고감도 현미경을 이용한 세포 산화 환원 프로파일 링

요약

이 논문은 세포 내 ROS 수준과 미토콘드리아 막 전위와 형태학을 동시에 정량화하기위한 고 - 내용 현미경 검사 워크 플로우를 제시한다. 세포 투과성 형광 리포터 분자 5- (and- 6) - 클로로 메틸 -2 ', 7'- 디클로로 디 히드로 플루 오렌 시스 디 아세테이트, 아세틸 에스테르 (CM-H ₂ DCFDA) 및 테트라 메틸 로다 민 메틸 에스테르 (TMRM)

초록

활성 산소 종 (ROS)은 유전자 발현, 이동, 분화 및 증식을 포함한 필수 세포 과정을 조절합니다. 그러나 과도한 ROS 수준은 DNA, 지질 및 단백질에 대한 비가 역적 산화 손상을 수반하는 산화 스트레스 상태를 유도합니다. 따라서, ROS의 정량화는 세포 건강 상태에 대한 직접적인 프록시를 제공한다. 미토콘드리아가 ROS의 중요한 세포 원 및 표적이기 때문에 같은 세포에서 미토콘드리아 기능과 ROS 생산의 공동 분석은 병리 생리 학적 조건에서 상호 연결을 더 잘 이해하는 데 중요합니다. 따라서, 세포 내 ROS 수준, 미토콘드리아 막 잠재력 (ΔΨ _m ) 및 미토콘드리아 형태학의 동시 정량화를위한 ​​고 함량 현미경 기반 전략이 개발되었습니다. 그것은 다중 웰 플레이트에서 성장한 살아있는 부착 세포의 자동화 된 광역 형광 현미경 및 이미지 분석에 기반을두고 있습니다.세포 - 투과성 형광 리포터 분자 CM-H2 DCFDA (ROS) 및 TMRM (ΔΨm 및 미토콘드리아 형태학)을 사용하여 d를 측정 하였다. 형광 측정 또는 유동 세포 계측법과는 달리,이 전략은 실험 자극 전후 모두 높은 시공간 해상도를 갖는 개별 세포 수준에서 세포 매개 변수를 정량화 할 수 있습니다. 중요하게도,이 방법의 이미지 기반 성질은 신호 강도 이외에 형태 론적 파라미터를 추출 할 수있게한다. 결합 된 기능 세트는 하위 집단, 세포 유형 및 / 또는 치료법 간의 차이를 탐지하기위한 탐색 및 통계 다변량 데이터 분석에 사용됩니다. 여기에, 화학 섭동 후 세포 상태 사이의 모호하지 않은 차별을위한 잠재력을 증명하는 실험 예와 함께 분석에 대한 자세한 설명이 제공됩니다.

서문

세포 내 ROS의 농도는 ROS 생성 시스템과 ROS를 제거하는 시스템 사이의 동적 상호 작용을 통해 세 심하게 조절됩니다. 이 둘의 불균형은 산화 스트레스 상태를 일으킨다. ROS의 주요 원인 중 하나는 미토콘드리아이다. 세포 호흡에서의 역할을 감안할 때, 그들은 세포 내 superoxide (O ₂ ^{• -} ) 분자의 대부분을 담당합니다 ² . 이것은 주로 강한 마이너스 내부 미토콘드리아 막 잠재력 (Δψ _m ), 즉 미토콘드리아 과분극 조건 하에서 전자 전달 사슬의 복합체 1에서 O ₂ 로의 전자 누출에 기인한다. 반면에 mitochondrial depolarization은 ROS 생성 증가와 상호 작용하여 여러 형태의 작용 ^{3 , 4 , 5 ,}> 6 ^{, 7 , 8} . 또한 핵분열 - 핵융합 기계 단백질의 산화 환원 변형을 통해 ROS는 미토콘드리아 형태를 공동 조절한다. 예를 들어, 단편화는 ROS 생성 및 세포 사멸 증가와 관련이있다 ^{10 , 11} , 섬유 성 미토콘드리아는 영양 기아와 보호 mitophagy ¹² . 세포 ROS와 미토콘드리아 morphofunction 사이의 복잡한 관계를 감안할 때, 둘 다 살아있는 세포에서 동시에 정량화되어야합니다. 정확하게 이것을 수행하기 위해, 형광 프로브 CM-H ₂ DCFDA (ROS) 및 TMRM (미토콘드리아 Δψm 및 형태학)으로 염색 된 부착 세포 배양 물의 자동화 된 와이드 필드 현미경 및 이미지 분석에 기초하여 고 - 컨텐츠 이미징 분석법을 개발 하였다. 고 - 컨텐츠 이미징은 sp다중 보완 마커 및 자동화 된 이미지 분석을 사용하여 세포 phenotypes에 대해 atiotemporally 풍부한 ( 즉 , 많은 설명 기능) 정보. 자동화 된 현미경 검사와 결합하면 많은 샘플을 병렬로 ( 즉 높은 처리량) 스크리닝 할 수 있으므로 분석의 통계 능력이 향상됩니다. 사실, 프로토콜의 주요 자산은 같은 세포에서 여러 매개 변수의 동시 부량을 허용하고, 이것은 많은 세포 및 조건에서 가능하다는 것입니다.

