JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В настоящей статье представлен технологический процесс высококонцентрированной микроскопии для одновременной количественной оценки внутриклеточных уровней ROS, а также потенциала и морфологии митохондриальной мембраны - совместно называемой морфофункциональной функцией митохондрий - в живых адгезивных клетках с использованием флуоресцентных репортерных молекул клеток 5- (и / 6) -хлорметил-2 ', 7'-дихлордигидрофлуоресцеиндиацетат, сложный ацетил (CM-H 2 DCFDA) и метиловый эфир тетраметилродамина (TMRM).

Аннотация

Реактивные виды кислорода (ROS) регулируют основные клеточные процессы, включая экспрессию генов, миграцию, дифференцировку и пролиферацию. Однако чрезмерные уровни ROS вызывают состояние окислительного стресса, что сопровождается необратимым окислительным повреждением ДНК, липидов и белков. Таким образом, количественное определение ROS обеспечивает прямой прокси для состояния клеточного здоровья. Поскольку митохондрии входят в число основных клеточных источников и мишеней АФК, совместный анализ митохондриальной функции и продукции АФК в одних и тех же клетках имеет решающее значение для лучшего понимания взаимосвязи в патофизиологических условиях. Поэтому была разработана стратегия с высоким содержанием микроскопа для одновременной количественной оценки внутриклеточных уровней ROS, потенциала митохондриальной мембраны (ΔΨ m ) и морфологии митохондрий. Он основан на автоматизированной флуоресцентной флуоресцентной микроскопии и анализе изображений живых клеток, выращенных в многолуночных планшетах, и стеанеD с клеточно-проницаемыми флуоресцентными репортерными молекулами CM-H 2 DCFDA (ROS) и TMRM (ΔΨ m и митохондриальной морфологией). В отличие от флуориметрии или проточной цитометрии эта стратегия позволяет количественно определять субклеточные параметры на уровне отдельной клетки с высоким пространственно-временным разрешением, как до, так и после экспериментальной стимуляции. Важно отметить, что основанный на изображении характер метода позволяет экстрагировать морфологические параметры в дополнение к интенсивностям сигналов. Комбинированный набор функций используется для исследовательского и статистического многомерного анализа данных для выявления различий между субпопуляциями, типами клеток и / или обработками. Здесь приводится подробное описание анализа, а также примерный эксперимент, который доказывает его потенциал для однозначного различения между клеточными состояниями после химического возмущения.

Введение

Концентрация внутриклеточных ROS тщательно регулируется посредством динамического взаимодействия между ROS-продуцированием и системами разжижения ROS. Дисбаланс между ними провоцирует состояние окислительного стресса. Среди основных источников ROS - митохондрии 1 . Учитывая их роль в клеточном дыхании, они отвечают за объем внутриклеточных молекул супероксида (O 2 • - ) 2 . Это в основном связано с утечкой электрона в O 2 в комплексе 1 цепи переноса электронов в условиях сильного отрицательного внутреннего мембранного потенциала митохондрий (Δψ m ), т.е. митохондриальной гиперполяризации. С другой стороны, митохондриальная деполяризация также коррелирует с увеличением продукции ROS, указывая на множественные способы действия 3 , 4 , 5 ,> 6 , 7 , 8 . Кроме того, с помощью окислительно-восстановительных модификаций в белках механизмов деления-слияния РОС совместно регулирует митохондриальную морфологию 9. Например, фрагментация коррелирует с повышением продукции АФК и апоптозом 10 , 11 , тогда как нитевидные митохондрии связаны с питательным голоданием и защитой от Митофагия 12 . Учитывая сложную взаимосвязь между клеточной АФК и морфофункциональной функцией митохондрий, в идеале их следует количественно определять одновременно в живых клетках. Для этого был разработан анализ изображений с высоким содержанием, основанный на автоматизированной широкополосной микроскопии и анализе изображений клеточных культур, окрашенных флуоресцентными зондами CM-H 2 DCFDA (ROS) и TMRM (митохондриальная Δψ m и морфология). Отображение с высоким содержанием относится к извлечению sp(То есть , большое количество описательных признаков) информацию о клеточных фенотипах с использованием множественных комплементарных маркеров и автоматизированный анализ изображений. В сочетании с автоматизированной микроскопией многие образцы можно скринировать параллельно ( т.е. с высокой пропускной способностью), тем самым увеличивая статистическую мощность анализа. В самом деле, основным преимуществом протокола является то, что он позволяет одновременно количественно определять несколько параметров в одной и той же ячейке, и это для большого количества ячеек и условий.

Протокол разделен на 8 частей (подробно описанных в протоколе ниже): 1) Посеяющие клетки в 96-луночном планшете; 2) приготовление исходных растворов, рабочих растворов и буфера для визуализации; 3) Настройка микроскопа; 4) загрузка клеток DCFDA и TMRM CM-H 2 ; 5) Первая визуализация в реальном времени для измерения базальных уровней ROS и митохондриальной морфофункциональности; 6) Второе изображение в реальном времени после добавления трет -бутилПероксид (TBHP) для измерения индуцированных уровней ROS; 7) Автоматизированный анализ изображений; 8) Анализ данных, контроль качества и визуализация.

