects on honey bee heart rate. As observed in prior experiments that either transect the ventral nerve cord of a living insect⁵ or dissect out the ventral nerve cord when exposing the dorsal vessel⁷, the loss of central nervous system regulation results in a stable, low frequency heartbeat. The low frequency of beats allows the investigator to visually assess heart rate without havin...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dino-Lite Edge digital USB microscope	Dino-Lite	AM4815ZT	Any digital microscope or similar setup will suffice
Microscope stand	Dino-Lite	RK-10	Any stand appropriate for the digital microscope
Laptop or PC			Necessary for digital microscope
Microdissection scissors (Vannas, 8 cm, Straight, 5 mm Blades)	World Precision Instruments	14003	Any similar scissors suitable for microdissection will suffice
Microdissecting Forceps, 10.2 cm, Angled (2 pair)	World Precision Instruments	504482	Any similar forceps suitable for microdissection will suffice
Ringers solution 1/4 strength tablets	Sigma-Aldrich	96724-100TAB
Dissecting tray			Any surface suitable for microdissection
Single channel 10 µl pipette			Any device capable of accurately delivering 10 µl volume
Pipette tips
Small beaker or container of water			Used to rinse instruments between subjects
Hand tally counter	Office Depot	295033	Any similar product will suffice
Timer	Office Depot	644219	Any similar product will suffice
Deionized water			Preparation of Ringers solution and rinsing instruments