프로토콜은 8 부분으로 나누어 져 있습니다 (아래의 프로토콜에 자세히 설명되어 있습니다) : 1) 96- 웰 플레이트에서 세포를 시드; 2) 원액, 작업 용액 및 영상 버퍼의 준비; 3) 현미경 셋업; 4) CM-H ₂ DCFDA 및 TMRM으로 세포를 로딩하는 단계; 5) 기본 ROS 수준과 미토콘드리아 morphofunction을 측정하는 최초의 라이브 영상 라운드; 6) tert- 부틸의 첨가 후 둥근 두번째 이미지 생성유도 된 ROS 수준을 측정하기위한 과산화수소 (TBHP); 7) 자동화 된 이미지 분석; 8) 데이터 분석, 품질 관리 및 시각화.

이 분석법은 원래 정상적인 사람 피부 섬유 아세포 (NHDF)를 위해 개발되었습니다. 이러한 세포는 크고 평평하기 때문에 2D 와이드 이미지 ^{13 , 14} 에서 미토콘드리아 형태학을 평가하는 데 적합합니다. 그러나 사소한 수정으로이 방법은 다른 접착 세포 유형에도 적용 할 수 있습니다. 또한, CM-H ₂ DCFDA와 TMRM의 조합 옆에 워크 플로우는 다른 분자 특이성 ^{1 , 15} 의 다양한 형광 염료 쌍을 준수합니다.

프로토콜

아래의 프로토콜은 NHDF 세포와 재료 파일에 명시된 멀티 웰 플레이트를 사용하여 수행되는 것으로 설명됩니다. 워크 플로의 일반적인 개요는 그림 1 을 참조하십시오.

1. 시약의 준비

1. 10 % v / v 태아 소 혈청 (FBS)과 100 IU / ML 페니실린과 100 IU / ML 스트렙토 마이신 (PS)와 Dulbecco의 수정 독수리 매체 (DMEM) 보충하여 완벽한 매체를 준비합니다. 500 mL의 완전한 배지에 44 mL의 DMEM에 50 mL의 FBS와 5 mL의 PS를 첨가한다.
2. 20 MM HEPES와 행크의 균형 소금 솔루션 (마그네슘과 칼슘,하지만 페놀 레드없이) 보완하여 HBSS - HEPES (HH) 이미징 버퍼를 준비합니다. HH 500 mL에 1M HEPES 스톡 용액 10 mL를 HBSS 490 mL에 넣는다. pH를 확인하고, 필요하다면 pH 7.2로 맞추십시오.
3. CM - H ₂ DCFDA 동결 건조 분말 50 μg을 86.5 ℃에서 녹여 1 mM CM - H ₂ DCFDA 저장 용액을 준비한다.# 181; L 무수 DMSO. vortexing 또는 위아래로 pipetting하여 혼합하고 갈색 microcentrifuge 튜브에 20 μL aliquots을 확인하십시오. -20 ° C의 어두운 곳에 보관하고 1 주 이내에 사용하십시오. N _{2 -} 분위기하에 보관하면 유효 기간은 최소 1 개월까지 연장 할 수 있습니다.
   1. 50 ML 무수 DMSO에 25 MG TMRM 분말을 해산하여 1 MM TMRM 주식 솔루션을 준비합니다. vortexing 또는 위아래로 pipetting하여 혼합하고 갈색 microcentrifuge 튜브에 10 μL aliquots을 확인하십시오. -20 ° C에서 보관하십시오. 이 솔루션은 최소 1 년 동안 안정적입니다.
4. 70 % 원액 (10 μL / 96-well plate)의 부피를 직접 pipetting하여 모든 실험에 대해 Tert-butyl peroxide (TBHP) 스톡 (~ 7 M)의 신선한 분액을 준비하십시오. 추후 사용까지 4 ° C에서이 분취 량을 유지하십시오.
5. 2 차 항체 (Alexa Fluor 488 당나귀 항 토끼 및 CY3 당나귀 항 토끼)를 1 배 HH-bu로 1000 배 희석하여 항체 작업 용액 (AB)을 준비하십시오ffer.