Этот анализ был первоначально разработан для нормальных человеческих дермальных фибробластов (NHDF). Так как эти клетки большие и плоские, они хорошо подходят для оценки морфологии митохондрий в двумерных широкопольных изображениях 13 , 14 . Однако, с небольшими изменениями, этот метод применим к другим типам адгезивных клеток. Кроме того, рядом с комбинацией DCFDA CM-H 2 и TMRM рабочий процесс соответствует множеству пар флуоресцентных красителей с различными молекулярными особенностями 1 , 15 .

протокол

Ниже описывается протокол, который выполняется для ячеек NHDF и с использованием многолуночных планшетов, указанных в файле материалов. См . Рисунок 1 для общего обзора рабочего процесса.

1. Приготовление реагентов

  1. Подготовить полную среду путем добавления модифицированной по Дульбекко среды Игла (DMEM) 10% об. / Об. Фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 100 МЕ / мл пенициллина и 100 МЕ / мл стрептомицина (PS). Для 500 мл полной среды добавьте 50 мл FBS и 5 мл PS к 445 мл DMEM.
  2. Подготовка буфера для визуализации HBSS-HEPES (HH) путем добавления сбалансированного солевого раствора Хэнкса (с магнием и кальцием, но без фенолового красного) с 20 мМ HEPES. Для 500 мл HH добавьте 10 мл 1M раствора HEPES в 490 мл HBSS. Проверьте рН и, при необходимости, доведите рН до 7.2.
  3. Готовят 1 мМ маточный раствор DCFDA CM-H 2 путем растворения 50 мкг лиофилизированного порошка DC-DC CM-H 2 в 86,5 мл# 181; L безводный ДМСО. Смешайте путем вортекса или пипетирования вверх и вниз и сделайте 20 мкл аликвот в коричневых микроцентрифужных пробирках. Хранить в темноте при температуре -20 ° C и использовать в течение 1 недели. При хранении в атмосфере N 2 срок годности может быть увеличен до 1 месяца.
    1. Приготовьте 1 мМ маточный раствор TMRM, растворяя 25 мг порошка TMRM в 50 мл безводного ДМСО. Смешайте путем встряхивания или пипетирования вверх и вниз и сделайте аликвоты по 10 мкл в коричневых микроцентрифужных пробирках. Хранить в темноте при температуре -20 ° C. Это решение стабильно в течение как минимум года.
  4. Подготовьте свежую аликвоту запаса трет -бутилпероксида (TBHP) (~ 7 М) для каждого эксперимента, непосредственно запивая объем из 70% -ного исходного раствора (10 мкл / 96-луночный планшет). Держите эту аликвоту при 4 ° C до дальнейшего использования.
  5. Приготовьте рабочий раствор антитела (AB), разбавив два вторичных антитела (Alexa Fluor 488 ослепительного антикролика и CY3 осла-кролика) в 1000 раз в 1x HH-buffer.

2. Настройка протокола микроскопа и сбора данных (± 15 мин)

ПРИМЕЧАНИЕ. Съемка изображения производится с помощью широкопрофильного микроскопа, оснащенного автоматизированной сценой и жалюзи, и аппаратной системы автофокусировки с использованием объектива с коррекцией по плану 20Х (NA = 0.75) и камеры EM-CCD. При первой настройке анализа контрольная ячейка, содержащая контрольные ячейки, окрашенные в соответствии с инструкциями протокола, используется для калибровки XY-стадии и оптимизации настроек сбора. Если настройки захвата уже определены, калибровка может быть выполнена с использованием пустой пластины.

