JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол описывает необходимые шаги для получения результатов локализация внутриклеточных белков на сетчатке данио рерио, соотнося суперразрешением светлую микроскопию и сканирование электронной микроскопии изображений.

Аннотация

Мы представляем метод расследовать локализация внутриклеточных белков в сетчатке личиночной данио рерио, комбинируя суперразрешением светлую микроскопию и растровая электронная микроскопия. Суб дифракционный предел резолюции возможности суперразрешением света Микроскопы позволяют улучшение точности коррелированных данных. Вкратце 110 Нм толщиной крио секции передаются кремниевой пластины и, после окрашивания иммунофлюоресценции, отражаются с суперразрешением световой микроскопии. Впоследствии разделы сохраняются в метилцеллюлоза и платины, затененных до изображений в сканирующий электронный микроскоп (SEM). Изображения из этих двух способов микроскопии легко объединяются с помощью ткани достопримечательности с открытым исходным кодом. Здесь мы описываем метод адаптированы для личинок данио рерио сетчатки. Однако этот метод применяется также для других видов организмов и тканей. Мы демонстрируем, что дополнительную информацию, полученные от этой корреляции способен решить выражение митохондриальных протеинов в связи с мембраны и макул митохондрий, а также относительно других отсеков ячейки.

Введение

Методы определения субцеллюлярные Локализация белков и их связь с различных отсеков ячейки являются важнейшими инструментами для понимания их функции и возможности взаимодействия. Супер-резолюции микроскопии в сочетании с электронной микроскопии предоставляет такие сведения1. Микроскопия истощение земли государства следуют отдельные молекулы возвращение (GSDIM) представляет собой технологию микроскопии суперразрешением, совместим с широким спектром органических и генетически закодированный флуорофоров2 и достигает латеральное разрешение до 20 Нм 3. Включение методов с высоким разрешением, чем стандартные дифракционный микроскопии улучшает точность корреляции4,5,6. Рекомендуется для достижения наилучшего соотношения белков с конкретным субцеллюлярные отсека и уменьшить объем неопределенности7 использование того же раздела ультратонких для света и электронной микроскопии. Среди различных методов, резания Tokuyasu крио раздел протокол не требует обезвоживания или встраивание смолы и, Кроме того, сохраняет антигенностью многих эпитопов и обеспечивает хорошие ткани Ультраструктура8. Несколько методов продемонстрировали применимость этих разделов в коррелятивном света и электронной микроскопии (Клем)4,5,9,10.

Данио рерио сетчатки является полезной моделью для изучения визуальной разработки и механизмов болезней человека, учитывая его высоко сохраняется структура и функции различных позвоночных. В частности, сетчатки фоторецепторов отображения той же архитектуры как млекопитающих фоторецепторов, с базальной синапса, apico-basally удлиненные ядра, кластеризация митохондрий в сегменте более апикальной внутренний и наружный сегмент состоит из мембраны диски в наиболее апикальной позиция11. Локализация белков различных сотовых отделений, сохраняемой между данио рерио и человека, позволяя исследование биологической функции человека болезни соответствующих белков12,13.

Здесь мы представляем протокол подготовить личиночной данио рерио сетчатки образцы для устранения Локализация белков митохондриальных внешней мембраны Tom20 коррелятивных суперразрешением света и электронной микроскопии. Метод основан на сборе крио разделы на кремниевых пластин и получение контраст по топографической информации производится после нанесения тонкого слоя платины. Эти шаги являются четкие технические усовершенствования с точки зрения удобства использования, воспроизводимость и время выполнения экспериментов. Недавно мы продемонстрировали применимость метода для обнаружения ядерной поры и митохондриальных протеинов в мыши ткани14.

протокол

все эксперименты были проведены в соответствии с заявлением Арво для использования животных в глазной и видение исследования и были утверждены местными властями.

