Rapid Mix Приготовление биоинспирированных наноразмерных гидроксилапатита для биомедицинских применений

Резюме

В данной статье описан новый метод для быстрого производства высококачественных биоинспирированных наноразмерного гидроксиапатита. Этот биоматериал имеет большое значение при изготовлении широкого спектра инновационных медицинских приборов для клинического применения в ортопедии, черепно-лицевой хирургии и стоматологии.

Аннотация

Гидроксиапатита (ГА) широко используется в качестве медицинского керамики из-за его хорошей биосовместимости и Остеокондуктивность. В последнее время наблюдается интерес в отношении использования биоинспирированных наноразмерного гидроксиапатита (НСЗ). Тем не менее, биологический апатит, как известно, кальций-дефицитных и карбонат-замещенный наноразмерного пластинчатой ​​морфологии. Биоинспирированных Nha имеет потенциал, чтобы стимулировать оптимальную регенерацию костной ткани из-за его сходства с костной и зубной эмали минерала. Многие из методов в настоящее время используется для изготовления Nha как в лаборатории, так и на коммерческой основе, включают длительные процессы и сложного оборудования. Таким образом, цель данного исследования состояла в том, чтобы разработать быстрый и надежный способ получения высокого качества биоинспирированных НСЗ. Быстрый способ перемешивания разработан был основан на кислотно-щелочной реакции, включающей гидроксид кальция и фосфорной кислоты. Вкратце, раствор фосфорной кислоты выливают в раствор гидроксида кальция с последующим перемешиванием, промывки исушильные ступени. Часть партии обжигали при 1000 ° С в течение 2 ч, чтобы исследовать высокую температурную стабильность Продукции. рентгеноструктурный анализ показал успешное формирование HA, которое показало термическое разложение к бета-трикальцийфосфат после высокотемпературной обработки, что характерно для кальцийдефицитного HA. ИК-фурье-спектроскопии показал наличие карбонатных групп в осажденном продукте. Частицы nhà имели низкий коэффициент формы с приблизительными размерами 50 х 30 нм, близкими к размерам биологического апатита. Материал был также кальций дефицитных с Са: мольном соотношении Р 1,63, который, как и биологический апатит ниже, чем стехиометрическое соотношение, HA 1,67. Таким образом, этот новый метод является надежным и гораздо более удобным процесс производства биоинспирированных NHA, преодолев необходимость длительных титрование и сложного оборудования. Полученный в результате продукт биоинспирированных HA подходит для использования в самых разнообразныхмедицинских и потребительских приложений здравоохранения.

Введение

Существует большая клиническая потребность для продвинутых биоматериалов с расширенными функциональными возможностями для того, чтобы улучшить качество жизни пациентов и снизить нагрузку здравоохранения глобального старения населения. Гидроксиапатита широко используется в медицинских целях в течение многих лет из-за его хорошей биосовместимости. В последнее время наблюдается повышенный интерес к использованию наноразмерных гидроксиапатита (НСЗ), в частности, для регенерации минерализованной ткани в медицине и стоматологии. Минерал найден в костном и эмали зубов является кальций-дефицитных, мульти-замещенные, наноразмерный гидроксиапатит. Оценки размера биологических тромбоцитов Nha сообщают размеры 50 нм х 30 нм х 2 нм ^1, с еще более мелких структур , описанных в незрелой кости ^2. Контрастно, минерал в зубной эмали составляет от 10 до 100 раз больше , чем найденное в костной ткани и в длине и ширине ^{3, 4.} Синтетические НСЗ может быть лучше называть биоинспирированных, а не биомиметический, так как мы стремимся перевести наблюдения относительно характеристик природных материалов в медицинских технологий с улучшенными характеристиками. Было высказано предположение , что биоинспирированных nhà может быть более благоприятным в костной ткани и регенерации тканей зуба применений из - за его сходства с природе минерал ^5.

Существуют различные методы , которые были зарегистрированы для подготовки Nha включая гидротермальных ^6, окрашенная сухой ⁷ и золь-гель ⁸ методов. Из них метод мокрого осаждения считается относительно удобным способом для производства NHA. Опубликованные методы nhà мокрая осадков , как правило , включают стадию титрование при смешивании кальция и фосфора химических предшественников ^{9, 10, 11,}исх "> ^{12, 13, 14.} Тем не менее, эти подходы связаны с целым рядом недостатков , в том числе длительных и сложных процессов , объединенных в некоторых случаях с необходимостью использования дорогостоящего оборудования. Коммерческое производство может быть еще более сложной, с патентов , описывающих сложные реакторы для производство высококачественных медицинского качества nhà ^15. Несмотря на это, реакция нейтрализации между гидроксидом кальция и фосфорной кислоты является предпочтительным из - за отсутствия пагубного химических побочных продуктов.