  1. Опустите цель на абсолютный базовый уровень и откалибруйте XY-этап, следуя инструкциям программного обеспечения.
  2. Убедитесь, что установлены правильные кубы фильтра. Чтобы визуализировать DCFDA CM-H 2, используйте стандартный куб фильтра GFP с полосковым фильтром возбуждения 472/30 нм, дефлектором с отсечкой 495 нмИК-зеркало и полосовой фильтр 520/35 нм. Для TMRM используйте куб фильтра для TRITC с полосковым возбуждающим фильтром 540/25 нм, дихроичным зеркалом с отсечкой 565 нм и полосовым фильтром 605/55 нм.
  3. Создайте протокол обработки изображений, используя программное обеспечение для сбора данных.
    1. Выберите правильный тип многолуночной плиты (производитель и код) из списка доступных пластин, входящих в программное обеспечение. Альтернативно, определите свой собственный формат пластины с несколькими планшами, используя размеры пластин и колодцев.
    2. Выровняйте планшет в соответствии с инструкциями программного обеспечения, например , определив два угла четырех внешних угловых колодцев. Этот шаг охватывает изменение ориентации камеры.
    3. Выберите лунки, которые необходимо приобрести. Если эта опция недоступна в программном обеспечении, используйте набор определенных вручную XY-мест, которые соответствуют выбранным лункам.
    4. Оптимизируйте настройки захвата (время экспозиции, интенсивность лампы, коэффициент усиления электромагнитной волны) дляE два канала, отдельно используя испытательную пластину. Минимизируйте экспозицию и интенсивность, поскольку сам свет возбуждения флуоресценции вызывает ROS. Но убедитесь, что отношение сигнала к фону не менее 2 для базового DCFDA CM-H 2 и 3 для TMRM до обработки TBHP и что после обработки TBHP нет насыщения. Параметры сбора сильно зависят от настройки микроскопа и типа используемого элемента, но в качестве ориентировочных ориентировочных параметров при использовании в качестве источника света галогеновой лампы с металлогалогенной лампой, а источником света и NHDF-элементами, окрашенными в соответствии с инструкциями протокола, являются: для обоих CM- H 2 DCFDA и TMRM используется время экспозиции 200 мс и ND-фильтр 8 в сочетании с коэффициентом усиления электромагнитного поля 15 (13 МГц, 14 бит) и 4 (27 МГц, 14 бит) соответственно. После оптимизации для определенной настройки и типа ячейки этот шаг можно пропустить.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Важно, чтобы параметры сбора сохранялись одинаковыми на протяжении всего процесса формирования изображения. Для крупномасштабных многодневных экспериментов лампаСтабильность должна быть гарантирована регулярным контролем качества.
    5. Определите протокол сбора данных, состоящий из последовательного получения лямбда (длины волны). Выберите сначала канал DC-DC CM-H 2, который должен быть получен, чтобы минимизировать воздействие света до измерения.
    6. Определите петлю луночного планшета, чтобы получить 4 равномерно распределенных неперекрывающихся изображения, расположенных вокруг центра каждой лунки при выборе скважины, с использованием протокола сбора, определенного в 2.3.4. Выберите извилистое получение изображения, т.е. сначала слева направо, от скважины B02 до B11, затем назад, справа налево, от скважины C11 до C02 и так далее ( рисунок 2A ). Это экономит время по сравнению с захватом изображения слева направо. Если эта опция недоступна в программном обеспечении, настройте пользовательский набор XY-мест, созданных в 2.3.3, чтобы взять этот шаблон изображения.
    7. Сохраните XY-координаты позиций отображения ( например, в отдельном xml-файле), чтобы облегчить просмотрНг в случае повторной калибровки микроскопа. Это особенно важно, если показания из этого анализа должны быть сопоставлены с последующим окрашиванием иммунофлюоресценции (IF) для тех же клеток.

3 . Посеявшие клетки в 96-луночном планшете (45 - 90 мин, в зависимости от количества различных клеточных линий)

  1. Работайте в стерильной среде, например, в шкафу биологической безопасности класса 2 и надевайте перчатки.
  2. Обеззараживать все поверхности и материалы с использованием 70% об. / Об. Этанола в дистиллированной воде.
  3. Возьмите колбу для культивирования клеток с 90% конфлюентной культуры клеток из инкубатора и поместите ее в шкаф для биобезопасности.
  4. Промывают клетки дважды PBS 1x.
  5. Добавьте соответствующее количество 0,05% раствора трипсина-ЭДТА на клетки, убедившись, что вся поверхность клетки покрыта ( например , 1 мл в колбе Т25) и инкубируйте в течение 2 мин при 37 ° С и 5% СО 2 .
  6. Если все ячейки отсоединены (проверьте с помощью микроскопа ) Добавляли культуральную среду (DMEM + 10% FBS + 1% пенициллин-стрептомицин, ± 4 мл в колбе Т25) для инактивации раствора трипсина-ЭДТА.
  7. Центрифуга в течение 5 мин при 300 xg при комнатной температуре.
  8. Отбросьте супернатант и ресуспендируйте осадок клеток в культуральной среде. Определите количество среды для каждого типа клеток, чтобы получить концентрацию клеток, которая совместима с подсчетом клеток. Обычно 90% конфлюентная колба Т25 из NHDF содержит около 1-1,5 млн клеток, которые ресуспендируют в 3-4 мл культуральной среды.
  9. Подсчитайте ячейки, используя камеру подсчета клеток или счетчик Coulter.
  10. Семена 8000-10 000 клеток в каждой из 60 внутренних ячеек черной 96-луночного планшета с тонким непрерывным полистиролом или стеклянным дном (черного цвета, чтобы избежать рассеяния и перекрестных помех между соседними лунками при визуализации). При использовании различных условий / обработок / клеточных линий, равномерно распределите их посевные площади на планшете, чтобы минимизировать эффекты пластины (Fig "> Рисунок 2A). Внешние лунки, за исключением колодцев B01 и A01, не используются, потому что они более подвержены краевым эффектам.
  11. Высевают 8000-10 000 клеток в B01. Эта скважина будет использоваться для регулировки фокуса, непосредственно перед захватом изображения.
  12. Заполните пустые внешние лунки средой для минимизации градиентов (температура, влажность и т. Д.) Между скважинами и окружающей средой.
  13. Аккуратно постучите по пластине три раза, прежде чем поместить ее обратно в инкубатор, чтобы избежать роста клеток в пластырях.
  14. Культуру клеток в течение 24 часов, или до степени слияния ок. 70%.
  15. Сохраните данные об обработке для эксперимента в электронной таблице под названием «Setup.xlsx». Файл должен содержать четыре столбца и использоваться для связывания обработок с лунками и информацией об изображении во время анализа данных. Четыре столбца: «Ну», «Число обработки», «Обработка» и «Контроль» (одна строка на лунку). Каждая обработка связанаС уникальным номером обработки, который используется при визуализации данных для определения порядка обработки по оси абсцисс участков. Контрольный столбец определяет лечение, которое функционирует как контроль за обработкой в ​​текущей строке. Иллюстрации типового экспериментального макета и соответствующего установочного файла показаны на рисунке 2 .