1. Подготовка ультратонких разделы на кремниевых пластин

фиксации образцов
    1. подготовить фиксирующие раствор, содержащий 0.1% глютаральдегид, 4% формальдегида в буфер cacodylate 0,1 М.
      Примечание: осторожно! Соблюдайте осторожность при работе с буфером глютаральдегид, формальдегид и cacodylate, носить надлежащие средства личной защиты и работают в зонта.
    2. Усыпить 5 дней после оплодотворения личинки данио рерио (5 dpf) с tricaine (этиловый метансульфонат 3-аминобензоат, 0,4% w/v в PBS (фосфат буфер солевой, рН 7)) как описано 15.
    3. Исправить личинки, погружение в предварительно охлажденные фиксирующие решения на льду. Удалите головы и инкубировать на ночь при 4 ° C с плавное покачивание.
    4. Вскрыть глаз путем обрезки ткани вокруг глаз с помощью тонкой щипцы и microdissection скальпель (под бинокль) охлажденные фиксирующие решения на пластине местная агарозы 1%. Передать трубку с свежими предварительно охлажденные фиксатором глаза.
    5. Мыть дважды в PBS (фосфат буфер солевой, рН 7,4) за 5 мин каждый мыть при комнатной температуре (RT).
  2. Желатин инфильтрации и монтажа
    1. теплой до 15 мл местные продукты бренда желатина 12% w/v в PB (фосфатного буфера, 0,1 М рН 7,4) на 40 ° C. Удалите PBS и добавить желатин решение в пробирки, содержащие глаз. Нажмите трубка мягко для обеспечения желатин инфильтраты образца и проинкубируйте 10-30 мин при 40 ° C в thermoblock с нежным встряхивания или на водяной бане.
    2. Заполнить 12 мм x 5 мм x 3 мм кремния или полиэтилена плоский встраивание формы с теплой желатин в водяной бане 40 ° C. Добавьте два глаза за плесень с помощью пипетки, выровнять их должным образом под бинокль с помощью иглы рассечение и пусть желатин остыть при комнатной температуре в течение 1 мин и затвердевают при 4 ° C на 20 мин
    3. Повторно отделка блок желатина под бинокль, чтобы соответствовать один глаз на блок с помощью лезвия бритвы.
    4. Передавать 2,3 М сахарозы в PB желатин встроенных глаза на льду. Инкубируйте на 4 ° C на ночь.
    5. Обмен новым 2,3 М раствора сахарозы и хранить при 4 ° С или 20 ° C; после этого шага, образцы готовы для разрезания или могут храниться при температуре-20 ° C в течение нескольких недель до месяцев.
    6. Повторно отделка блок желатина почти размер глаза перед передачей крио контактный. Замораживание в жидком азоте и передачи криоультрамикротом.
  3. Cryosectioning
    1. Вырезать 110 Нм толщиной секций при-120 ° C с алмазным ножом в криоультрамикротом.
    2. Выбрать разделы с проводной цикл, содержащий капельку метилцеллюлоза 2% (в воде) и 2,3 М раствора сахарозы (1:1). Перенести разделы кремниевой пластины 7 x 7 мм. Хранить разделы на 4 ° C до дальнейшей обработки.

2. Immunolabelling

  1. мыть пластин с PBS при 0 ° С 20 мин на четыре капли, поместив пластин вниз на капли. Мыть в PBS 2 x 2 мин при комнатной температуре.
    2. Глицин
  2. Инкубировать 3 раза в 0,15% в PBS, за 1 мин. Вымойте 3 x 1 мин/мыть с PBS. Предварительно incubate с PBG (PBS с BSA бычий сывороточный альбумин 0,5% и 0,2% желатина типа B) для 5 минут
  3. Инкубировать с кролик анти Tom20 (см. Таблицу материалов) в PBG (4 мкг/мл) за 30 мин при комнатной температуре.
  4. Мыть 6 x за 1 мин/мыть в PBG. Предварительно incubate с PBG на 5 мин на RT. инкубировать с анти кролик Alexa 647 F(ab') 2 (см. Таблицу материалов) в PBG (7.5 мкг/мл) за 30 мин
  5. Мыть 6 x за 1 мин/мыть в PBG. Вымойте 3 x 2 мин в PBS. Проинкубируйте с DAPI (4 мкг/мл) в PBS для 10 s. мыть 2 x 2 мин в PBS.