Взаимосвязь между условиями процесса, так и морфологию продукта nhà сообщалось для медленных реакций титрованием. В частности, для методов титрования с участием гидроксида кальция и фосфорной кислоты, при повышенной температуре , казалось, способствовать подготовке частиц с низким соотношением сторон ^13. Эта работа была значительно расширена Genплитка и др. ¹⁶ , которые продемонстрировали зависимость между температурой и другими условиями обработки на качество продукции nhà из широкого спектра методов. Он пришел к выводу , что мокрый метод химического осаждения из Пракаш ¹³ сделал высокое качество продукции, но следует отметить , что результаты зависели от технически сложных и медленных / процессов смешивания. Оригинальный Пракаш шаг титрование занимает в течение одного часа. Тем не менее, более длительное время титрование может потребоваться для более крупных пакетов, чтобы быть готовым.

Подводя итог, в то время как влияние нескольких факторов, включая температуру в настоящее время изучены, почти не внимание было направлено на снижение сложности и связанные с ними время, необходимое для выполнения титрования на основе методов. Целью данного исследования было поэтому исследовать эффекты применения быстрого подхода к смеси при производстве биоинспирированных НСЗ, и полностью characteriZe полученные материалы. В случае успеха, упрощенная быстрый подход смесь будет иметь большие преимущества для лабораторных исследователей и промышленности, так, где издержки производства может быть существенно уменьшена без содержащий качество.

протокол

Рисунок 1. Принципиальная схема быстрого приготовления смеси биоинспирированных наноразмерного гидроксиапатита. Раствор фосфорной кислоты выливают в суспензию гидроксида кальция. После того, как взвесь решен в течение ночи, NHA промывали деионизированной водой перед сушкой при 60 до 80 & deg; С. ГУЖС был затем измельчают в агатовой ступки и пестика и спекают, чтобы исследовать термическую стабильность продукта NHA. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

1. Быстрое Mix Производство наноразмерных гидроксилапатита

1. Приготовление растворов кальция и фосфора с получением раствора 5 г наноразмерного гидроксиапатита с использованием кальция к фосфору мольное отношение 1,67.
   1. Добавить 3.705 г гидроксида кальция500 мл деионизированной воды и перемешивают на магнитной мешалке пластине в течение 1 ч при 400 оборотах в минуту.
   2. В отдельном стакане растворяют 3.459 г фосфорной кислоты (85%) в 250 мл деионизированной воды.
2. Налейте раствор в фосфорный перемешиваемой суспензии гидроксида кальция со скоростью примерно 100 мл / с. Накройте мензурку парапленкой (Bemis, США).
3. Оставьте суспензии перемешивают в течение 1 ч при 400 оборотах в минуту.
4. Возьмите стакан выключения мешалки тарелку и оставить осесть в течение ночи.
5. Промыть суспензии путем заливки надосадочную и добавлением 500 мл деионизированной воды и перемешивают в течение 1 мин при 400 оборотах в минуту. Повторите этот шаг три раза в общей сложности, с 2 ч между каждым мытьем.
6. Оставьте Nha суспензии осесть в течение ночи.
7. Слить прозрачный супернатант и поместите оседлое Nha суспензии в сушильной печи при 60 до 80 ° С.
8. При сухой, поместите высушенную НСЗ в агатовой ступки и пестика и не измельчить до штрафа.
9. Поместите 2,5 г пропорошок наведенной NHA в глиноземного тигля и агломерата порошка при 1000 ° С в течение 2 ч с использованием скорости нагрева 10 ° С / мин. После термообработки, оставьте nhà для охлаждения в печи.
10. Хранить порошки в вакуумном эксикаторе.