4. Загрузка клеток с DCFDA CM-H 2 и TMRM (± 45 мин)

ПРИМЕЧАНИЕ. Обращение с клетками в день эксперимента может проводиться в стерильной среде (кабинет биобезопасности), но это необязательно, так как клетки будут удаляться или фиксироваться непосредственно после анализа.

  1. Нагрейте HH-буфер до 37 ° C.
  2. Подготовьте 20 мкМ рабочий раствор TMRM, разбавив 1 мМ исходный раствор 50 раз в HH-буфере (добавьте 490 мкл HH-буфера к 1 аликвоте 10 мкл основного раствора TMRM).
  3. Подготовка нагрузкиС 2 мкМ CM-H 2 DCFDA и 100 нМ TMRM. С этой целью разбавляют 1 мМ маточный раствор DCFDA CM-H 2 500х и рабочий раствор 20 мкМ TMRM 200х в HH-буфере.
    1. Обычно для 60 лунок готовят 7,5 мл загрузочного раствора, добавляя 15 мкл DCFDA CM-H 2 и 37,5 мкл раствора TMRM к 7447,5 мкл HH.
  4. Отбросьте культуральную среду из клеток, повернув пластину вверх дном одним движением жидкости.
  5. Осторожно промывайте клетки дважды HH-буфером, используя многоканальную пипетку (100 мкл / лунку). Удалите HH-буфер между стадиями промывки, повернув пластину вверх дном одним движением жидкости.
  6. Загружайте клетки с помощью DCFDA и TMRM CM-H 2 , добавляя по 100 мкл загрузочного раствора в каждую лунку, снова используя многоканальную пипетку. Инкубируйте в течение 25 мин в темноте при комнатной температуре. Не забудьте хорошо B01.
  7. В течение этих 25 минут приготовьте рабочие растворы окислителя TBHP и убедитесь, что микроскоп и вспомогательное оборудование включены.
    1. Подготовьте рабочий раствор I: Разбавьте маточный раствор 7М 70х до 100 мМ (10 мкл бульона в 690 мкл HH-буфера).
    2. Подготовка рабочего раствора II: Разбавьте WS I 100x до 1 мМ (10 мкл WS I в 990 мкл HH-буфера).
    3. Приготовьте рабочий раствор III: Разбавьте WS III 25х до 40 мкМ (для 60 лунок добавить 300 мкл WS II в 7200 мкл буфера HH).
  8. Через 25 мин снова промывают клетки дважды с помощью 100 мкл HH-буфера, как описано выше.
  9. Добавьте 100 мкл HH-буфера ко всем 60 внутренним лункам.

5. Первый раунд живой визуализации для измерения базальных уровней ROS и митохондриальной морфофункциональности (± 15 минут)

  1. Убедитесь, что программное обеспечение для сбора данных работает, и протокол обработки изображений загружен.
  2. Установите пластину на микроскоп, включите оборудование ba.Sed и использовать B01 для корректировки смещения автофокусировки с использованием канала TMRM. Поскольку эта процедура вызывает увеличение интенсивности сигнала DCFDA CM-H 2 , эта скважина исключается из последующего анализа изображения.
  3. Запустите протокол формирования изображений.

6. Второй раунд живых изображений после добавления TBHP к измеренным уровням ROS (± 20 минут)