3. Супер-резолюции микроскопии

  1. инкубировать вафельные кратко (10 s), поместив ее на капли раствора 1:1 глицерина (80%) и визуализации буфера, содержащий кислорода, очистки системы (200 мм фосфатного буфера, содержащий 10% глюкозы, 0.5 мг/мл glucoseoxidase, 40 мкг/мл каталазы, 15 мм бета mercaptoethylamine гидрохлорид (MEA HCL), рН 8,0).
  2. Передача пластин (раздел вниз) Петри стекла (толщиной 170 ± 5 μm) снизу на свежие капли 1:1 смесь глицерина (80%) и визуализации буфера (как шаг 3.1).
  3. Удалить со всех сторон, с пипеткой, большая часть жидкости под пластины. Использование полосы силиконовые исправить пластины на нижней части Петри.
    Примечание: Силиконовые полосы сделаны из двухкомпонентный клей силиконовый (3 x 12 мм).
    4. Разделы
  4. изображения на инвертированного микроскопа с помощью высокая числовая апертура (например 160 X / NA 1,43; см. Таблицу материалов) масло погружения супер резолюции выделенный цели. До обработки изображений, позволяют сбалансировать Микроскоп температуры для того, чтобы свести к минимуму и уменьшить боковые и осевого смещения выборки.
  5. Центр области интересов и приобрести первые widefield эпифлуоресцентного ссылкой изображения. Изменить режим работы супер резолюции. Отрегулируйте время экспозиции камеры до 15 мс и установите электрон умножения (EM) получить максимум 300.
  6. Освещения образца с 642 Нм непрерывная волна лазера на мощность максимальная лазера (соответствующий ~2.8 кВт/см 2) в режиме эпифлуоресцентного. Как только одной молекулы мигает хорошо отделены в каждом кадре, так что вероятность низка, что отдельные сигналы пересекаются, установите мощность лазера до ~0.7 кВт/см 2. Запись изображений в формате raw в режиме эпифлуоресцентного путем приобретения минимум 30 000 кадров.
    Примечание: Все эти параметра может изменяться в зависимости от различных образцов и маркировки плотностями.
  7. От исходных данных, создать список событий реконструкции (локализации каждого одной молекулы скачок в raw изображений) с помощью обнаружения порога 30 фотонов (должен корректироваться по образцу), нажав " вычислить " в ' t серии анализ ' под ' инструменты '.
  8. Визуализировать изображения супер резолюции Гаусса фитинга 16 применения рендеринга пикселей размером 4 Нм, нажав " создать образ " в ' Группа обработки списка событий ' под ' инструменты. '
    Примечание: Для создания супер решена изображения интегрированные программные инструменты системы, используемые в данном исследовании были заняты. Однако, описанные супер резолюции изображений может быть выполнена на любой другой системе локализации на основе одной молекулы, и данные могут обрабатываться с открытым исходным кодом программного обеспечения инструменты как гроза 17.

4. Платиновый затенение

  1. удаления кремния полосы и добавить каплю PBS недалеко от края пластины поднять его вверх от Петри. Промойте пластины 2 x 2 мин в PBS, то пост исправить ее с 0.1% глютаральдегид в PBS для 5 минут промыть 2 x 2 мин/мыть в PBS.
  2. Инкубировать вафельные дважды за 5 мин/инкубации в 1 капле метилцеллюлоза 2% в воде на льду. Вставьте вафля в пластиковых пробирок и центрифуги на 14 100 x g для 90 s. горе его на заготовка SEM алюминия с проведением углерода цемента.
  3. Добавить слой от 2 до 10 Нм платины/углерода на образце, роторный затенение на 8° с помощью электрона луча параметры устройства испарения: 1.55 кв, 55 мА, 0,3 Нм/s и угол 8°, вращение уровень 4.