2. 현미경 및 수집 프로토콜 설정 (± 15 분)

참고 : 이미지 수집은 자동화 된 스테이지 및 셔터가 장착 된 와이드 필드 현미경 및 20X 공기 평면 보정 대물 렌즈 (NA = 0.75) 및 EM-CCD 카메라를 사용하는 하드웨어 기반 자동 초점 시스템으로 수행됩니다. 처음으로 분석을 설정하는 경우 프로토콜 지침에 따라 염색 된 대조군 세포가 들어있는 시험판을 사용하여 XY 스테이지를 보정하고 수집 설정을 최적화합니다. 획득 설정이 이미 결정된 경우 빈 플레이트를 사용하여 보정을 수행 할 수 있습니다.

1. 대물 렌즈를 절대베이스 레벨로 낮추고 소프트웨어 지침에 따라 XY 스테이지를 보정하십시오.
2. 올바른 필터 큐브가 설치되어 있는지 확인하십시오. CM-H ₂ DCFDA를 가시화하려면 472/30 nm 여기 밴드 패스 필터, 495 nm cutoff dichro와 함께 표준 GFP 필터 큐브를 사용하십시오ic 미러 및 520/35 nm 밴드 패스 방출 필터가 있습니다. TMRM의 경우, 540/25 nm 밴드 패스 여기 필터, 565 nm 컷오프 다이크로 익 미러 및 605/55 nm 밴드 패스 방출 필터가있는 TRITC 용 필터 큐브를 사용하십시오.
3. 수집 소프트웨어를 사용하여 이미징 프로토콜을 만듭니다.
   1. 소프트웨어 내에 제공된 사용 가능한 플레이트 목록에서 올바른 종류의 멀티 웰 플레이트 (제조업체 및 코드)를 선택하십시오. 또는 플레이트와 웰 치수를 사용하여 자신의 멀티 웰 플레이트 형식을 정의하십시오.
   2. 소프트웨어의 지시에 따라, 예 를 들어 4 개의 외부 코너 웰의 두 모서리를 정의하여 웰 플레이트를 정렬합니다. 이 단계는 카메라 방향 변화에 적용됩니다.
   3. 획득해야 할 우물을 선택하십시오. 이 옵션을 소프트웨어에서 사용할 수없는 경우 선택한 웰에 해당하는 수동으로 정의 된 XY 위치 집합을 사용하십시오.
   4. th에 대한 획득 설정 (노출 시간, 램프 강도, EM- 게인) 최적화2 개의 채널을 테스트 플레이트를 사용하여 따로 따로 설치하십시오. 형광 여기 광 자체가 ROS를 유도하므로 노출과 강도를 최소화하십시오. 그러나 TBHP 치료 전에 신호 대비 배경 신호 비율이 기저 CM-H ₂ DCFDA가 ₂ 이상, TMRM이 3 이상이어야하며 TBHP 치료 후 포화도가 없음을 확인하십시오. 취득 설정은 현미경 설정 및 사용 된 세포 유형에 크게 달려 있지만 참조 용으로 130W의 금속 할로겐 전구를 광원으로 사용하고 지시서에 따라 염색 된 NHDF 세포를 사용할 때의 표시 설정은 다음과 같습니다. CM- H ₂ DCFDA 및 TMRM의 노출 시간은 200ms이고 ND 필터 8은 각각 15 (13MHz, 14 비트) 및 4 (27MHz, 14 비트)의 EM 게인과 함께 사용됩니다. 특정 설정 및 셀 유형에 맞게 최적화되면이 단계를 건너 뛸 수 있습니다.
      참고 : 획득 설정을 전체 이미징 프로세스에서 동일하게 유지하는 것이 중요합니다. 대규모의 여러 날 실험의 경우, 램프 스태정기적 인 품질 관리로 신뢰성을 보장해야합니다.
   5. 순차적 람다 (파장) 수집으로 구성된 수집 프로토콜을 정의하십시오. 측정 전에 빛의 노출을 최소화하기 위해 먼저 수집 할 CM-H ₂ DCFDA 채널을 선택하십시오.
   6. 웰 플레이트 루프를 정의하여 2.3.4에 정의 된 획득 프로토콜을 사용하여 웰 선택의 각 웰 중앙에 배치 된 규칙적으로 간격을 둔 비 중첩 이미지 4 개를 획득합니다. 사방 팔방으로 이미지 수집을 선택하십시오 ( 예 : 왼쪽에서 오른쪽으로, 잘 B02에서 B11까지, 다시 오른쪽에서 왼쪽으로, 웰 C11에서 C02까지) ( 그림 2A ). 이렇게하면 왼쪽에서 오른쪽으로 이미지를 가져 오는 것보다 시간이 절약됩니다. 이 옵션을 소프트웨어에서 사용할 수없는 경우 2.3.3에서 생성 된 XY 위치의 사용자 정의 세트를 조정하여이 이미징 패턴을 적용하십시오.
   7. 이미징 위치 ( 예 : 별도의 XML 파일)의 XY 좌표를 저장하여 쉽게 재구성 가능현미경 재 보정의 경우. 이 분석의 판독 값이 동일한 세포에 대한 post-hoc immunofluorescence (IF) 염색과 관련이 있어야하는 경우 특히 중요합니다.

3 . 96- 웰 플레이트에서 세포를 시드 (45 ~ 90 분, 상이한 세포주의 수에 따라)

1. 2 등급 바이오 안전성 캐비닛과 같은 무균 환경에서 작업하고 장갑을 착용하십시오.
2. 증류수에서 70 % v / v 에탄올을 사용하여 모든 표면과 물질을 오염 제거하십시오.
3. 배양기에서 90 % 컨 플루 언트 세포 배양액으로 세포 배양 플라스크를 가져 와서 바이오 안전성 캐비닛에 넣으십시오.
4. PBS 1x로 세포를 두 번 씻으십시오.
5. 완전한 세포 표면 ( 예 : T25 flasks 1 ML) 덮여 있는지 확인하고, 세포에 0.05 % 트립신 - EDTA 솔루션의 적절한 금액을 추가하고 37 ° C와 5 % CO ₂ 2 분 품어.
6. 모든 세포가 분리되면 (현미경으로 확인하십시오 ), 배양 배지 (DMEM + 10 % FBS + 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신; T25 플라스크에서 ± 4 mL)를 첨가하여 트립신 -EDTA 용액을 불 활성화시킨다.
7. 상온에서 300 X에서 5 분 동안 원심 분리기.
8. 뜨는을 버리고 문화 매체에 세포 펠렛을 resuspend. 세포 계수와 호환되는 세포 농도를 얻기 위해 모든 세포 유형에 대한 매체의 양을 결정하십시오. 일반적으로, NHDF의 90 % 합류 T25 플라스크는 약 1-1,500,000 개의 세포를 함유하며, 이는 3-4 mL의 배양 배지에 재현 탁된다.
9. 셀 계수 챔버 또는 Coulter 카운터를 사용하여 셀을 계산합니다.
10. 얇은 연속 폴리스티렌이나 유리 바닥이있는 흑색 96- 웰 플레이트의 안쪽 60 개 웰 각각에 8,000-10,000 개의 세포를 시드하십시오 (블랙은 이미징 중에 인접 웰 사이의 산란 및 크로스 토크를 피하기 위해). 다른 조건 / 치료법 / 세포주를 사용할 때는 플레이트 효과를 최소화하기 위해 플레이트에 균질하게 시드 위치를 분배하십시오 (그림 "> 그림 2A). 우물 B01과 A01을 제외한 외측 우물은 가장자리 효과가 더 잘 발생하기 때문에 사용되지 않습니다.
11. B01에 8,000-10,000 개의 세포가 뿌려진다. 이 우물은 이미지 획득 직전의 초점 조정에 사용됩니다.
12. 우물과 환경 사이의 기울기 (온도, 습도 등 )를 최소화하기 위해 빈 외부 우물을 매질로 채 웁니다.
13. 천천히 판을 세 번 두드려 인큐베이터에 다시 넣고 세포가 번식하지 않도록하십시오.
14. 세포를 24 시간 동안 배양하거나, 합류 정도까지 배양한다. 70 %.
15. 실험을위한 치료 정보를 "Setup.xlsx"라는 스프레드 시트에 저장하십시오. 파일에는 4 개의 열이 있어야하며 데이터 분석 중에 우물 및 이미지 정보와 함께 처리를 연결하는 데 사용됩니다. 네 개의 열은 'Well', 'Treatmentnumber', 'Treatment'및 'Control'(우물당 한 행)입니다. 모든 치료가 결합 됨데이터 처리 중에 플롯의 X 축에서 처리 순서를 결정하는 데 사용되는 고유 한 처리 번호가 있습니다. control-column은 현재 행에 대한 처리를위한 제어로서 기능하는 처리를 지정합니다. 일반적인 실험 레이아웃 및 해당 설정 파일의 그림은 그림 2 에 나와 있습니다.

4. CM - H ₂ DCFDA 및 TMRM (± 45 분)과 세포의 로딩

참고 : 실험 당일 세포의 취급은 멸균 환경 (biosafety cabinet)에서 수행 할 수 있지만 분석 후 세포를 폐기하거나 직접 고정하기 때문에 의무 사항은 아닙니다.

1. HH 완충액을 37 ° C로 가열한다.
2. 1 MM 주식 용액을 HH 버퍼 50 회 희석하여 20 μM TMRM 작업 솔루션을 준비하십시오 (10 μL TMRM 스톡 솔루션의 1 나누기에 490 μL의 HH 버퍼를 추가하십시오).
3. 부하 준비2 μM CM-H ₂ DCFDA 및 100 nM TMRM을 함유 한 용액으로 처리 하였다. 이를 위해 1mM CM - H ₂ DCFDA 주식 솔루션 500x와 HH - 버퍼의 20 μm의 TMRM 작업 솔루션 200 배 희석.
   1. 일반적으로, 60 개의 웰을 위해, HH 7447.5 μL에 CM-H ₂ DCFDA 15 μL와 TMRM 용액 37.5 μL를 첨가하여 7.5 mL의 로딩 용액을 준비한다.
4. 접시를 거꾸로 한 번 유체 운동으로 세포에서 배양 매체를 폐기하십시오.
5. 부드럽게 다중 채널 피펫 (100 μL / 잘)을 사용하여 HH 버퍼로 세포를 두 번 씻으십시오. 한 번의 유체 움직임으로 플레이트를 뒤집어서 세척 단계 사이에 HH 완충액을 버립니다.
6. 다시 멀티 채널 피펫을 사용하여 각 잘로드 솔루션의 100 μL를 추가하여 CM - H ₂ DCFDA와 TMRM로 세포를로드합니다. 실온에서 어둠 속에서 25 분 동안 품어 낸다. B01을 잘 잊지 마십시오.
7. 이 25 분 동안 산화제 TBHP의 작업 용액을 준비하고 현미경 및 부속품 하드웨어가 켜져 있는지 확인하십시오.
   1. 작업 솔루션 I 준비 : 7M 스톡 용액을 70 x 100 mM 희석하십시오 (690 μL HH 완충액 10 μL).
   2. 작업 솔루션 II 준비 : WS 1을 100x로 희석하십시오 (10 μL WS I, 990 μL HH 완충액).
   3. 작업 솔루션 III 준비 : WS III 25x를 40 μM으로 희석하십시오 (60 웰에는 7200 μL HH 버퍼에 300 μL WS II가 추가됨).
8. 25 분 후, 전에 설명한대로 100 μL HH 버퍼로 두 번 세포를 씻으십시오.
9. 모든 60 내부 웰에 HH 버퍼 100 μL를 추가합니다.

5. 기본 ROS 수준과 미토콘드리아 몰포 기능 (± 15 분)을 측정하기위한 최초의 라이브 영상

1. 수집 소프트웨어가 작동하고 이미징 프로토콜이로드되었는지 확인하십시오.
2. 현미경에 플레이트를 설치하고, 하드웨어 ba를 켜십시오.sed 자동 초점 시스템을 사용하고 B01을 사용하여 TMRM 채널을 사용하여 자동 초점 오프셋을 조정합니다. 이 절차는 CM - H ₂ DCFDA 신호 강도의 증가를 유도하므로,이 우물은 하류 이미지 분석에서 제외됩니다.
3. 이미징 프로토콜을 실행하십시오.

6. 유도 된 ROS 수준을 측정하기 위해 TBHP를 추가 한 후 2 번째 라이브 영상 (± 20 분)

1. 조심스럽게 현미경에서 96 - 웰 플레이트를 제거합니다.
2. 다중 채널 피펫을 사용하여 각 우물에 TBHP WS III (40 μM) 100 μL를 추가합니다 (우물에서 20 μM TBHP 농도 결과). 이 화합물은 유도 된 ROS 수준을 측정하는 수단뿐만 아니라 CM-H ₂ DCFDA 염색 (신호가 상승해야 함)에 대한 내부 양성 대조군으로 사용됩니다.
   참고 : H ₂ O ₂ 는 TBHP 대신 사용할 수도 있지만이 화합물은 안정성이 낮아 안정성이 낮습니다.
3. TBHP w의 완전한 반응을 허용하기 위해 적어도 3 분을 기다린다.i CM-H ₂ DCFDA.
4. 이 시간 동안 잘 A01에 100 μL 항체 작동 용액 (1 / 1,000)을 첨가하십시오.
5. 현미경에 플레이트를 다시 마운트하고 잘 B01을 사용하여 다시 초점을 확인하십시오.
6. 동일한 이미징 프로토콜을 사용하여 첫 번째 이미징 라운드에서와 같은 위치를 획득하십시오.
7. 수집 된 데이터 세트를 단일 폴더에서 개별 tiff 파일로 내보내고 플레이트 참조, TBH 이전 또는 이후 처리, 우물, 필드 및 채널을 밑줄로 구분하여 표준화 된 명명법을 사용하십시오. 이 정보는 이미지 분석 ( 예 : 적절한 세분화 설정 선택)과 데이터 분석 (분석 데이터 연결)에 사용됩니다.이 정보는 플레이트 1, 예비 TBHP 처리, 웰 B02, 필드 1 및 채널 1에 대한 'P01_Pre_B02_0001_C1' 올바른 치료법과 함께).
8. 수집 프로토콜을 사용하여 웰 A01의 중심 주위의 4 개 위치 모두에서 두 채널에 대한 플랫 필드 이미지를 수집합니다. th를 저장하십시오.다음과 같은 표준화 된 명명법을 사용하여 다른 이미지와 동일한 폴더에서 개별 TIFF 파일로 저장하십시오 : 플레이트 1, 필드 1 및 채널 1에 대해 'P01_FF_A01_0001_C1': 신호가 동적 범위 내에 있는지 확인하십시오. 포화의 경우,보다 낮은 농도의 항체 작동 용액을 사용하십시오.
9. 접시를 버리거나 추가 가공을 위해 저장하십시오.
   참고 : 현미경에서 플레이트를 제거하고 멀티 채널 피펫을 사용하여 TBHP 솔루션을 추가하는 대신 자동 피펫을 현미경 스테이지에 설치하고 트리거를 수신 할 때 작동하도록 획득 소프트웨어에 연결할 수 있습니다. 이렇게하면 첫 번째 획득 직후에 모든 우물에 TBHP를 추가 한 다음 다음 우물로 이동하기 전에 TBHP를 추가 할 수 있습니다. 이 방법으로, 첫 번째 이미징 라운드가 끝나면 두 번째 이미징을 시작할 수 있으며 모든 우물은 TBHP와 동일한 잠복 시간을 갖게됩니다.

7. 이미지 처리 및 분석 (± 30 분당96- 웰 플레이트)

참고 : 모든 이미지 처리는 ImageJ 프리웨어의 패키지 버전 인 FIJI (http://fiji.sc)에서 수행됩니다. 전용 스크립트는 세포 내 ROS 및 미토콘드리아 신호의 자동화 된 분석 및 형태 학적 파라미터 (RedoxMetrics.ijm, 요청시 이용 가능)를 위해 작성되었습니다. 기본적인 알고리즘은 Sieprath et al. ¹ .

1. FIJI가 설치되어 작동하는지 확인하십시오.
2. FIJI를 시작하고 매크로 세트 (플러그인 -> 매크로 -> 설치 ...)를 설치하십시오. 그러면 그림 3A 와 같이 분석 설정을 최적화하기위한 일련의 작업 도구뿐만 아니라 여러 가지 새로운 매크로 명령이 호출됩니다.
3. 설정 인터페이스를 열어 'S'버튼 ( 그림 3B )을 클릭하여 분석 설정을 설정하십시오.
   1. 이미지 유형, 채널 수 및 사용 된 웰을 선택하십시오.flatfield 이미지를 얻기위한 것입니다.
   2. 어떤 채널에 세포 (CM-H ₂ DCFDA 채널) 또는 미토콘드리아 (TMRM 채널)가 있는지 표시하고 이미지 품질에 따라 각 채널의 전처리 및 세분화 매개 변수를 조정하십시오 ( 그림 3B ). 'Background'및 'Contrast'확인란을 선택하면 배경 빼기 또는 대비가 제한된 적응 형 히스토그램 평준화 ¹⁶ 을 각각 수행 할 수 있습니다. 세포의 가우시안 블러 링 및 미토콘드리아의 라플라시안 강화를위한 시그마를 정의하십시오. 자동 임계 알고리즘을 선택하고 크기 제외 한도 (픽셀 단위)를 입력하십시오. 자동 임계 알고리즘 대신 고정 된 임계 값을 선택한 경우 상위 임계 값을 채 웁니다.
   3. 획득 한 데이터 세트의 몇 가지 선택된 이미지에 대한 세그먼테이션 설정을 열고 셀 또는 미토콘드리아 세분화를위한 메뉴에서 'C'또는 'M'버튼을 클릭하여 각각을 열고,필요한 경우 설정을 조정하십시오. 예시적인 결과가 도 3c 에 도시된다.
4. '#'버튼을 클릭하고 이미지가있는 폴더를 선택하여 관심있는 폴더에서 배치 분석을 실행하십시오. 폴더 당 하나의 이미지 당 개별 ROI 세트 (zip 파일)와 결과 파일 (.txt)을 포함하는 새로운 '출력'디렉토리가 생성됩니다. 두 채널 모두 결과 파일에는 강도 및 형태 학적 설명자가 들어 있습니다. CM-H ₂ DCFDA 채널 (셀) 결과 파일에는 디스크립터마다 하나의 이미지 내에서 결합 된 ROI의 평균값이 들어 있습니다. TMRM 채널의 경우, 결과 파일에는 개별적으로 분류 된 모든 미토콘드리아 ROI 값이 디스크립터별로 포함됩니다.
5. 배치 분석 후 'V'버튼을 클릭하여 ROI 오버레이가있는 모든 이미지의 하이퍼 스택 인 '검증 스택'에서 세분화 성능을 시각적으로 확인하십시오. 이 방법으로,이미지에서 초점이 맞지 않는 이미지, 초점이 흐린 이미지 또는 먼지 입자 / 섬유가 이미 빠르게 발견 될 수 있습니다. 데이터 품질 관리 중에 더 많은 큐 레이션을 수행 할 수 있습니다 (§8).

8. 데이터 분석, 품질 관리 (QC) 및 시각화

원시 데이터의 처리 및 분석은 R 통계 프리웨어 (http://www.rproject.org - 버전 3.3.2) 및 RStudio (http://www.rstudio.com/ - 버전 1.0.44)를 사용하여 수행됩니다. 결과를 신속하게 얻고 시각화하기 위해 Heatmaps 및 boxplots에서 데이터를 통합하고 시각화하고 통계 분석을 수행하는 직관적 인 Shiny 응용 프로그램 ¹⁷ (요청시 사용 가능)이 구상되었습니다. 일반적으로 워크 플로우는 두 개의 연속 단계로 구성됩니다. 첫째, 96- 웰 플레이트 당 데이터를 처리하고 검사하여 이상 데이터 포인트를 검출합니다. 둘째, 주어진 실험의 모든 플레이트에서 큐 레이션 된 데이터를 결합하고 비 - 파라 메트릭 멀티variate tests ¹⁸ 및 주성분 분석.

1. R 및 RStudio가 설치되어 작동하는지 확인하십시오.
2. RStudio를 시작하십시오.
3. RedoxMetrics 반짝이 응용 프로그램을 열고 응용 프로그램을 실행하십시오 (외부 브라우저에서 실행되도록 선택).
4. '입력'페이지에서 RedoxMetrics.ijm의 결과 파일이있는 디렉토리를 선택하십시오.
5. 단계 3.15에서 만든 'Setup.xlsx'도이 디렉토리 내에 있는지 확인하십시오.
6. 결과 파일 및 설정 정보가 자동으로 가져와지고 재배치되고 시각화됩니다.
   1. '실험 설정'페이지는 실험 레이아웃을 보여줍니다. 확인을 위해이 페이지를 사용하십시오.
   2. 다음 페이지 '결과 당 플레이트'는 우물 이름과 이미지 번호로 라벨링 된 이상치가있는 상자 그림뿐만 아니라 색으로 구분 된 다중 우물 판 레이아웃에서 각 판의 데이터를 개별적으로 보여줍니다. 후자는 쉽게 검사하고 ident를 허용합니다.비정상적인 데이터 포인트 (해당 특정 치료법에 대해 측정 된 평균값과 비교하여 매우 높거나 낮은 값 - 예를 들어 그림 4 참조)의 발생.
      이 정보를 사용하여 이상한 지점에 해당하는 이미지를 확인하십시오. 이상이 발견되면 분석에서 제거해야합니다. 대부분의 이상은 이미지의 일부가 초점을 벗어나거나 형광 분진 입자가 적절한 분할을 방해 할 때 부적절한 분할로 인해 발생합니다. 극단적 인 사례는 이미 검증 스택 도구 (7.5 단계)를 사용하여 신속하게 발견 할 수 있지만이 단계에서는 더 미묘한 사건이 발견됩니다. 이상 값에 대해 명백하거나 기술적 인 이유가 발견되지 않으면 이미지를 분석에서 제거하면 안됩니다.
   3. 선택 사항 : 'Drop'이라는 하나의 열만있는 'Drop.xlsx'라는 스프레드 시트를 새로 만듭니다. 이 열에는 모든 이미지의 파일 이름 ( ".tif"확장자 포함)을 나열하십시오분석 (단계 7.5 또는 단계 8.6.2에서 식별)에서 제거해야합니다. '입력'페이지를 사용하여이 파일을 업로드하십시오.
   4. '결과 전체 실험'페이지는 모든 플레이트 조합 결과를 보여줍니다. 드롭 파일이 업로드되면이 파일을 사용하여 분석에서 지정된 데이터 요소를 제거합니다.
      각 매개 변수에 대해 개별적으로 데이터는 해당 컨트롤에 따라 플레이트 당 표준화됩니다. 그런 다음 모든 플레이트의 데이터를 결합한 다음 nparcomp 패키지 ¹⁸ 의 비 매개 변수 다 변수 테스트를 수행합니다. 2 개의 치료법 만 비교하면 비모수적인 Behrens-Fisher 문제에 대한 두 가지 샘플 테스트가 수행됩니다. 2 회 이상의 치료의 경우, 비 파라 메트릭 콘트라스트 기반 다중 비교 검사가 사용됩니다. 결과는 상자 그림을 사용하여 시각화됩니다.
   5. '클러스터 분석'페이지는 주성분 분석 (PCA-R 코어 '통계'패키지)의 결과를 보여줍니다. 5 개의 매개 변수 (ba염 및 유도 된 ROS, 미토콘드리아 막 잠재력, 크기 및 원형도)을 결합하여 민감한 산화 환원 프로파일에 따라 다른 처리법을 구별합니다. 이를 위해 PCA (Principal Component Analysis)가 수행됩니다 (R core 'stats'패키지). 결과는 biplot (ggbiplot 패키지 - http://github.com/vqv/ggbiplot)을 사용하여 시각화됩니다.
   6. '데이터 다운로드'페이지를 사용하여 처리 및 재 배열 된 데이터가 포함 된 백엔드 데이터 프레임을 다운로드하여 고급 데이터 시각화 또는 통계 분석에 다시 사용할 수 있습니다.
      참고 : 일반적인 함정과 잠재적 인 해결책은 표 1 에 나열되어 있습니다.

결과

분석은 여러 대조 실험을 사용하여 벤치마킹되었으며, 그 결과는 Sieprath et al. ¹ . 간단히 말하면, CM-H ₂ DCFDA 및 TMRM의 세포 내 ROS 및 Δψ _m의 외적으로 유도 된 변화에 대한 형광 응답을 각각 동적 범위를 결정하기 위해 정량화 하였다. CM-H ₂ DCFDA의 경우, NHDF는 10 μM에서 160 μM 범위의 TBHP 농도로 처리했을 때 형광 신호의 선형 ?...

토론

이 논문은 NHDF에서 세포 내 ROS 수준과 미토콘드리아 morphofunction의 동시 정량화를위한 ​​고 함량 현미경 검사법을 설명합니다. 그 성능은 SQV가 처리 된 NHDF에 대한 사례 연구를 통해 입증되었습니다. 그 결과는 별도의 실험 ^{19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24}

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Tetramethylrhodamine, Methyl Ester, Perchlorate (TMRM)	ThermoFisher Scientific	T668
CM-H2DCFDA (General Oxidative Stress Indicator)	ThermoFisher Scientific	C6827
Dimethyl sulfoxide	Sigma)Aldrich	D8418
MatriPlate 96-Well Glass Bottom MicroWell Plate 630 µL-Black 0.17 mm Low Glass Lidded	Brooks life science systems	MGB096-1-2-LG-L
HBSS w/o Phenol Red 500 mL	Lonza	BE10-527F
DMEM high glucose with L-glutamine	Lonza	BE12-604F
Phosphate Bufered Saline (PBS) w/o Ca and Mg	Lonza	BE17-516F
HEPES 1 M 500 mL	Lonza	17-737F
Trypsin-Versene (EDTA) Solution	Lonza	BE17-161E
Cy3 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson	711-166-152	Antibody used for acquiring flat-field image
Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson	711-546-152	Antibody used for acquiring flat-field image
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Nikon Ti eclipse widefield microscope	Nikon
Perfect Focus System (PFS)	Nikon		hardware-based autofocus system
CFI Plan Apo Lambda 20X objective	Nikon
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
NIS Elelements Advanced Research 4.5 with JOBS module	Nikon		This software is used to steer the microscope and program/perform the automatic image acquisition prototocol
ImageJ (FIJI) Version 2.0.0-rc-43/1.50g
RStudio Version 1.0.44	Rstudio
R version 3.3.2