  1. Осторожно удалите 96-луночный планшет с микроскопа.
  2. Добавить 100 мкл TBHP WS III (40 мкМ) в каждую лунку, используя многоканальную пипетку (это приводит к концентрации 20 мкМ TBHP в лунках). Это соединение используется в качестве внутреннего положительного контроля окрашивания DCFDA CM-H 2 (сигнал должен повышаться), а также средство для измерения индуцированных уровней ROS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: H 2 O 2 также можно использовать вместо TBHP, но это соединение является менее стабильным и, следовательно, менее надежным.
  3. Подождите не менее 3 минут, чтобы обеспечить полную реакцию TBHP wС CMF-H 2 DCFDA.
  4. В течение этого времени, добавьте 100 мкл рабочего раствора антитела (1/1000) в лунку А01.
  5. Смонтируйте пластину на микроскоп и снова проверьте фокус с помощью лунки B01.
  6. Получите те же позиции, что и в первом раунде обработки изображений, используя тот же протокол передачи изображений.
  7. Экспортируйте полученные наборы данных в одну папку в виде отдельных файлов TIFF с использованием стандартизованной номенклатуры, которая включает в себя ссылку на планшет, обработку перед или после TBHP, ну, поле и канал, разделенные символами подчеркивания, например . «P01_Pre_B02_0001_C1» для пластины 1, обработка перед TBHP, скважина B02, поле 1 и канал 1. Эта информация будет использоваться во время анализа изображения ( например, для выбора соответствующих настроек сегментирования), а также во время анализа данных (для подключения данных анализа С правильным лечением).
  8. Приобретите изображения плоского поля для обоих каналов во всех четырех положениях вокруг центра лунки A01, используя протокол сбора данных. СохранитьEm в виде отдельных файлов TIF в той же папке, что и другие изображения, используя следующую стандартизованную номенклатуру: «P01_FF_A01_0001_C1» для пластины 1, поля 1 и канала 1. Убедитесь, что сигналы находятся в пределах динамического диапазона; В случае насыщения используйте более низкую концентрацию рабочего раствора антитела.
  9. Выбросьте плиту или сохраните ее для дальнейшей обработки.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Вместо того, чтобы вынимать пластину из микроскопа и использовать многоканальную пипетку для добавления раствора TBHP, на этапе микроскопа может быть установлена ​​автоматическая пипетка и подключена к программному обеспечению для регистрации, чтобы функционировать после получения триггера. Это позволяет добавлять TBHP в каждую лунку сразу после первого приобретения, прежде чем переходить к следующей скважине. Таким образом, когда первый раунд обработки изображений завершен, второй может начинаться сразу же, и все лунки будут иметь равное время инкубации с TBHP.

7. Обработка и анализ изображений (± 30 мин.96-луночный планшет)

ПРИМЕЧАНИЕ. Вся обработка изображений выполняется в FIJI (http://fiji.sc), в упакованной версии бесплатной программы ImageJ. Специальный сценарий был написан для автоматизированного анализа внутриклеточных сигналов ROS- и митохондрий, а также морфологических параметров (RedoxMetrics.ijm, доступен по запросу). Основные алгоритмы описаны в Sieprath et al. 1 .

  1. Убедитесь, что FIJI установлен и работает.
  2. Запустите FIJI и установите макрос (Plugins -> Macros -> Install ...). Это вызовет ряд новых макрокоманд, а также набор инструментов действий для оптимизации параметров анализа, как показано на рисунке 3A .
  3. Откройте интерфейс настройки, чтобы установить параметры анализа, нажав кнопку «S» ( рисунок 3B ).
    1. Выберите тип изображения, количество каналов и колодец, который был использованДля получения плоских изображений.
    2. Укажите, какой канал содержит ячейки (канал DCFDA CM-H 2 ) или митохондрии (TMRM-канал), и настройте параметры предварительной обработки и сегментации для каждого канала в зависимости от качества изображения ( рисунок 3B ). Установите флажки «Фон» и «Контраст» для выполнения вычитания фона или уменьшения контрастности адаптивного гистограммного выравнивания 16 соответственно. Определите сигму для гауссового размытия клеток и лапласианского усиления митохондрий. Выберите алгоритм автоматического порога и заполните пределы исключения размера (в пикселях). Если вместо автоматического алгоритма порогового значения выбран фиксированный порог, заполните верхний порог.
    3. Проверьте настройки сегментации на нескольких выбранных изображениях полученных наборов данных, открыв их и нажав кнопки «C» или «M» в меню для сегментации ячейки или митохондрии соответственно,И при необходимости настройте параметры. Примерный результат показан на рисунке 3C .
  4. Запустите пакетный анализ в интересующих папках, нажав кнопку «#» и выбрав папку с изображениями. В папке это создаст новый «выходной» каталог, содержащий отдельные наборы ROI (zip-файлы) и файлы результатов (.txt) на изображение. Для обоих каналов файл результатов содержит интенсивность и морфологические дескрипторы. Файл результатов канала (ячейки) CM-H 2 DCFDA содержит для каждого дескриптора среднее значение для комбинированных областей ROI в пределах одного изображения. Для канала TMR файл результатов содержит для каждого дескриптора значение для каждой отдельно сегментированной рентабельности митохондрий.
  5. После пакетного анализа визуально проверьте эффективность сегментации в «стек проверки», гиперэкстензию всех изображений с их соответствующим наложением ROI, нажав кнопку «V». Таким образом, такие артефакты,/ Undersegmentation, из-за фокусных изображений или частиц пыли / волокон в изображениях уже можно быстро определить. Дальнейшая курация может быть выполнена во время контроля качества данных (см. § 8).