5. Сканирующая электронная микроскопия

  1. изображения секций с сканирование электрона мicroscope на 1,5 кв, 2 мм рабочих расстояние и с в объектив детектор средних электронов.

6. Выравнивание света и электронной микроскопии изображений

  1. Открыть обоих типов изображений с 18 Фиджи, нажав " файл | Открытые ". Отрегулируйте размер холста, нажав " изображение | Отрегулируйте | Размер холста " и принести оба изображения в стек, нажав " изображение | Стеки | Изображения в стек ". Сохранить как тип файла tiff стек.
  2. В Фиджи, откройте новый интерфейс TrackEM2 19, нажав " файл | новый | TrackEM2 (новый) ". Импорт стек с оба изображения, щелкнув правой кнопкой мыши на окне черный и выбрав " импорта стека ".
  3. Выравнивание свет микроскопия image для электронной микроскопии изображений вручную с ориентиров, с помощью щелчка правой кнопкой мыши на изображении и выбрав " выровнять | Выровнять слой вручную с достопримечательностями ".
    1. Выбрать выберите инструмент (черная стрелка) для добавления достопримечательностей. Используйте форму ядер как ссылку для выбора же края в обоих изображений (дополнительный рис. 1). Добавьте несколько пунктов (минимум три точки должны быть выбраны). Применить выравнивание с Аффинная модель правой мышью, нажав кнопку и выбрав " применить преобразование | Аффинная модель ".
  4. Изменить прозрачность слоя (см. дополнительный рис. 1), для оценки качества выравнивания.

Результаты

Выражение протеина Tom20, субъединицы ацилкарнитин митохондриальных внешней мембраны комплекс20, определяется, в шлифов личиночной данио рерио сетчатки, супер резолюции световой микроскопии (рис. 1) и эта информация была дополнена топографических сигнала, полученные путем сканирования электронной микроскопии после Платиновый затенение те же разделы. Эти корреляционные данные подтверждают локализация протеина в ассоциации с конкретного отсека, внешней митохондриальной мембраны и, также представить информацию о соотношении белка с другие органеллы клетки.

figure-results-733
Рисунок 1: Клем на сетчатке данио рерио. А. малое увеличение widefield образ раздела 5 dpf данио рерио сетчатки, ядер, окрашенных с DAPI (голубой). Б. сканирующая электронная микроскопия того же района. C. выше увеличение widefield изображение кадра в ядрах б. витражи с DAPI (голубой) и Tom20 митохондриальных пятнать отображается красным цветом. D. Widefield изображение же секции на увеличение. Шаблон Tom20 выражение находится в кластеры митохондрий. E. выражение из Tom20 (красные точки) определяется GSDIM микроскопии. Ядер окрашенных DAPI (голубой). F. же раздел как E объединение коррелятивных суперразрешением и растровая электронная микроскопия. Tom20 окрашивание (красные точки) появляется в митохондриальной кластера (M) в наружной мембраны митохондрий. Флуоресценции DAPI сигнала в ядрах (N) соответствует топографии SEM изображения. Г. высокое увеличение изображения кадра в F. Сканирования электронная микроскопия image предоставляет контекст для GSDIM изображения (красные точки). Митохондриальной макул ясно видны и Tom20 окрашивание локализован для наружной мембраны митохондрий. Мембраны внешнего сегмента фоторецепторов (OS) ясно разрешаются. Размер 5 пикселей изображения Нм. Масштаб бары: A, B и C: 10 мкм; D: 2 мкм; E и F: 1 мкм и G: 0,2 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Дополнительный рисунок 1: выравнивание изображения света и электронной микроскопии. A. скриншот из интерфейса TrackEM2 с изображением SEM и пронумерованных достопримечательности (желтый) вдоль различных ядер. Б. скриншот из интерфейса TrackEM2 с изображением флуоресценции и пронумерованных достопримечательности (желтый) вдоль различных DAPI окрашенных ядер. Чтобы изменить прозрачность слоя может использоваться ползунков на левой верхней части меню. Линейки: 1 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Обсуждение

Этот метод сочетает в себе супер решена белка локализации с сведения о контексте, чтобы определить точное положение белков в органеллы. Мы здесь продемонстрировать завершения эксперимента, чтобы визуализировать выражение Tom20 в наружной мембраны митохондрий, и ее связь с другими органеллы как ядра или внешних сегментов фоторецепторных в личиночной данио рерио сетчатки.