2. Характеристика наноразмерных гидроксилапатита

1. Рентгеновской дифракции (XRD) с использованием режима передачи дифрактометрах
   1. Поместите небольшое количество (то есть меньше , чем 200 мкл) поли (виниловый спирт) (ПВС) , клей на пленке ацетата и смешать с небольшим количеством (менее 100 мг) NHA порошка.
   2. Относитесь с фена до полного высыхания.
   3. Установить образец в держатель образца и нагрузки на режим передачи рентгеновского дифрактометра с Cu K & _альфа - излучения.
   4. С помощью параметров дифрактометра 40 кВ и 35 мА, с диапазоном 2 & thetas; 10-70 °.
   5. Анализировать полученные в результате Рентгенограммы.
   6. Используйте следующие рентгенограммы карты для идентификации фазы: Гидроксиапатита: 9-432. бета-трикальцийфосфат: 04-014-2292.
2. Просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ)
   1. Поместите небольшое количество порошка (т.е. менее 10 мг) в Bijou и добавить приблизительно 3 мл этанола.
   2. Ультра-гомогенат образец в течение 15 - 30 минут до получения однородной суспензии наблюдается.
   3. Пипеткой небольшое количество раствора (т.е. менее 1 мл) на 400 меш медной сетки с углеродной пленкой с, и дайте высохнуть.
   4. Образцы изображения при ускоряющем напряжении 80 кВ.
3. Рентгеновской флуоресцентной (РФА) службы по материалам и Институт инженерных исследований (МЕРИ) в Шеффилдского университета
   1. Смешайте 0,8 г nhà порошка с 8 г тетрабората лития.
   2. Melt смесь в тигле из сплава платины-золота с использованием печи, настроенной на 1200 ° C.
   3. Анализ результирующих образцов в рентгенофлуоресцентного спектрометра для определения элементного составаобразцов.
4. Фурье-ИК - спектроскопии в режиме нарушенного полного внутреннего отражения (FTIR-ATR)
   1. Выполните 64 фоновых сканирования от 4000 - 500 см ^-1 с разрешением 4 см ^-1.
   2. Поместите небольшое количество (менее 100 мг) NHA порошка на верхней части алмаза в нарушенного полного внутреннего адаптера режим отражательной способности и сжать на поверхность алмаза , используя верхний винт.
   3. Выполните 32 сканирования с 4000 - 500 см ^-1 с разрешением 4 см ^-1 с фоновыми сканирований вычитают из сканирования образца.

Результаты

Рентгенограммы (рисунок 2) показал осаждение чистой фазы HA с широкими пиками, что указывает на относительно небольшой размер кристаллитов и / или аморфный характер. После высокотемпературного спекания, была обнаружена β-трикальцийфосфат (β-TCP), наряду с основной фазой HA. Обострение дифракционных пиков, т.е. уменьшение полной ширины полувысоте, показали увеличение размеров кристаллитов после спекания.

Рисунок 2. Кристалл фазовый анализ продуктов. Рентгеновской дифракции (XRD) модели неспеченного наноразмерных гидроксиапатит (NHA) порошка и порошка nhà спеканию при 1000 ° С в течение 2 ч. Пиковые метки: ▼ гидроксиапатита пики, ■ β-трикальцийфосфат пики.ge.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

ИК-спектры ATR (рис 3) подтвердили образование фазы HA по характерному фосфатом и гидроксильных групп ^{17, 18.} Подробно полосы были распределены следующим образом : 3750 см ^-1 (OH ^- растягивать ν _OH); 1,086 и 1,022 см ^-1 (PO ₄ ^3- v , _3); 962 см ^-1 (PO ₄ ^3- v , _1); 630 см ^-1 (OH ^- либрации δ _OH); 600 и 570 см ^-1 (PO ₄ ^3- ν _4). В неспеченного образце дополнительные пики были распределены следующим образом : широкий пик , сосредоточенный вокруг 3,400 см ^-1 (поглощенные молекулы воды); 1,455 и 1,410 см ^-1 (CO ₃ ^2- ₃ v , ); 880 см ^{-1 (СО ₃ 2- ν _2). Поглощенные воды и карбонатные группы, наблюдаемые в неспеченного порошка на стадии высокотемпературного спекания были удалены. Процесс спекания также конкретизировал гидроксильные и фосфатные группы, которые проявлялось большим пиком на расстояние корыта.}

Рисунок 3. Инфракрасные спектры продуктов. преобразование инфракрасного Фурье в режиме нарушенного полного внутреннего отражения (ИК-Фурье-ATR) спектров неспеченного наноразмерных гидроксиапатит (NHA) порошка и порошка nhà спеченных при 1000 ° С в течение 2 ч. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

ПЭМ - изображения (рисунок 4) показывает образование наноразмерных частиц остроумияH Примерные размеры 50 нм до 30 нм. Частицы имели низкий коэффициент формы (частиц длина / ширина частиц) около 1,7. Размер и форма наноразмерных продуктов были аналогичными размерами биологического апатита ^1.

Рисунок 4. Наномасштабная морфология продукта. Просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) наноразмерных гидроксиапатита (НСЗ), полученного с использованием метода быстрого смешивания при двух увеличениях. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Количественный химический анализ порошка НСЗ РФА (таблица 1) позволила кальций: фосфор соотношение может рассчитываться как 1,63, что несколько ниже , чем стехиометрическое HA whicч имеет кальция: соотношение фосфора 1,67. РФА также показал высокую чистоту продукта nhà с только следовые количества других элементов, записанных.

Соединение	Вес%
CaO	51.52
P 2 O 5	39.89
MgO	0,46
Na 2 O	0,13
Y 2 O 3	0,07
Al 2 O 3	0.03
SiO 2	0.03
Mn 3 O 4	0.03
SrO	0,02
TiO 2	0,01

Таблица 1. Количественный химический анализ продукта. Рентгеновской флуоресценции (РФА) результаты для неспеченного порошка НСЗ показали> 99% чистоты по весу.

Обсуждение

Природные апатит состоит из наноразмерные частицы нестехиометрического газированной гидроксиапатита с приближенным химической формулой Ca _10-ху [(HPO ₄₎ (PO _{4)] 6-х} (CO _{3) Y} (ОН) _2-х. Производство биоматериалов с близкой химической схожести природе минерал, как сообщалось, способствуют оптимальной биологической реакции. Например, исследование на биомиметического кальцийдефицитного газированной nhà показал , что способен стимулировать пролиферацию и активность щелочной фосфатазы мышиных preosteoblast клеток в большей степени , чем обычные nhà ^19.

В этом исследовании, осаждение ГА , который показал частичное термическое разложение при 1000 ° С (рисунок 2) предложил образование кальцийдефицитного HA. Это предложение было поддержано более низкой , чем стехиометрическое Са: Р (1.63) , полученные с данными XRF (Tв состоянии 1). Понятно , что сниженная Са: Р связано с более низкой термостабильностью ^{20, 21, 22, 23.} В этом методе, быстрое добавление раствора фосфорной кислоты быстро понижении рН реакционной суспензии , для генерации HPO ₄ ионов. Присутствие HPO ₄ группы способствовали осаждению кальция кальцийдефицитный ГА, с молекулярной формулой: Са _10-х (HPO _{4) x} (PO _{4) 6-х} (ОН) _2-х, где 0 <х <1.

Быстрое добавление фосфорной кислоты поэтому имели заметное влияние на осаждении кинетики реакции. Как было описано ранее, титрование реакции с участием гидроксида кальция и фосфорной кислоты проводят при комнатной температуре , как правило, дают частицы с высоким соотношением сторон ^13. Для titratioп реакций с участием этих реагентов, необходимо было использовать при повышенной температуре для получения частиц с более низким соотношением сторон , которые больше похожи на биологической апатита ^13. Частицы с высоким уровнем соотношения получаются , когда скорость зарождения кристалла происходит медленнее , чем скорость роста кристалла ^24. Для получения нового метода, разработанного в данном исследовании, быстрое добавление раствора фосфорной кислоты, возможно, при условии, большее количество центров кристаллизации, которые привели к увеличению присутствия мелких округлых частиц, в отличие от меньшего количества частиц с большим соотношением сторон. Поскольку авторы не полностью исследовали эффекты медленно выливая фосфорной кислоты в суспензии гидроксида кальция, для достижения стабильных результатов мы рекомендуем фосфорную кислоту сливают со скоростью сравнимо с тем, как показано на видео (приблизительно 100 мл / с).

В процессе разработки этого метода, авторы INVestigated ряд дополнительных изменений в способе получения NHA на основе Prakash и др. ¹³ в том числе сравнение продуктов , полученных с медленным титрованием и быстрым добавлением раствора фосфорной кислоты ^25. Было установлено, что медленное титрование фосфорной кислоты в суспензии гидроксида кальция, приводит к получению продукта с остатком гидроксида кальция. Мы полагаем, что изменение рН, вызванное быстрым добавлением фосфорной кислоты рекомендуется растворение гидроксида кальция и, следовательно, допускается для успешного превращения реагентов в гидроксиапатита. Сравнение продуктов, полученных с использованием метода быстрого перемешивании при комнатной и повышенных температурах (60 ° С), обнаружили, что при повышенной температуре приводит к более высокой проводимости после завершения реакции. Это позволило предположить, что остаточный гидроксид кальция, который присутствовал, вероятно, будет из-за низкой растворимости гидроксида кальция вповышенные температуры. Присутствие остаточного гидроксида кальция нежелательно, так как основная природа этого соединения может поставить под угрозу биосовместимость.

ИК - Фурье обнаружен характерный фосфат и гидроксильную группу активность , связанную с HA (рисунок 3). Было отмечено, что спектр для спеченного продукта показал, что более резкие фосфатные и гидроксильные пики. Эти изменения были связаны с большей степенью кристалличности продукта ^{26, 27} .The неспеченного спектра при условии доказательства карбонатного замещения B-типа , где карбонатные ионы подменили фосфатных групп. Это в отличие от типа A замещения , где карбонатные ионы могут замещать гидроксильных групп ^17. Сообщалось , что замещение карбоната В-типа происходит в биологической апатита ^3. Тем не менее, Предприятие Tampieri и др. Сообщается, что в то время как замещение B-типа был predominмуравей в молодых костей, А-типа карбоната замещение было все больше и больше присутствует в костях пожилых людей ^28. Карбонат замещение было обнаружено, чтобы уменьшить степень кристалличности и термическую стабильность NHA, увеличивая его растворимость. Были предложены эти изменения , чтобы способствовать увеличению биоактивности карбонатом-замещенных HA ^29. Биологическое HA также известно, содержат некоторые из других элементов , записанных в рентгенофлуоресцентного анализа (таблица 1), таких как магний, натрий и стронций ^30. Наличие этих элементов может также способствовать повышению биологической эффективности. Будущая работа должна быть направлена на подготовку этих наноразмерных замещенных апатитов, а также продукты с повышенным biofunctionality , таких как серебро , легированного Nha ^31. Для того чтобы получить замещенный NHA, элемент может быть введен с соответствующим уменьшением предполагаемого элемента к substitutе для, например , уменьшение количества соединения кальция , когда стронций, магний или цинк замена попытка ^32. В качестве альтернативы, другой подход может быть добавление элементов с целью обеспечения «легированные» ионы , которые присутствуют на поверхности ГУЖС без того, чтобы обязательно заменить элемент в кристаллическую решетку HA ^31. Для этих модификаций метода можно приготовить смешанные растворы, такие как гидроксид кальция и нитрата серебра, а также проводить реакцию таким же способом, как описано здесь.

В заключение, этот документ сообщает новый быстрый и существенно улучшенный способ получения биоинспирированных НСЗ. Для этого метода, быстрое смешивание химикатов занимает менее 5 секунд, что является заметное сокращение времени по сравнению с титровании реакции, как правило, требующих часов тщательного контроля. Она имеет большой потенциал для использования в BIOMATПерс развитие из-за своей относительной простоты и низкой стоимости по сравнению с используемыми в настоящее время промышленными методами производства НСЗ, где присущая сложность текущих результатов коммерческих систем в длительных исследований и разработок времен, и существенно увеличились производственные затраты. В частности, этот новый метод превосходит непрерывных процессов потока или методов гидротермальных из-за значительного снижения инвестиционных требований пуска оборудования.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Calcium hydroxide (purity of ≥ 96%)	Sigma Aldrich UK	31219	Good laboratory practise should be used at all times including the use of appropriate personal protective equipment.
Phosphoric acid (85%)	Sigma Aldrich UK	345245	Safety goggles and a faceshield should be used when handling this product (see safety data sheet from Sigma Aldrich for further information).
STOE IP X-ray diffractometer	Phillips
International centre for diffraction data (ICDD) PDF4+ database	International Centre for Diffraction Data
Holey carbon films on 300 mesh grids	Agar Scientific	S147-3H
Tecnai G2 Spirit transmission electron microscope	FEI
Lithium tetraborate	ICPH, Malzéville, France
PW2440 XRF spectrometer	Philips
ThermoScientific Nikolett Spectrometer	Unicam Ltd