8. Анализ данных, контроль качества (QC) и визуализация

Обработка и анализ необработанных данных осуществляется с использованием статистического бесплатного ПО R (http://www.rproject.org - версия 3.3.2) и RStudio (http://www.rstudio.com/ - версия 1.0.44). Для быстрого получения и визуализации результатов было разработано интуитивное приложение Shiny 17 (доступное по запросу), которое интегрирует и визуализирует данные в тепловых картах и ​​коробчатых диаграммах, а также выполняет статистический анализ. Как правило, рабочий процесс состоит из двух последовательных этапов. Во-первых, данные обрабатываются и проверяются на 96-луночном планшете для обнаружения аберрантных точек данных. Во-вторых, данные куратора из всех таблиц данного эксперимента объединяются и анализируются с использованием непараметрических мультиВарьировать тесты 18 и анализ главных компонентов.

  1. Убедитесь, что R и RStudio установлены и работают.
  2. Запустите RStudio.
  3. Откройте приложение Brightox RedoxMetrics и запустите приложение (выберите его для запуска во внешнем браузере).
  4. На странице «вход» выберите каталог, в котором находятся файлы результатов с RedoxMetrics.ijm.
  5. Убедитесь, что в этом каталоге также присутствует «Setup.xlsx» (созданный на шаге 3.15).
  6. Файлы результатов и информация о настройках автоматически импортируются, переупорядочиваются и визуализируются.
    1. На странице экспериментальной установки показана схема эксперимента. Используйте эту страницу для проверки.
    2. На следующей странице «результаты на пластине» показаны данные для каждой пластины отдельно в цветовой кодировке многолуночного планшета, а также в коробчатых диаграммах с выбросами, обозначенными именем скважины и номером изображения. Последнее позволяет легко проверять и идентифицировать(Чрезвычайно высокие или низкие значения по сравнению со средними значениями, измеренными для этой конкретной обработки - см . Рисунок 4 для примера).
      Используя эту информацию, проверьте изображения, соответствующие аберрантным точкам. Если обнаружены аномалии, они должны быть удалены из анализа. Большинство аномалий вызвано неправильной сегментацией, когда (часть) изображения не в фокусе, или когда сильно флуоресцирующие частицы пыли нарушают правильную сегментацию. Экстремальные случаи уже можно быстро определить с помощью инструмента стека проверки (шаг 7.5), но на этом этапе обнаруживаются более тонкие случаи. Если нет явных или технических причин для аберрантного значения, изображение не должно быть удалено из анализа.
    3. Необязательно: создайте новую таблицу с именем «Drop.xlsx» только с одним столбцом под названием «Drop». В этом столбце укажите имена файлов (включая расширение «.tif») всех изображенийКоторые должны быть удалены из анализа (идентифицированного на этапе 7.5 или этапе 8.6.2). Загрузите этот файл с помощью страницы ввода.
    4. На странице результатов с целым экспериментом представлены результаты всех пластин вместе взятых. Если файл выгрузки был загружен, этот файл используется для удаления указанных точек данных из анализа.
      Для каждого параметра в отдельности данные нормируются на пластину в соответствии с их соответствующими элементами управления. Затем данные со всех пластин объединяются, затем следуют непараметрические многовариантные тесты из пакета nparcomp 18 . Если сравнивать только 2 обработки, то выполняются два типовых теста для непараметрической задачи Беренса-Фишера. Для более чем двух обработок используется непараметрический анализ множественного сравнения на основе контраста. Результаты визуализируются с использованием boxplots.
    5. На странице «кластерный анализ» показаны результаты анализа основных компонентов (стандартный пакет «статы» PCA-R). Данные по 5 параметрам (баSal и индуцированная ROS и потенциал митохондриальной мембраны, размер и округлость) объединяются, чтобы различать различные методы лечения, основанные на чувствительном окислительно-восстановительном профиле. Для этого выполняется анализ главных компонентов (РСА) (пакет R core 'stats'). Результаты визуализируются с использованием biplot (пакет ggbiplot - http://github.com/vqv/ggbiplot).
    6. Используйте страницу «данные загрузки» для загрузки фреймов данных, содержащих обработанные и перестроенные данные, чтобы они могли быть повторно использованы для более расширенной визуализации данных или статистического анализа.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Типичные ловушки и потенциальные решения перечислены в таблице 1 .

Результаты

Анализ проводился с использованием нескольких контрольных экспериментов, результаты которых описаны в Sieprath et al. 1 . Вкратце, флуоресцентный отклик DCFDA CM-H 2 и TMRM на внешние вызванные изменения внутриклеточных ROS и Δψm , соответственно, был ко?...

Обсуждение

В данной статье описывается метод микроскопии высокого содержания для одновременной количественной оценки внутриклеточных уровней ROS и митохондриальной морфофункциональности в NHDF. Его эффективность была продемонстрирована на примере исследования SQV-обработанных NHDF. Результаты под...

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что не существует конкурирующих финансовых интересов или других конфликтов интересов. Соответствующий автор также гарантирует, что всем авторам было предложено раскрыть любые и все конфликты интересов.