Tokuyasu крио резании требует определенной подготовки приобрести хорошо сохранившиеся разделы. Однако это метод, работающих во многих лабораториях с продемонстрировали успех21. Передача секций кремниевой пластины очень проста, и никаких особых действий предпринимать не требуется. Использование глицерина в буфере визуализации является весьма критический шаг, чтобы избежать высыхания секций. Для супер-резолюции изображений наилучшие результаты получаются при Вафля находится очень близко к стекло нижней части Петри. Полосы силиконовые помочь поддержание пластин в этом положении. Особое внимание должно быть принято при удалении полосы для того, чтобы избежать повреждения разделов.

Толщина крио секций, около 100 Нм, тоньше, чем оптическое разрешение в Z-измерение, дополнительно облегчает точность этого метода соотносится как суперразрешением микроскопии сигнал идет только от этого тонкого слоя и Сканирующий электронный микроскоп сигнал отображается топографии образца. Этот метод может также сочетаться с многоцветной изображений. Однако особое внимание необходимо принять что образец может быть imaged тех же условиях (например визуализации буфера) и кросс talk должны быть предотвращены.

Одним из недостатков метода является его двумерный подход, поскольку лишь ограниченное количество последовательных секций (около 3 до 7 в вафельных) могут быть собраны. Таким образом проекты, касающиеся анализа тома не будет идеальным. Однако это метод, который может быть применен для определения выражения протеина в любом типе ткани путем простой секционирование в образце. Мы предоставляем метод без использования агентов Классический контраст как уранила ацетат или свинца цитрата. Контраст, Платиновый затенение обеспечивает очень информативный топографических контраст, но в некоторых случаях мембраны трудно решить. Это может создать проблемы для проектов, которые, например, необходимо определить выражение белков в небольших пузырьков.

Наш протокол, основанный на Tokuyasu крио секции, использует стандартное оборудование для получения результатов коррелятивных суперразрешением и сканирующих электронных микроскопов. Простые шаги, чтобы обеспечить стабильность и воспроизводимость в подготовке образца коллекцию секций на кремниевых пластин и использование платины для контраста.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Финансирование Ион и RGB: Швейцарской национальной науки фонд Ambizione-Оценка Грант PZ00P3 142404/1 и PZ00P3 163979.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
ParaformaldehydeSigma-Aldrich#158127
Glutaraldehyde EM GradeEMS, USA#16220
CacodylateMerck#8.20670
TricaineSigma-Aldrich#886-86-2
Agarose, peqGOLD UniversalVWR International GmbH35-1020
Flat embedding moldsBEEM Flat
Local food brand gelatinDr.OetkerExtra Gold
SucroseMerck#1.07687
MethylcelluloseSigma#M-6385
GlycineSigma#G-7126
Gelatin type BSigma#G-6650
BSAApplichem#A6588.0050
Silicon waferSi-Mat Silicon MaterialsType: P/Boron; Orientation <111> ON; Growth method: CZ; Resistivity:1-30 ohm/cm; Surface: polished; Laser cut at 7 x7 mm
Cryo-pinBaltic Preparation#16701950
Wired loop "Perfect loop"
Silicone stripesPicodentTwinsil 22
GlucoseSigma-Aldrich#G8270
glucoseoxidaseSigma-Aldrich#G7141
catalaseSigma-Aldrich#C40
beta-Mercaptoethylamine hydrochlorideSigma-Aldrich#M6500
anti-Tom20Santa Cruz Biotechnology#sc - 11415
AlexaFluor 647 AffiniPure F(ab')2 fragment donkey anti rabbit IgGJackson Immuno-Research#711-606-152
DAPIROCHE, Switzerland#10236276001
Glycerol solutionSigma-Aldrich#49782
Glass bottom petri dishIbidi, Germanyu-Dish 35mm, high glass bottom, #81158
SEM aluminium stubAgar Scientific#G301F
Conducting carbon cement Leit-CPlano, GermanyAG3300
NameCompanyCatalog NumberComments
Instruments
Diamond Knife (Cryo Immuno)DiatomeDCIMM3520
Cryo-ultramicrotomeLeica MicrosystemsLeica EM FCS
Widefield-TIRF microscope GSD Leica SR GSD 3DLeica Microsystems
160x 1.43 TIRF objectiveLeica Microsystems11523048
SEM - Zeiss Supra 50 VPZeissSupra 50 VP
FIB-SEM - Zeiss Auriga 40ZeissAuriga 40

Ссылки

  1. Hauser, M., Wojcik, M., Kim, D., Mahmoudi, M., Li, W., Xu, K. Correlative Super-Resolution Microscopy: New Dimensions and New Opportunities. Chem Rev. , (2017).
  2. Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nat Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).
  3. Fölling, J., Bossi, M., et al. Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return. Nat Methods. 5 (11), 943-945 (2008).
  4. Betzig, E., Patterson, G. H., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science (New York, N.Y.). 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  5. Kopek, B. G., Shtengel, G., Grimm, J. B., Clayton, D. A., Hess, H. F. Correlative photoactivated localization and scanning electron microscopy. PLOS one. 8 (10), e77209 (2013).
  6. Paez-Segala, M. G., Sun, M. G., et al. Fixation-resistant photoactivatable fluorescent proteins for CLEM. Nat Methods. 12 (3), 215-218 (2015).
  7. Narayan, K., Subramaniam, S. Focused ion beams in biology. Nat Methods. 12 (11), 1021-1031 (2015).
  8. Tokuyasu, K. T. Immunochemistry on ultrathin frozen sections. Histochem J. 12 (4), 381-403 (1980).
  9. Suleiman, H., Zhang, L., et al. Nanoscale protein architecture of the kidney glomerular basement membrane. eLife. 2, e01149 (2013).
  10. Kopek, B. G., Shtengel, G., Xu, C. S., Clayton, D. A., Hess, H. F. Correlative 3D superresolution fluorescence and electron microscopy reveal the relationship of mitochondrial nucleoids to membranes. Proc Nat Acad Sci U S A. 109 (16), 6136-6141 (2012).
  11. Avanesov, A., Malicki, J. Analysis of the retina in the zebrafish model. Methods Cell Biol. 100, 153-204 (2010).
  12. Bachmann-Gagescu, R., Phelps, I. G., et al. The ciliopathy gene cc2d2a controls zebrafish photoreceptor outer segment development through a role in Rab8-dependent vesicle trafficking. Hum Mol Gen. 20 (20), 4041-4055 (2011).
  13. Bachmann-Gagescu, R., Dona, M., et al. The Ciliopathy Protein CC2D2A Associates with NINL and Functions in RAB8-MICAL3-Regulated Vesicle Trafficking. PLOS Gen. 11 (10), e1005575 (2015).
  14. Mateos, J. M., Guhl, B., et al. Topographic contrast of ultrathin cryo-sections for correlative super-resolution light and electron microscopy. Sci Rep. 6, 34062 (2016).
  15. Westerfield, M. . The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
  16. Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes. Biophys J. 82 (5), 2775-2783 (2002).
  17. Ovesný, M., Křížek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).
  18. Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  19. Cardona, A., Saalfeld, S., et al. TrakEM2 software for neural circuit reconstruction. PLOS one. 7 (6), e38011 (2012).
  20. Wurm, C. A., Neumann, D., et al. Nanoscale distribution of mitochondrial import receptor Tom20 is adjusted to cellular conditions and exhibits an inner-cellular gradient. Proc Nat Acad Sci U S A. 108 (33), 13546-13551 (2011).
  21. Slot, J. W., Geuze, H. J. Cryosectioning and immunolabeling. Nat Prot. 2 (10), 2480-2491 (2007).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

129

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены