Прижизненной микроскопии опухольассоциированных сосудистую использования передовых спинной складки окно камеры на трансгенные флуоресцентных мышей

Резюме

Этот протокол описывает прижизненной визуализации трансгенных мышей, выражая клеток конкретных флуоресцентных маркеров. Прижизненные изображения обеспечивает неинвазивный метод для высокого разрешения наблюдений в живых животных с помощью имплантируемых windows, через которые возможен микроскопических визуализации процессов. Этот метод особенно полезен для изучения продольной процессов.

Аннотация

Опухоли и опухоли судно развития, а также опухоли ответ терапии, являются весьма динамических биологических процессов. Гистология обеспечивает статическую информацию и часто не является достаточным для правильной интерпретации. Прижизненной оценки, в котором процесс следует вовремя, обеспечивает дополнительную и часто неожиданные информацию. С созданием трансгенных животных, выражая клеток специфических маркеров и живых клеток-трассировщиков, усовершенствования оборудования для формирования изображений и развития несколько тепловизионных камер прижизненной микроскопии стал важным инструментом для лучшего понимания биологические процессы. Этот документ описывает экспериментальный дизайн для исследования развития опухоли судна и лечебного воздействия на основе пространственных и временных. С помощью этой установки, стадии развития судна, подсказки ячейки и Люмене формирования, поток крови, кровоподтек, установленного сосудистого русла и сосудистой уничтожения может визуализировать и следовать. Кроме того может также следовать терапевтические эффекты, внутриопухолевых судьбы и локализация химиотерапевтических соединений.

Введение

Хотя в vitro исследования включить разрешением кинетическая Визуализация процессов, в пробирке экспериментов не даст оценки в надлежащем контексте. Например взаимодействие опухолевых клеток стромы отсеках или доставки лекарств и распределения внутри опухоли не могут быть изучены в пластине культуры. Поэтому Животные модели используются для имитации человеческой физиологии и патологии. Однако продольной томографии процессов, особенно на субклеточном резолюции, является сложной задачей. Молекулярные методы обработки изображений, как магнитно-резонансная томография (МРТ), Однофотонная эмиссионная компьютерная томографии (ОФЭКТ) и позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ), имеют хорошее проникновение глубины, но отсутствие резолюции или не проиллюстрировать анатомических структур. Оптических изображений обеспечивает высокое разрешение и визуализации структуры, но оно сопровождается бедных минимальное проникновение¹. Приложение прижизненной микроскопии в сочетании с окном камеры технологии, такие как спинной skinfold или брюшной окно, позволяет с высоким разрешением изображений в vivo^2,3,4. Эта технология имеет явные преимущества, так как позволяет для продольной томографии течение часов и даже дней, для визуализации процессов в надлежащем контексте (например, ячейке взаимодействий в образ ткани) и на оптические пределы резолюций Расширенные multiphoton и конфокальные микроскопы.

Введение трансгенных животных с конкретной ячейки или белка флуоресцентные метки открывает множество возможностей для in vivo и ex vivo экспериментов. Для экземпляра, ячейке взаимодействий, производство белков и ответ на манипуляции или терапии могут быть изучены в естественных условиях с помощью этих моделей^5,6,,78. Важно отметить, что положение в месте и времени могут быть определены с надлежащего оборудования для формирования изображений и методологии. Здесь, прижизненной микроскопии животных, выражая маркера эндотелиальной в сочетании с инъекционными агентов в опухоли имплантируются в модифицированных спинной складки окно камеры представлена.

протокол

Все эксперименты на животных были сделаны в соответствии с законодательством Нидерландов, и протоколы были одобрены Комитет животных эксперименты из Erasmus MC, Роттердам, Нидерланды.

1. получателей мышь

1. Когда рождаются трансгенных мышей, экран животных для соответствующих генотип, используя стандартные процедуры⁹.
   Примечание: В этой рукописи, представлены данные, полученные из eNOStag-GFP линия⁹ собственной разработки и приобретенные линии¹⁰ Роза mTmG (сток 007676).
2. Используйте мышь, 12 недель или старше, которые выше 20 g.

2. доноров мышь

Примечание: Фрагмент опухоли для имплантации в окне спинной получается из доноров не трансгенных животных. В зависимости от типа опухоли используются обычные (с сингенной опухоли) или иммунодефицитных (ксенотрасплантатов) мышах.

1. Рост опухолевых клеток в среде с соответствующих дополнений в колбах культуры при 37 ° C и 5% CO₂.
2. Удалите носитель из колбы клеток, раз мыть с ПБС и отсоединить клетки с помощью трипсин 0.25%.
3. Инактивирует трипсина, добавив клеток питательной среды. Собирать клетки, спина вниз на 1200 x g 5 мин и Ресуспензируйте гранулы в 5 мл PBS.
4. Разбавьте 20 мкл суспензии клеток с 20 мкл Трипановый синий, который пятна мертвые клетки. Подсчитать количество живых и мертвых клеток, используя Горяева; количество мертвых клеток не должна превышать 10%.
5. Спина клетки снова на 1200 x g 5 мин и Ресуспензируйте Пелле клеток в ледяной PBS, уступая 1 миллион клеток в 100 мкл. Транспорт клетки на льду в операционной комнате.
6. Анестезировать животных, с использованием изофлюрановая/O₂. Включите кислород и отрегулировать поток до 0,5 мл/мин Отрегулируйте изофлюрановая испарителя до 3%. Через несколько минут поместите курсор мыши в зале анестезии.
   Примечание: Заполнять камеры, чтобы убедиться, что она готова для использования, чтобы свести к минимуму стресс.
7. Когда мышь седативные, принести животное к операционному столу Отопление, держал при 37 ° C и морда в анестезии носовой конус.
   1. Примечание: Животное правильно седативные, когда нет реакции на щепотку зверолов отмечается.
8. Бриться мышь лучше визуализировать место инъекции. Прививать с помощью шприца инсулина 0,5 мл; привнести µL 100 клеток в бочку мыши и позволяют опухоль развивать.
9. Усыпить животных на шейки матки дислокации под наркозом, утвержденных институциональный уход животных и использования Комитетом.  С помощью микро ножницы, щипцы, порезать кожу в месте расположения опухоли и вскрыть опухоли. Положите опухоль в чашке Петри с PBS. Использование микро ножницы, щипцы, нарезать опухоли фрагменты примерно 1 мм³ (рис. 1A-a).
   Примечание: Опухоль мыши доноров должна быть достаточно большой, чтобы дать достаточное количество материала, но большие, некротические опухоли следует избегать. Для большинства опухолей достаточно средний диаметр 10 мм.

3. Имплантация окно камеры

1. Выполните все процедуры в асептических условиях. Автоклав хирургических инструментов (рис. 1A) и палаты материалы (рис. 1B).
   Примечание: Окно камеры, используемые здесь, с общим весом 1,1 г, производится из полиэфирных эфира кетон (PEEK), свет, синтетический материал, который является МРТ совместимы. PEEK 3,4 раза легче, чем Титан, который широко используется в литературе для этих окон. Он устойчив к большинству химических веществ, инертен, не провоцировать иммунных реакций и прочная. Это окно также меньше в дизайн, по сравнению с ранее опубликованной windows. Мышей с этого окна шоу Полная мощность движения, можно подняться и набрать вес соответствующе для мышей без окно камеры. Потому что животное может укусить на окне, синтетические windows может длиться немного короче по сравнению с windows титана; Однако они легко сделать и недорогой. Эти конкретного окна сделаны собственными силами и могут быть приобретены по запросу.
2. Степенный получателя мыши с помощью ингаляционных анестетиков (т.е., изофлюрановая/O₂) в камеру анестезии. Принести мыши с подогревом операционный стол держал при 37 ° C и поместить морду в анестезии носовой конус (см. шаг 2.6). Примените Глазную мазь, чтобы избежать сухости.
3. Удалите волосы из всего обратно, бритья и применяя гель для удаления волос. Позаботьтесь, что все гель удаляется путем полоскания животное тщательно с рук теплой водопроводной водой. Сухой животного и очистите кожу с 70% этиловом спирте.
   Примечание: Процедуре бритья также может быть сделано за день до окна имплантации. Крем нужно тщательно удалены с рук теплой водой, как это может вызвать раздражение кожи.
4. Марк линии центра на мыши позвоночника с маркером, чтобы обеспечить симметричное позиционирование камеры. Переместите указатель мыши, потяните кожу в лоскут с помощью разбивочной линии как складной позиции и понять в середине заслонки. Расположите окна таким образом, что в верхней части кадра является по меньшей мере 2 мм ниже центра линии и круг области просмотра окна на кожу с маркером.
5. С помощью скальпеля держатель/лезвие размер 15 и микро ножницы, снять кожу вдоль линии нарисованные циркуляр. Будьте осторожны, чтобы не повредить основные фасции.
   Примечание: Это создает области просмотра окна палаты, в котором пересаженные опухоли.
6. Потяните вверх складки и использовать ухо перфоратор для отверстий 1 мм в диаметре через кожу, один на обе стороны области просмотра (рис. 1A-b).
   Примечание: Это отверстия для двух болтов исправить оконные рамы вместе.
7. Разместить заказ передней камеры с помощью болтов (цифры 1B-a, 1В c) и положение задней рамы (рис. 1B-b) на болты. Место на задней кадр на болты гайки (рис. 1B-d).
   Примечание: Эти болты используются для устранения камеры вместе против кожной складки и впоследствии используются для иммобилизации камеры во время оценки под микроскопом.
8. Потяните кожу 2-3 мм выше верхней части рамы и убедитесь, что области просмотра окна которые спасаютжизньпритрансплантации соответствует области камеры. Место 23 G иглы через два отверстия маленький шов (рис. 1B, черная стрелка) в верхней части кадра. Затяните гайки на болты с микро отвертки (рис. 1A-c) и зажимную иглодержатель для иммобилизации орехи.
   Примечание: Принимать меры предосторожности, чтобы обеспечить, что кожа не развернуться болты и не затягивайте слишком сильно.
9. Замените иглы швы, начиная с верхней части, чтобы исправить кадры на коже. Сделать это за 5 пар отверстий шов (рис. 1B, белая стрелка) в кадре.
10. Включение мыши раскрыть задней камеры окно. Место толстый кусок наполнителя стекла с диаметром 10 мм и толщиной от 0,55 мм (рис. 1B-e), а затем стандартная крышка стекло 12 мм (рис. 1B-f). Зафиксируйте их с стопорное кольцо (рис. 1B-g) в районе задней камеры.
    Примечание: Наполнителя стекла предотвращает пространство для открытия между фасции и окна на лицевой стороне, которая используется для визуализации.
11. Гидрат области просмотра окна, в котором опухоли будет вставлен, заполнив шприц 1 мл стерильного 0,9% NaCl. Разрешить несколько капель попадают на этой области просмотра. Удалите избыток физраствора с наконечником стерильным хлопка.
12. В фасции создайте карман достаточно большой, чтобы держать 1 мм³ опухоли фрагмент (Рисунок 1A-a) с помощью иглы 25 G с его кончика изогнут под углом 90 ° (Рисунок 1A-d). Использование иглодержателя или Келли щипцы, вставьте фрагмент опухоли в центре области просмотра окна которые спасаютжизньпритрансплантации в этом кармане.
13. Закрытие области просмотра окна с стандартной крышки стекла 12 мм и стопорное кольцо.
    Примечание: Воздушный пузырь может сформировать, но она исчезнет в течение часов.

4. до и после ухода животного

1. Подкожно, утвержденный свой институциональный уход животных и использования Комитетом Администрирование лекарства для облегчения боли (т.е., бупренорфин 0,05 мг/кг). Позволяет мыши, чтобы оправиться от анестезии под лампой Отопление.
2. Место мыши окно подшипник индивидуально в клетке и климат контролем комнате до 32 ° C и выше 50% влажности. Убедитесь, что бутылки с водой при температуре окружающей среды до размещения их на клетке для предотвращения утечки. Используйте клетки и обогащения, которые позволяют свободного передвижения и доступа к продовольствию и воде.
   Примечание: Как это окно камеры очень хорошо переносится, мышей показывают нормальное поведение. Индивидуального жилищного предотвращает повреждение к палате окна, вызванные другими мышами, и высокой температуры/влажности предотвращает охлаждать вниз и обезвоживания кожной складки.
3. Проверьте мышь регулярно для жевать офф швы, свободные болтов/гаек или сломленного стекла крышка. Немедленно отремонтировать и заменить когда это произойдет. Крышка изготовлена из легкого материала может использоваться для защиты окна.

5. прижизненные изображения

Примечание: В этой процедуре используются multiphoton микроскоп и программное обеспечение соответствующего контроля. Здесь используются пакеты программного обеспечения, которые были обеспечены микроскопов. В принципе любой программный пакет, который поставляется с микроскопом и предназначен для управления микроскопом и для захвата изображений подойдет этой цели.

1. Включите систему: PC/Микроскоп, власть конфокальный ЭБУ, мощность лазера и лазерные выбросов. Например с этим программным обеспечением, запустите программное обеспечение и инициализировать таблицу микроскоп (Рисунок 1E-а и 1E-c), нажав кнопку «Инициализировать таблицы». Включите систему и установить его на режим, позволяя ПК для управления микроскопом, таблицы xy, z позиционирование и захвата изображения.
2. Переключитесь на дневной свет (Рисунок 1E-b).
   Примечание: Это используется для оценки флуоресценции изображения через окуляр вместе с яркой области.
3. Переключение на платформе по индивидуальному заказу, контролем температуры (Рисунок 1 C-c; описанных в ходе обсуждения более подробно) на 37 ° C.
4. Включите блок анестезии, с помощью изофлюрановая/O₂ (Рисунок 1E-d). Закрепите трубку анестезии на микроскопа (Рисунок 1 C-e). Установите зажим на xy сцене, чтобы исправить часть морды анестезии.
5. Предварительно оценить животное для установления стадии развития опухоли судна; Это зависит от скорости роста опухоли, но она может варьироваться между отдельными мышей.
   1. Степенный мыши, с помощью ингаляционных анестетиков (₂изофлюрановая/O) в камеру анестезии (см. шаг 2.6).
   2. Поместите животное на платформе контролем температуры, установленный на микроскопа; Это предотвращает охлаждения животного когда он находится под наркозом. Убедитесь, что морду мыши расположен в анестезии конуса и применять глазную мазь, если оценки займет больше времени, чем 5 минут.
      Примечание: Для оценки больше чем 1 h, уменьшайте поток изофлюрановая до 2%.
   3. Используйте камеру болты исправить (Рисунок 1 C-b, полная стрелка) палата на заказ палаты держателя (рис. 1 C-a). Винт этот держатель (Рисунок 1 C-d, пунктирная стрелка) в подогретую платформу (Рисунок 1 C-c).
      Примечание: Это сочетание предотвращает движение артефакты в области просмотра окна пока все еще позволяющ животное могло свободно дышать.
   4. Убедитесь, что для чистки стекла области просмотра окна с наконечником хлопок смоченной в воде для предотвращения размытые изображения и помех, поступающих от мусора на внешней стороне стекла. Поместите платформу и мышь на микроскопа (рис. 1 d).
      Примечание: Будьте осторожны, что хвост не застрять между платформой и микроскопа.
   5. Визуально проверьте стадии развития опухоли судно, с использованием 10 X объектив, ярко поле и флуоресцентный свет.
      Примечание: Флуоресцентные судов должна быть в центре внимания, и поток крови должен быть видимым с помощью ярких поля. Когда сосудистую ясно увидеть, оцените стадии развития опухоли судна. К примеру определите, является ли ангиогенеза раннего начала с ростом кончик клетки или уже установили сосудистую для доставки лекарств. То же самое животное может вычисляться снова, и как опухоль развития представляет собой непрерывный процесс. Несколько этапов можно наблюдать в одном опухоли в то же время.
      1. Когда это не возможно сосредоточиться на сосудистую, удалить животное из стадии, пусть мыши восстановить и место, животное обратно в пространстве, климат контролем. Проверьте еще раз позже. Когда мышь готова к оценке, продолжите процесс, описанный ниже.
6. Переключение на конфокальный лазеры и панель управления, нажав кнопку «Лазер» и «Ctrl-группа» на вкладке Конфигурация
   Примечание: Рекомендуется установить мощность лазера низкой, особенно для Аргонового лазера, для предотвращения обесцвечивания, Отопление ткани, и фотоповреждения. Панели управления можно задать до личных предпочтений. Для прижизненной визуализации с помощью нескольких флуорофоров рекомендуется применять следующие параметры: «умные выгоды, 100 V в свою очередь,» «умные смещение, 10% в свою очередь,» «масштаб, средний,» «X позиция, средний,» «позиция Y, средний,» и «Позиции Z, 100 мкм в очередь». До изображения, настройте смещение к минимуму шум и оптимизировать соотношение сигнал шум. Конфокальный zoom функция позволяет большим увеличением без изменения цель линзы. X, Y и Z контроль является необходимым найти областях, представляющих интерес. Для прижизненной микроскопии Z-позиционирования должно быть около 100 мкм на оборот, как оценивается Ткани тик.
7. Нажмите на «Приобретение» на вкладке приобретать и изменить параметр: «Приобретение режим XYZ или XYZT,» «Формат (512 x 512 или 1024 x 1024)» и «Скорость (400 Гц или 200 Гц).» Нажмите на «Pinhole» и установите его в 1 блок Эйри. Нажмите на «Двунаправленный X».
   Примечание: Для оптимизации изображения, между мощности лазера, усиление и точечным должны быть баланс, который упомянут в ходе обсуждения.
8. При оценке несколько флуорофоров, выберите «последовательное сканирование» и «между кадрами» для предотвращения кровотечения путем, который упоминается в ходе обсуждения.  Выберите «Средний 4 линии» для получения хорошей уменьшения шума.
   Примечание: В зависимости от встроенных флуоресценции в трансгенных животных, другие флуоресцентные маркеры, как декстраны, Hoechst, FITC-BSA, флуоресцентный химиотерапевтические или наночастиц, разбавляют до нужной концентрации в 0,9% NaCl может быть Управление и оценку в опухоли. Они вводят через хвост или полового члена Вену.
9. Нажмите на «Эксперимент» на вкладке приобретать и выберите «New» сделать новые данные базы.
10. Оценивать животных с использованием, в зависимости от исследования вопроса, 10 X, 20 X или 40 X цель линзы. Через окуляр найти место для оценки.
    Примечание: Это лучше всего использовать сухой линзы с NA, как высокие, как возможно, как сухой линзы имеют сравнительно продолжительное рабочее расстояние и делать не необходимости погружения жидкости. В ходе обсуждения упоминается использование объективов погружения в воду.
11. Используйте быстро живой сканирования для поиска надлежащего усиление и смещение для предотвращения чрезмерного и оптимизировать соотношение сигнал шум. Кроме того поддерживать одинаковые параметры визуализации, во время и между эксперименты необходимости количественного сравнения.
    Примечание: Дополнительные соображения для оптимального отображения упомянуты в ходе обсуждения. XYZ положение и масштаб может быть завершен в течение жить сканирование с помощью панели управления.
12. Чтобы сделать Z-стека, выберите «Z-стека» в закладке приобретение сделать быстрый Z-scan, используя Z-положение в панели управления и установить начало и конец сканирования, нажав кнопку «Начать мкм» и «Конец мкм.» Задайте размер Z-шаг связан с размером обскуры.
13. Захват изображения, нажав кнопку «начать».
    Примечание: Как прижизненной микроскопии это все о кинетики и поэтому динамические процессы наблюдаются, компромисс между время, необходимое для получения изображения и скорость биологических процессов должны быть сделаны. В целом, чем выше разрешение, более флуоресцентные каналы являются отсканированы и тем больше сканирование области, больше пикселей на изображение. Толще Z-стеки перевести больше изображений времени. Больше изображений время увеличивает вероятность движения артефактов и может привести к повреждению ткани образы. Кроме того Помните, что сканирование определенных флуоресцентные метки вызывает отбеливание и токсичности, которая зависит от мощности лазера и концентрация накопленного красителя.
14. После сканирования Z-стека можно быстро оценить, нажав «максимальной проекции». Z-стек автоматически сохраняется в базе данных и может быть переименован.

6. анализ данных

1. В зависимости от первоначального исследования вопрос используйте один из нескольких программ, например ImageJ⁵, Matlab¹¹или Amira, для анализа данных. Правильный анализ имеет решающее значение.

Результаты

Главный атрибут прижизненной визуализации является продольной визуализации клеточных процессов без инвазивного вмешательства. Для этого используются трансгенных животных, выражая учредительных или индуцибельной флуоресцентные маркер в клетках интерес. Рисунок 2 иллюстрирует выражение флуоресцентные метки в eNOStag Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП)⁹ и Роза mTmG мыши линии¹⁰. ENOStag-GFP — мыши линия, которая была произведена собственными силами с использованием усеченного Энос ген как тег для GFP. Важно отметить, что Енос высоко выражается в эндотелиальных клеток, и сигнал GFP ясно видели в eGolgi й и клеточную мембрану (рисунок 2A). Роза mTmG мышей имеют ориентированные на мембраны двухцветный флуоресценции Cre репортер аллеля. Эта линия выражает mTomato флуоресценции в широко клеток и mGFP в клетках рекомбиназа выражая КРР и значительно используется для трассировки линии. Как часть опухоли пересаженные от не трансгенных донора, красной флуоресценцией выражается преимущественно частями стромальные опухоли (например, в мембраны клеток сосудистой, циркулирующих клеток, проникли клетки крови и опухольассоциированных фибробластов (рис. 2B)).

Формирования судна жестко регулируется, и отличную модель для изучения этого является развивающейся сетчатки^12,13. Кроме того рост опухоли судна является кинетическая процесс, который в принципе аналогично развитию сетчатки судна. Однако опухоль сосудов отсутствие организации и, как опухоль непрерывно Ремоделирование, поэтому опухольассоциированных сосудистую. Это может иметь свои преимущества при использовании опухоли как модель ангиогенных, как все этапы развития судна можно часто найти в том же опухоль в то же время. К ним относятся эндотелиальной прорастания фронт, растущих в ООН васкуляризированной часть опухоли (рис. 2 c); поврежденные сосуды (Рисунок 2D); и установленного сосудистого русла (Рисунок 2E-я) с зрелой, разветвленных судов (Рисунок 2E-II). Однако ангиогенных эндотелиальные клетки можно также найти в этих областях. Простимулировано ангиогенных раздражители, эндотелиальных клеток выступала filopodia (Рисунок 2E-III) и может заранее в оконечности ячейку, используя эти filopodia для сканирования и направления миграции (Рисунок 2E-IV). Этот Совет клеток мигрирует в интерстиции опухоли и следуют делящиеся клетки стебля. Один оконечности эндотелиальных клеток имеет несколько filopodia расширения, отзыв и обновление в любое время и может отслеживаться с помощью прижизненной микроскопии (Рисунок 2F).

Во-вторых прижизненной микроскопии может использоваться для определения формирования люмен на фронте ангиогенных, кровотока в опухоли и кровоподтек. В зависимости от уже в настоящее время неотъемлемой флуоресцентные сигналов в животное можно применять различные флуоресцентные соединений. Поток крови и кровоподтек могут быть визуализированы с помощью Hoechst, флуоресцентные декстраны или FITC-BSA. Для расширенного исследования крови поток и частицы кровоподтек, длинные циркуляции дневно помечены Пегилированный наночастиц 100 Нм могут быть использованы. Подробную информацию о подготовке этих наночастиц увидеть предыдущие публикации⁵. Занятости этих соединений показано на рисунке 3. Эндотелия кончик клетки в Роза mTmG мышь ясно видно, вторжение в опухолевой ткани. Функциональные кровотока проявляется в фиолетовый Флуоресценция наночастиц системно вводят в просвет сосудов труб (Рисунок 3A-я). Наночастицы тесно достигают клеток эндотелия подсказка, иллюстрирующие формирования люмен в районе клетки стебля (Рис. 3A-II). Поставка системно управляемых химиотерапевтические зависит функциональное сосудистую достигнуть опухоли интерстиция, и как показано на рисунке 3B, инъекционные агентов, независимо от их размера, не проникают районы с разрушенных судов, сжатых судов или судов с застой крови.

В большинстве органов эндотелиальные подкладка образует функциональные барьер между кровью и основной ткани, и прохождения молекул жестко регулируется. Опухольассоциированных сосудистую, однако, как известно, быть Дырявый, и размер пор отсечения в значительной степени зависит от типа опухоли¹⁴. Флуоресцентный конъюгированных декстраны с разными размерами могут быть введены для оценки потока крови, проницаемость и кровоподтек. Хехст (615 Da) быстро диффундирует в опухолевой ткани и поглощается окружающие клетки (Рисунок 3 c-я). Вскоре после инъекции декстран 10 кДа (рисунок 3CII) и 2 MDa (Рис. 3 C-III) находятся в крови. Однако 10 кДа также видели в опухоли интерстиция, указывающее проницаемость эндотелия подкладки для малых молекул, которая является особенностью декстран приписывается опухоль сосудов. 40 мин после инъекции (Рис. 3 C-IV), декстран, которую 10 кДа очищается от поток крови (Рис. 3 C-V) и интенсивности флуоресценции декстрана 2MDa также сократился (Рис. 3 C-VI). Однако большие декстраны не найдены в опухоли интерстиция, свидетельствует об отсутствии проницаемость для больших молекул в течение этого периода времени.

Патофизиология опухоли, с его пролиферирующих, некротические и снимите васкуляризированной областей, могут быть весьма информативным при использовании опухоли как ангиогенных модель. Однако это представляет собой проблему для эффективной терапии и расследования. Гетерогенность опухольассоциированных сосудистую вызывает гетерогенных распределения управляемых наркотиков, оставляя весь снадобь свободная¹⁵районов. Для улучшения доставки лекарств, несколько стратегий может быть прикладной^15,16,17, и терапевтические прогрессии может проверяться с помощью этой прижизненной дизайн. Сосудистую опухольассоциированных можно манипулировать с помощью вазоактивных веществ для улучшения доставки наркотиков¹⁷. Результаты опухоли судно манипуляции с использованием альфа некроза опухоли (ФНО) как вазоактивных агента в сочетании с Doxil, инкапсулированные липосомальных формулировка доксорубицин, как химиотерапевтический агент представлены в этой рукописи^{5, 18 , 19}. в отличие от декстраны, распространить на несколько часов, если не дни, в циркуляции крови²⁰производятся Пегилированный наночастиц.

Как упоминалось ранее область опухоли может быть предварительно проверенных определить правильный опухоли области в зависимости от исследования вопрос. Судьба наркотиков может быть оценен в районах с функциональной сосудистую против районов с уже поврежденных сосудистого русла (данные не показаны). Расследовать судьбу химиотерапевтических агентов без цитотоксических вмешательства, наночастиц с тот же состав, терапевтический агент может использоваться как модель наркотиков. ENOStag-GFP животное было лечение и.в. с эти наночастицы и imaged 24 h позже. Наночастицы были все еще присутствуют в сосудистую, с минимальным кровоподтек в интерстиции опухоли (Рисунок 4A-я). Однако когда наночастиц вводили в сочетании с TNF, кровоподтек наблюдалась из кровотока в опухоли интерстиция (Рис. 4A-II), увеличивая внутриопухолевых доставки лекарств. С помощью линзы с высоким разрешением цель, внутриклеточной локализации соединения могут быть признаны, как показано здесь ядерной расположение Hoechst в зеленый эндотелиальных клеток и клеток опухоли интерстиция (рис. 4B). Кроме того как многие химиотерапевтических агентов, как доксорубицин, вставлять с ДНК, локализация этих соединений может оцениваться. Доксорубицин имеет красный флуоресцентные свойства, и nanocarrier могут быть помечены, например, tetramethylindotricarbocyanine перхлорат (DiD). ENOStag-GFP животным вводили и.в. с Doxil-сделал в сочетании с TNF, и изображения были приняты 24 ч после лечения. Doxil-extravasated из кровеносных сосудов и был взят вверх на окружающие ткани опухоли (Рисунок 4 c-я). Более подробную оценку отдельных клеток (Рис. 4 C-II) показал, что перевозчик можно найти в цитоплазме, в то время как выпущенные доксорубицин наблюдалось в клеточном ядре.

Рисунок 1: приборы, дорсальная складки камеры и установки оборудования, необходимые для процедуры. (A) опухоли фрагменты () и хирургические инструменты, необходимые для имплантации. Нестандартные инструменты являются уха перфоратор (b), микро отвертка (c) и изогнутой иглой (d). (B) спинной складки окно камеры. Фронт (а) и назад (b) окно (стрелка: отверстия для швов; стрелка: отверстия для болтов), 2 болтов (c), 2 гайки (d), 1 филлер стеклянные (e), 2 стаканами крышку (f) и 2, сохраняя кольца (g). Кроме того стопорные кольца без крючков (белая стрелка) может использоваться при необходимости. Платформа с контролируемой температурой (C) по заказу камеры держатель (), болты для камеры камеры держатель (b), (c), болты для защиты камеры держатель для платформы (d), и держатель с анестезией трубки (e). (D) животное установлен в держателе камеры на платформе. В области просмотра окна виден B16BL6 опухоли (стрелка). (E) оборудование, необходимое для прижизненной оценки. Компьютер с изображений и Микроскоп управления программного обеспечения (), стандартные флуоресцентный свет (b) и Микроскоп. Multiphoton конфокальный был используется (c) с блоком анестезии (d). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2: встроенные флуоресценции трансгенных животных. Все изображения, показанные здесь, Z-стек прогнозы между 50 и 70 мкм толщиной. (A) в eNOSGFP тег линии, GFP выражается в Гольджи (звездочка) и клеточной мембраны (стрелка) эндотелиальных клеток. Шкалы бар = 100 µm. (B) внутриопухолевых выражение mTomato в строке Роза mTmG встречается преимущественно в клеточной мембраны клеток сосудистой (стрелка) и клетки крови (звездочка). Шкалы бар = 100 µm. (C) A проекции растущего ангиогенных фронта в ООН васкуляризированной опухоль. Шкалы бар = 100 µm. (D) A проекции части опухоли с установленным и поврежденных судов (звездочка). (E) проекция установленных опухоли сосудистую (EI) показаны пожилые клеща судов (EII); клетки эндотелия наконечник ангиогенных с filopodia (EIII, стрелки); и пожилые сосуд, от которого один эндотелиальных клеток простирается filopodium (е, стрелки) в интерстиции. Шкалы бар = 100 µm. (F) движение filopodia, за 1 ч. Каждые 15 мин, Z-стека было принято; Максимальная прогноз представлен здесь. Filopodia являются расширение (белая стрелка), застойные (=), втягивания (красная стрелка), или даже полностью исчезает (-). Шкалы бар = 25 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3: администрация инъекционные этикетки для иллюстрации кровоподтек и приток крови. (A) A Роза mTmG мыши вводили с фиолетовым флуоресцентные наночастиц, и Z-стек вторжение кончик ячейки фронта было принято спустя 10 мин (МА). Проекция, показывающие, что наиболее эндотелиальной побеги имеют функциональный люмен (AII, стрелка). Только редко можно увидеть эндотелиальной побеги без потока (AII, стрелки). Шкалы бар = 250 мкм. (B) этой проекции Z-стек показывает область судно разрушенного опухоли в eNOStag-GFP животного до начала лечения (BI). Животным вводили с наночастицами (фиолетовый, ВП) и Хехст (синий, BIII). Наночастицы и "Хёхст" не доходят до разрушенных районов, обозначается гранулированный ячейки мусор по-прежнему выражая GFP. Шкалы бар = 250 мкм. (C) eNOStag-GFP мыши вводили с двумя декстраны разных размеров (красный = декстрана 2 MDa; фиолетовый = декстрана 10 кДа) и Хехст (синий = 615 да), и одного плоскости изображения представлены здесь. 10 мин после инъекции, наличие в крови и кровоподтек, видели в тот же образ. "Хёхст" extravasates почти сразу из кровеносных сосудов и поглощается окружающие клетки (CI). Декстран 10 кДа (CII) можно увидеть в сосудах и в интерстиции опухоли. Декстран 2 MDa (CIII) можно найти в сосудах. 40 мин после инъекции (CIV), декстран 10 кДа исчезает из крови (CV), и интенсивности флуоресценции декстрана 2 MDa также уменьшилось (CVI). Шкалы бар = 100 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4: расследование судьбы химиотерапевтических агентов. (A) eNOStag-GFP животное было лечение и.в. с наночастицами и образы 24 часа позже. Наночастицы по-прежнему присутствуют в сосудах, с минимальным кровоподтек в интерстиции опухоли (МА). Когда наночастиц объединяются с TNF, кровоподтек наблюдается из кровотока в опухоли интерстиция (Оки). Шкалы бар = 250 мкм. (B) использование линзы с высоким разрешением, эндотелиальных цитоплазмы (зеленый) и ядра (синий) отдельной ячейки могут быть признаны. Шкалы бар = 50 µm. (C) eNOStag-GFP животным вводили и.в. с Doxil-сделал в сочетании с TNF, и снимки были сделаны позднее 24 ч. Здесь, кровоподтек Doxil-сделали из сосудов в опухоль интерстиция является очевидным (CI). Более подробную оценку отдельных клеток (CII) показывает, что фиолетовый перевозчика можно найти в цитоплазме (стрелка), в то время как выпущенные доксорубицин (красный) наблюдается в клеточном ядре (стрелки). Шкалы бар = 50 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Обсуждение

Как высоко-динамичные процессы, опухоли и опухоли судно развития, а также опухоли терапевтические эффекты, прижизненные Оценка является элегантный инструмент сделать правильную оценку этих процессов в духе и пространственной зависящие от времени. С растущей доступности живой клетки маркеров, создание трансгенных животных и улучшения визуализации формы прижизненные изображения становится все более и более популярным. Хотя Гистологическая картина по-прежнему широко используется, и множество маркеров могут использоваться для идентификации клеток и структур, разрезания ткани имеет недостатки, когда исследование динамических процессов. Рассечение тканей требуется, только статической информации; Фиксация влияет на качество ткани; и нарезки ущерб сотовой взаимодействий. Кроме того при изучении динамических процессов, рассечение тканей разных и часто предполагается, время-точках требуется большое количество животных. С прижизненной визуализации, XYZ пространственных измерений и дополнительное измерение времени может быть оценен в то же самое животное, делая возможным надлежащего позиционирования различных игроков в пространстве и времени. Таким образом оптимальное время точек не пропустили, и животных номер, используемый в эксперимент значительно уменьшается. Во-вторых время окна с прижизненной оценки могут быть экстраполированы оптимизировать добычу ткани. В-третьих желаемого стадии роста судно может определены прижизненно и окрашенных в целом гора ткани.

Прижизненные дизайн, упомянутых в этой рукописи использует комбинацию трансгенных животных, выражая флуоресцентные метки в эндотелиальных клетках, изменение спинной складки камеры модель и выделенный multiphoton конфокального микроскопа.

Эндотелиальные клетки пройти через ряд этапов^21,22 во время ангиогенеза, и эти этапы можно часто увидеть одновременно в опухоль. С помощью мыши линии eNOSTag-GFP, отдельные эндотелиальные клетки могут следовать, и даже filopodia динамики могут быть прослежены. Поэтому это хорошая модель для изучения развития судна прижизненно. В зависимости от уже в настоящее время имеющих внутренних меток инъекционные флуоресцентные агентов может использоваться для оценки формирования люмен, поток крови, кровоподтек и крови распродажа. Мышь является непрерывно образы для до 5 ч. Возможна долгосрочная оценка животного когда несколько меры относительно наркоза животного, которое было описано ранее²³. Поскольку данное исследование сосредоточено на рак, опухоли ткани или клетки были имплантированы. Однако мы также экспериментировали с плюсны и эмбриональных легких. Однако темпы роста тканей под исследование ограничивается, как через пару недель, кожа начинает вырастить, который может быть проблемой с медленно растущие опухоли или тканей.

На этапе проверки, спинной значительно измененной складки окно камеры по сравнению с классической модели⁴. Рамы изготовлены из синтетического материала автоклавируемый и легкий и небольшой, с видом окна области. Крючок кольцо (рис 1Bg, белые стрелки) используется только для легкого удаления кольца. Стопорные кольца без крючков может использоваться, когда они мешают изображений. Кожа растягивается не слишком много, ослабив не происходит в этой модели, и только редко встречаются инфекции. Эти изменения уменьшить животных дискомфорт и значительно усовершенствовать процедуре животных. Кроме того металлические части могут быть легко удалены при визуализации опухоли с помощью МРТ²⁴.

Любое микроскоп может быть принят прижизненно изображение спинной складки камер. Основным требованием является доступное пространство между микроскопа и объектива. Важным аспектом, который влияет на изображений является движение. Для предотвращения артефактов движения, следует использовать платформу, которая вписывается в таблице микроскоп (после удаления всех вставок) и поддерживает мышь. Это не необходимо сдерживать мыши, когда он находится под наркозом, и это лучше, чтобы мыши дыхание свободно. Однако, окно болтами на платформе, давая оптимальное фиксирование поле зрения (т.е., опухоль видна через окно камеры). Платформа нагревается с помощью электронных грелки, как для животных отопления. Эта платформа была сделана собственными силами, и особенности могут быть получены по запросу. Высоким разрешением объектив является необходимостью при оценке внутриклеточных процессов и делает возможным различать цитоплазмы и ядра. Использование конические линзы с хорошим оптическим разрешением (высокая NA) но относительно длительного рабочее расстояние (желательно 2 мм или выше) рекомендуется. Ограничение в изображений является глубина проникновения и интенсивности флуоресценции меток. Кроме того Фотообесцвечивание, Фототоксичность и насыщенность следует избегать во время визуализации.

Здесь были использованы комплексной конфокальный multiphoton и конфокального микроскопа. Multiphoton вертикально, в то время как конфокальный является инвертированным микроскопом. Преимуществом прямо микроскопом является легко использования линз погружения в воду. Эти объективы имеют высокий NA и длинный рабочее расстояние, даже с увеличением средней (например, 20 или 40 X). В частности рекомендуется для получения 20 X NA 1.0 погружения в воду объектив, который продается несколькими компаниями. Имейте в виду, что, когда используются линзы погружения, объектива и погружения жидкости, необходимо нагревать до 37 ° C. Для лучших изображений, рекомендуется использовать оптимальные настройки конфокальный (т.е., Пинхол на 1 блок Эйри, как низкий, как возможно, выигрыш не слишком высокая мощность лазера, (особенно если выигрыш представляет шум), линии скорость на максимум и не усреднения сканирования). Передержка, насыщенность и разница в интенсивности между изображениями компромисс качества данных. Рекомендуется для предотвращения насыщения и передержки. Это можно обойти путем приобретения изображений на различных получить настройки. Изменение усиления это самый простой способ изменить яркость изображения. При необходимости, можно отрегулировать мощность лазера. Чтобы стандартизировать качество изображения, может использоваться слайды с фиксированной флюоресценция света. Надо иметь в виду, что даже если микроскоп оптимально, качество изображения определяется в значительной степени качество окно камеры и ткани

При сканировании нескольких флуоресцентные маркеры одновременно, обрез через, в которой одна Флюорофор обнаруживается в канале еще один, следует избегать. Избегайте через кровь, используя сочетание флуорофоров с минимальными перекрывающиеся спектры и последовательное сканирование между кадрами. Изображения, представленные здесь были отсканированы с помощью 3 последовательных сканирований (трек 1: GFP, DID или fluor647 лазером 488 и 633; трек 2: родамин, Doxil или mTomato лазером 543; и отслеживать 3: Hoechst лазером 405).

Здесь показана возможность оценки несколько этапов развития опухоли судна, подсказки ячейки динамики, формирования люмен, кровоподтек и сосудистых повреждений. Использование линии eNOStag-GFP, опухоли районы с разрушенной сосудистого русла легко обнаруживаются гранулированный сотовой остатки, по-прежнему выражая GFP. Инъекционные агент не был обнаружен в этих областях, указанием отсутствие потока. Это означает, что управляемый химиотерапевтических агентов не достигнет этих областях либо. Однако судно уничтожения также может быть лечебный результат. Предварительная оценка опухоли, чтобы проверить для уничтожения предварительной обработки судна, является предварительным условием для точной оценки терапевтических и может быть легко выполнена с помощью этот экспериментальный дизайн.

Существует множество возможностей, для которых может использоваться прижизненной микроскопии, и подробное обсуждение выходит за рамки этой публикации. Чтобы дать краткое представление, возможности применения включают исследования на накопление химиотерапевтические в опухолевой ткани, развитие судов (например, количество судов, ветви и пересечений) и потока крови, клеток взаимодействий, Сотовый ориентации и внутриклеточных обработки, а также примеры, упомянутые выше и показано здесь. Анализ основан на флуоресценции, необходимо учитывать колебания интенсивности благодаря качеству окна или ткани. Кроме того как опухолевой ткани довольно толстым, флуоресценции от выше или ниже плоскости зрения влияет на сигнал в изображении. Лучше всего сочетать анализ количественных изображений с объективными измерениями. Например если вы заинтересованы в концентрации наркотиков, удалить опухолевой ткани из окна после прижизненной микроскопии и определения контента, используя с ВЭЖХ для сравнения с конфокальный изображений наркотиков.

Оценка реакции опухоли могут выполняться как также с помощью этой модели, но с некоторые меры предосторожности. Надо понимать, что опухоли также растут внутрь, в кожу. 3D-измерения можно сделать если проникновения достаточно глубоко, чтобы покрыть весь опухоли. В таком случае следует использовать far-red красителей. Окно камеры как описано здесь сделок с опухолями в среде кожи, и это важно отметить, что окно поддерживает температуру немного ниже, чем температура тела нормальные мыши. Таким образом это лучше для изучения опухолей в право микро экологической обстановке для подтверждения прижизненной исследования с спинной складки окно камеры. Важно отметить, что спинной складки палата предлагает понимание кинетики процессов и механизмов, инструментальной основой для совершенствования терапии. Кроме того можно получить дополнительную информацию о накопление и Фармакокинетика. Классически эти исследования накопление осуществляется лечение опухоли подшипник животных и рассекает опухоли/органов для измерения потребления наркотиков. С помощью этой прижизненной модели, расположение внутриопухолевых препарата (т.е. внутрисосудистая, внутриопухолевых, внутриклеточный, или ядерной) могут быть предоставлены^5,25,26. Это не только место показал, но также время окна из возможность для наиболее оптимальное усвоение препарата.

С помощью экспериментальный дизайн, описанные в этой статье, широкий спектр параметров может быть оценен в условиях временных и пространственных. В частности здесь мы показываем, что прижизненной микроскопии предоставляет важную информацию о динамике развития опухоли судна и терапевтические реакции.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Sigma	D1145	Supplemented with 10% FCS
Trypsin-versene (EDTA)	Lonza	BE17-161E	Make a 0.1% solution in PBS, sterile
PBS
Window frames	Costum made
Filler glass 10 mm, 0.55 mm	Abrisia technologies
Cover glass 12mm, #1 thickness	Thermo Scientific/VWR	631-0713
Hear removal gel (veet)			for sensitive skin
Eye ointment
Buprenorfine hydrochloride			use 0.05 mg/kg
Anesthesia unit			O2/Isoflurane inhalation unit with an chamber and tubeing+cone
insulin syringe 0.5ml x 12.7mm 29g, green	BD	324824
Needles 23G 1 1/4"	Braun	4657640
Needles 25G 5/8"	Braun	4657853
Sutures silkan 0.7	Braun	1134019
Nuts	Jeveka	934 A2 1
Bolts	Jeveka	84 A2 1 10
0.9% NaCl
Microscope + software			The space between table and objective need to be wide enough to hold the animal
Heated temperature controlled platform	Costum made
Window holder	Costum made
tetramethylrhodamine 2,000,000 MW dextran	Invitrogen	D7139	100 µg/mouse
Alexa-fluor 647 10,000 MW dextran	Invitrogen	D22914	100 µg/mouse
Hoechst 33342	Invitrogen	H1399	25 µg/mouse
Pegulated nanoparticles			ref 5
LEICA TCS SP5 Multiphoton Microscope	Leica
LAS AF Software	Leica