Благодарности

This research was supported by the University of Antwerp (TTBOF/29267, TTBOF/30112), the Special Research Fund of Ghent University (project BOF/11267/09), NB-Photonics (Project code 01-MR0110) and the CSBR (Centers for Systems Biology Research) initiative from the Netherlands Organization for Scientific Research (NWO; No: CSBR09/013V). Parts of this manuscript have been adapted from another publication1, with permission of Springer. The authors thank Geert Meesen for his help with the widefield microscope.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Reagents
Tetramethylrhodamine, Methyl Ester, Perchlorate (TMRM)ThermoFisher ScientificT668
CM-H2DCFDA (General Oxidative Stress Indicator)ThermoFisher ScientificC6827
Dimethyl sulfoxideSigma)AldrichD8418
MatriPlate 96-Well Glass Bottom MicroWell Plate 630 µL-Black 0.17 mm Low Glass LiddedBrooks life science systemsMGB096-1-2-LG-L
HBSS w/o Phenol Red 500 mLLonzaBE10-527F
DMEM high glucose with L-glutamineLonzaBE12-604F
Phosphate Bufered Saline (PBS) w/o Ca and MgLonzaBE17-516F
HEPES 1 M 500 mLLonza17-737F
Trypsin-Versene (EDTA) SolutionLonzaBE17-161E
Cy3 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson711-166-152Antibody used for acquiring flat-field image
Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson711-546-152Antibody used for acquiring flat-field image
NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment
Nikon Ti eclipse widefield microscopeNikon
Perfect Focus System (PFS)Nikonhardware-based autofocus system
CFI Plan Apo Lambda 20X objectiveNikon
NameCompanyCatalog NumberComments
Software
NIS Elelements Advanced Research 4.5 with JOBS moduleNikonThis software is used to steer the microscope and program/perform the automatic image acquisition prototocol
ImageJ (FIJI) Version 2.0.0-rc-43/1.50g
RStudio Version 1.0.44Rstudio
R version 3.3.2

Ссылки

  1. Sieprath, T., Corne, T. D. J., Willems, P. H. G. M., Koopman, W. J. H., De Vos, W. H. Integrated High-Content Quantification of Intracellular ROS Levels and Mitochondrial Morphofunction. AAEC. 219, 149-177 (2016).
  2. Marchi, S., et al. Mitochondria-ros crosstalk in the control of cell death and aging). J Signal Transduct. 2012, 1-17 (2012).
  3. Korshunov, S. S., Skulachev, V. P., Starkov, A. A. High protonic potential actuates a mechanism of production of reactive oxygen species in mitochondria. FEBS lett. 416 (1), 15-18 (1997).
  4. Miwa, S., Brand, M. D. Mitochondrial matrix reactive oxygen species production is very sensitive to mild uncoupling. Biochem Soc Trans. 31 (Pt 6), 1300-1301 (2003).
  5. Verkaart, S., et al. Superoxide production is inversely related to complex I activity in inherited complex I deficiency. BBA-GEN SUBJECTS. 1772 (3), 373-381 (2007).
  6. Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochem J. 417 (pt 1), 1-13 (2009).
  7. Lebiedzinska, M., et al. Oxidative stress-dependent p66Shc phosphorylation in skin fibroblasts of children with mitochondrial disorders. BBA-GEN SUBJECTS. 1797 (6-7), 952-960 (2010).
  8. Forkink, M., et al. Mitochondrial hyperpolarization during chronic complex I inhibition is sustained by low activity of complex II, III, IV and V. BBA-BIOENERGETICS. 1837 (8), 1247-1256 (2014).
  9. Willems, P. H. G. M., Rossignol, R., Dieteren, C. E. J., Murphy, M. P., Koopman, W. J. H. Redox Homeostasis and Mitochondrial Dynamics. Cell Metab. 22 (2), 207-218 (2015).
  10. Koopman, W. J. H., et al. Human NADH:ubiquinone oxidoreductase deficiency: radical changes in mitochondrial morphology?. Am J Physiol Cell Physiol. 293 (1), C22-C29 (2007).
  11. Archer, S. L. Mitochondrial dynamics--mitochondrial fission and fusion in human diseases. N Engl J Med. 369 (23), 2236-2251 (2013).
  12. Rambold, A. S., Kostelecky, B., Elia, N., Lippincott-Schwartz, J. Tubular network formation protects mitochondria from autophagosomal degradation during nutrient starvation. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (25), 10190-10195 (2011).
  13. Koopman, W. J. H., et al. Simultaneous quantification of oxidative stress and cell spreading using 5-(and-6)-chloromethyl-2 ",7 -"dichlorofluorescein. Cytometry A. 69A (12), 1184-1192 (2006).
  14. Iannetti, E. F., Smeitink, J. A. M., Beyrath, J., Willems, P. H. G. M., Koopman, W. J. H. Multiplexed high-content analysis of mitochondrial morphofunction using live-cell microscopy. Nat Protoc. 11 (9), 1693-1710 (2016).
  15. Sieprath, T., et al. Sustained accumulation of prelamin A and depletion of lamin A/C both cause oxidative stress and mitochondrial dysfunction but induce different cell fates. Nucleus. 6 (3), 236-246 (2015).
  16. Zuiderveld, K. Contrast limited adaptive histogram equalization. Graphics gems IV. , 474-485 (1994).
  17. Chang, W., Cheng, J., Allaire, J. J., Xie, Y., McPherson, J. . shiny: Web Application Framework for R. R package version 0.14.2. , (2017).
  18. Konietschke, F., Placzek, M., Schaarschmidt, F., Hothorn, L. A. nparcomp: An R Software Package for Nonparametric Multiple Comparisons and Simultaneous Confidence Intervals. J Stat Softw. 64 (9), 1-17 (2015).
  19. Estaquier, J., et al. Effects of antiretroviral drugs on human immunodeficiency virus type 1-induced CD4(+) T-cell death. J Virol. 76 (12), 5966-5973 (2002).
  20. Matarrese, P., et al. Mitochondrial membrane hyperpolarization hijacks activated T lymphocytes toward the apoptotic-prone phenotype: homeostatic mechanisms of HIV protease inhibitors. J Immunol. 170 (12), 6006-6015 (2003).
  21. Roumier, T., et al. HIV-1 protease inhibitors and cytomegalovirus vMIA induce mitochondrial fragmentation without triggering apoptosis. Cell Death Differ. 13 (2), 348-351 (2006).
  22. Chandra, S., Mondal, D., Agrawal, K. C. HIV-1 protease inhibitor induced oxidative stress suppresses glucose stimulated insulin release: protection with thymoquinone. Exp Biol Med (Maywood). 234 (4), 442-453 (2009).
  23. Touzet, O., Philips, A. Resveratrol protects against protease inhibitor-induced reactive oxygen species production, reticulum stress and lipid raft perturbation. AIDS. 24 (10), 1437-1447 (2010).
  24. Bociąga-Jasik, M., et al. Metabolic effects of the HIV protease inhibitor--saquinavir in differentiating human preadipocytes. Pharmacol Rep. 65 (4), 937-950 (2013).
  25. Xiang, T., Du, L., Pham, P., Zhu, B., Jiang, S. Nelfinavir, an HIV protease inhibitor, induces apoptosis and cell cycle arrest in human cervical cancer cells via the ROS-dependent mitochondrial pathway. Cancer Lett. 364 (1), 79-88 (2015).
  26. Blanchet, L., Smeitink, J. A. M., et al. Quantifying small molecule phenotypic effects using mitochondrial morpho-functional fingerprinting and machine learning. Sci. Rep. 5, 8035 (2015).
  27. . Reactive Oxygen Species (ROS) Detection Reagents Available from: https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/mp36103.pdf (2006)
  28. Koh, C. M. Preparation of cells for microscopy using cytospin. Methods Enzymol. 533, 235-240 (2013).
  29. Mihara, K., Nakayama, T., Saitoh, H. A Convenient Technique to Fix Suspension Cells on a Coverslip for Microscopy. Curr Protoc Cell Biol. 68, 4.30.1-4.30.10 (2015).
  30. Deutsch, M., Deutsch, A., et al. A novel miniature cell retainer for correlative high-content analysis of individual untethered non-adherent cells. Lab Chip. 6 (8), 995-996 (2006).
  31. Price, H. P., MacLean, L., Marrison, J., O'Toole, P. J., Smith, D. F. Validation of a new method for immobilising kinetoplastid parasites for live cell imaging. Mol Biochem Parasitol. 169 (1), 66-69 (2010).
  32. Sabati, T., Galmidi, B. S., Korngreen, A., Zurgil, N., Deutsch, M. Real-time monitoring of changes in plasma membrane potential via imaging of fluorescence resonance energy transfer at individual cell resolution in suspension. JBO. 18 (12), (2013).
  33. Fercher, A., O'Riordan, T. C., Zhdanov, A. V., Dmitriev, R. I., Papkovsky, D. B. Imaging of cellular oxygen and analysis of metabolic responses of mammalian cells. Meth Mol Biol. 591 (Chapter 16), 257-273 (2010).
  34. Graf, R., Rietdorf, J., Zimmermann, T. Live cell spinning disk microscopy. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 95 (Chapter 3), 57-75 (2005).
  35. Gao, L., Shao, L., Chen, B. C., Betzig, E. 3D live fluorescence imaging of cellular dynamics using Bessel beam plane illumination microscopy. Nat. Protoc. 9 (5), 1083-1101 (2014).
  36. Meijer, M., Hendriks, H. S., Heusinkveld, H. J., Langeveld, W. T., Westerink, R. H. S. Comparison of plate reader-based methods with fluorescence microscopy for measurements of intracellular calcium levels for the assessment of in vitro neurotoxicity. Neurotoxicology. 45, 31-37 (2014).
  37. Bushway, P. J., Mercola, M., Price, J. H. A comparative analysis of standard microtiter plate reading versus imaging in cellular assays. Assay and drug development technologies. 6 (4), 557-567 (2008).
  38. Black, C. B., Duensing, T. D., Trinkle, L. S., Dunlay, R. T. Cell-Based Screening Using High-Throughput Flow Cytometry. Assay Drug Dev Technol. 9 (1), 13-20 (2011).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

123

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены