Долгосрочный живых изображений устройства для улучшения экспериментальных манипуляций личинок данио рерио

Резюме

Эта рукопись описывает zWEDGI (данио рерио Wounding и захвата устройство для роста и изображений), который является разобщенным устройство, предназначенное для ориентации и сдерживать данио рерио личинки. Конструкция позволяет хвост перерезка и долгосрочной коллекции изображений с высоким разрешением флуоресцентной микроскопии заживление и регенерацию.

Аннотация

Данио рерио личинка — организм важной моделью для развития биологии и заживление ран. Кроме того данио рерио личинка является ценным системой для живой разрешением микроскопических изображений динамических биологических явлений в пространстве и времени с сотовой резолюции. Однако традиционный метод инкапсуляции агарозы для живых изображений могут препятствовать развития личинок и подроста тканей. Таким образом, эта рукопись описывает zWEDGI (данио рерио Wounding и захвата устройство для роста и изображений), который был разработан и изготовлены как функционально разобщенным устройство ориентации личинок для микроскопии высокого разрешения допуская хвостовой плавник перерезка в устройство и последующих безудержной хвост развития ре роста. Это устройство позволяет ранения и долгосрочное изображений при сохранении жизнеспособности. Учитывая, что форма zWEDGI 3D печати, настраиваемость его геометрии сделать его легко модифицирован для разнообразных данио рерио графических приложений. Кроме того zWEDGI предлагает многочисленные преимущества, такие как доступ к личинки во время экспериментов за ранение или для применения реагентов, параллельно ориентации несколько личинок для упорядоченной обработки изображений и повторного использования устройства.

Введение

Регенеративной способностью личинок данио рерио данио рерио делают их организма идеальная модель для изучения ответ раны, а также исцеления и отрастания^1,2,3,4. Доступ к массиву данио рерио трансгенных линий и данио рерио анатомические прозрачности дальше повышения их полезности в vivo исследований рану ответ события, а также долгосрочные восстановительные процессы⁴. Изучение этих биологических процессов, с помощью микроскопии высокого разрешения замедленной флуоресценции поэтому требует живой изображений данио рерио устройство, которое позволяет для высокой стабильности и минимальное движение личинок данио рерио при сохранении жизнеспособности. Это ключ, что устройство позволяет эффективного ранены во время заживления и регенерации происходит не зависит от устройства.

Стандартный живой изображений стабилизации метод встраивания личинка в агарозном во время живых изображений ограничивает рост и заживление регенерации⁵ и может увеличить уровень смертности, поскольку личинки начинают показывать знак сердца стресс и ткани некроза после четырех ⁴часов. Таким образом удаление агарозы из регионов интерес часто является необходимым для обеспечения нормального развития и регенерации⁶, подвергая личинки потенциальный ущерб как агарозы отрезать. Кроме того с агарозы, встраивание технику, пользователь должен ориентировать личинок в короткое время прежде чем агарозы затвердевает^5,6,7. Быстро манипулирования личинка требует не только мастерство пользователя, также опасность повреждения личинок. Хотя были описаны методы стабилизации личинка для живых изображений обойти эти недостатки, такие как ребристых агар Уэллс³ или divets⁸, использование силиконовые вакуумные смазка для создания изображений камеры с трубопроводом ПВХ или других материалы⁶и вращения труб⁹, многие из этих методов являются труда интенсивный, грязный, часто не используемые повторно и не позволяют экологических манипуляций (наркотиков лечения, ранив и т.д.) после монтажа рыбы.

Таким образом zWEDGI устройство (рис. 1) была разработана для преодоления некоторых из недостатков, агар, крепление для долгосрочных живых изображений данио рерио личинок допуская манипуляции образца. ZWEDGI состоит из трех полуоткрытые разобщенным камер (рис. 1A), чтобы разрешить для загрузки, сдержанность, ранив и визуализация 2-4 дней после оплодотворения данио рерио личинок. Устройство изготовлено из полидиметилсилоксан (PDMS) и помещен на крышку выскальзования изображений блюдо дно стекла 60 мм. Дизайн, здесь представлены предназначен для заживления раны исследований, однако использование модульной конструкции и изготовление стандартных технологий сделать дизайн zWEDGI, изменяемые и поддаются различных экспериментальных процедур, особенно для процедур, требуется минимальная сдержанность с экспериментальной манипуляции и долгосрочное изображений.

протокол

Примечание: для данио рерио личинки, которые являются 2-4 дней после оплодотворения (dpf) и следовать указаниям из животных ресурсов университета Висконсин-Мэдисон исследовательского центра был разработан дизайн базовый zWEDGI.

1. дизайн и 3D печать формы

1. модель PDMS компонент устройства с желаемой геометрией и атрибуты в 3D моделирования программного обеспечения ⁵. Создайте сборку пустой формы и части PDMS и генерировать негативные формы для PDMS части, создав полость в плесени, соответствующий части PDSM. Сохраните форму как файл .stl для 3D печати ( Рисунок 2, шаг 1.1).
   Примечание: Файл формата (.stl) стереолитографии плесень дизайна, представленные здесь ( рис. 1) доступен для загрузки на https://morgridge.org/designs/.
2. Печать формы с помощью фотополимерных 3D принтер ( Рисунок 2, шаг 1.2). Сделать несколько форм в одной печати, если это возможно, так что более чем одно устройство можно формовать с единого пакета PDMS.
   Примечание: В приведенном примере был напечатан в высоком разрешении режиме с 0,075 мм луч диаметром и 0,05 мм толщина слоя, с помощью фотополимерных смолы ⁵.
   1. Чистой формы с помощью тонкой кистью, денатурированный спирт в бутылку спрей и сжатый воздух аккуратно вымыть и удалить неотвержденного смолы. Удалять любой материал из регионов микроканальные.
   2. После лечения формы в УФ пост лечения аппарат для 60 мин с каждой стороны, как неотвержденных отставку является токсичным для данио рерио личинки ¹⁰.
3. Песок стороне полости формы с 200 зернистости наждачную бумагу на ровной поверхности, до тех пор, пока все уплотнительные поверхности находятся в контакте с наждачной бумагой (Загрузка геометрии канала и mold периметра). Слегка песок 400 и 600 абразивной бумагой песка, постепенно, производить потолочные поверхности во всех геометрии обкладками ( Рисунок 2, шаг 1.3). Измерьте глубину полости после шлифования с циферблатный индикатор для проверки, что это близко к разработан глубины.
   1. Чистой формы и покрытие дисков (1 ¾ дюйма диаметр x ¼ дюйма толщиной боросиликатное стекло или акрил; один стакан покрытия за плесень), поместив в ультразвуковой очиститель заполнены с водой для 30 мин или промывка в проточной воде.
   2. Сушить с сжатым воздухом и очистите обе формы и охватывает с изопропиловым спиртом и отфильтрованных сжатого воздуха. Используйте чистую скамейке как место для изготовления устройств для сведения к минимуму загрязнения от воздушно-космического мусора. Отпуск, уборка плесени и стекла охватывает в чистой скамейке или покрыты Петри, до тех пор, пока требуется.

2. PDMS изготовление zWEDGI устройство

1. делать PDMS путем лить 184 силиконовые эластомера полидиметилсилоксан (PDMS) в соотношении 5:1 (базы на активатор) в пластиковых стаканчиков. Смесь хорошо для 2 мин с палкой деревянные ремесло, помешивая геля над на себя, как месить хлеб. Для 5 формы используйте 10 g базы и 2 g активатора.
   1. Де газовой смеси в вакуумный сушильный шкаф для 25-45 мин до тех пор, пока все пузырьки исчезли.
   2. Заполнить полость каждого из 3D печатной формы с приблизительно 0,75 мл PDMS, используя шприц 10 мл до тех пор, пока форма слегка переполняется мениска ( Рисунок 2, шаг 2.1).
   3. Де газ заполненные формы для 45 мин для удаления дополнительных пузыри, которые могут быть сформированы при заполнении.
2. Применить стекла Крышка диска на вершине PDMS заполненные формы, нажав на диск вниз под углом, чтобы предотвратить пузыри от захваченных ( рис. 2, шаг 2.2). Разрешить превышение PDMS высылается как обложку диска стекло применяется.
3. Использование малых храповик зажим жестко придерживаться Обложка диска плесень.
   Примечание: Это создает плоскую поверхность после PDMS лечится и производит через отверстия, где 3D печатной геометрии заподлицо с стекла Крышка выскальзования. В качестве альтернативы чтобы увеличить количество устройств, которые могут быть вылечены в одно время, построить несколько зажим устройство (например. Рисунок 2, шаг 2.3).
4. Вылечить PDMS устройство в зажимается плесени в 100 ^o C в духовке 90 мин ( Рисунок 2, шаг 2.4). Удаление формы из духовки и дайте ему остыть до тех пор, пока они могут быть легко обработаны. Если зажимное устройство металла, удалить плесень и обложка диска сборку из зажим для предотвращения металла от продолжения лечения PDMS из-за остаточного тепла.
   Примечание: Устройство проще удалить из формы, в то время как все еще слегка теплой и не полностью вылечить. Однако как только форма будет удален из духовки и обложки диска удаляется, устройство может сидеть за пару дней, прежде чем приступать к распалубка. Если устройство demolded вскоре после удаления из печи полимеризации, поместите его в крытой Петри к минимуму загрязняющих веществ во время позволяя ей полностью вылечить.

3. ZWEDGI плазмы спекание стекла блюдо

1. зажим формы, содержащей PDMS устройство в Верстачные тиски так что плесень ' s геометрии стоят вверх, параллельно на скамейке рабочей станции.
   1. Начала удалить устройство PDMS, выпустив PDMS язычок от плесени, с плоским наконечником пинцеты. Работа по периметру плесень пинцетом (такие как удаление торт из pan ( Рисунок 2, шаг 3.1)).
   2. Использования фильтрации сжатого воздуха и Пинцеты для осторожно потяните устройство из формы, держась за язычок и выдува воздуха под устройство. Работа медленно, позволяя воздух, чтобы помочь отдельным PDMS от плесени, принимая особого ухода с советами пинцет вокруг разделов тонкие туннеля.
2. Место PDMS устройство вверх ногами на внутренней стороне крышки стекла дном блюдо так, что запретительный клинья туннель соприкасаются пластик ( Рисунок 2, 3.2 шаг).
3. Место крышку блюдо с zWEDGI вверх вниз и соответствующий стекла дном блюдо в плазме более чистых с внутреннего стекла вверх ( рис. 2, шаг 3.3).
   1. Эвакуировать плазменной очистки камеры до тех пор, пока давление достигает 500 mTorr.
   2. Набор радиочастотного (RF) мощность до максимума. Подвергать устройство и блюдо для RF частоты для около 2 мин медленно де давление камере и вернуть устройство и блюдо для чистой комнаты Худ.
4. Удалить устройство PDMS из блюдо крышкой. Переверните PDMS zWEDGI для правильной ориентации на стекле, поместив его внимательно на центр хорошо блюдо дно стекла ( рис. 2, шаг 3.4)
   1. с помощью заднего конца пинцетом, слегка надавите на PDMS устройство для обеспечения воздушных пузырьков не попали под. Приложите давление вокруг минуту геометрию микро каналы и зачищают PDMS к краям ( рис. 5 c).
      Примечание: Полный контакт между PDMS и стеклом обеспечивает лучшее соблюдение от плазмы склеивание. ZWEDGI устройство может быть плазмы, тычковой на другие стекла дном блюдо форматов, таких как стекло дном 6-ну платe ( рис. 2 c).
   2. Место крышку над устройства блюдо перед удалением из чистой комнате Худ.
      Примечание: После того, как устройства были исправлены для стекла, протокол может быть приостановлена до тех пор, пока они были готовы к использованию.

4. Подготовка и загрузка личинки

Примечание: Генеральной данио рерио животноводства было проведено за данио рерио книга, доступны онлайн на http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html. Как было описано ранее ¹ были сохранены взрослых рыбок данио и эмбрионов. Дикого типа AB штамм был использован. Следовать за учреждение ’ s животное уход протокол для специфических относительно требований для визуализации живых личинок.

1. Промыть каналы с минимум 100 мкл 70% этанола на канал, с помощью микропипеткой для полоскания через сдерживание туннеля. Удаление этанола и промыть 2 или 3 раза с двойной дистиллированной водой. Дайте высохнуть на воздухе.
2. Заполнить каналы с обезжиренным молоком (в концентрации 1%, растворяется в воде) для 10 мин при комнатной температуре, чтобы свести к минимуму приверженность личинок coverslip стеклянной посуды. Затем осторожно опускайте прибор несколько раз в двойной дистиллированной воды для полоскания. Дайте высохнуть на воздухе дном.
   Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь. Эта подготовка zWEDGI устройства может быть сделано несколько дней до использования. Магазина охватывают при комнатной температуре.
3. Подготовка 1% низких плавления агарозы (LMP), объединив 100 мкл 2% растаял LMP агарозы с 100 мкл 2 x Tricaine (0,4 мг/мл Tricaine - этил 3-аминобензоат) в E3 буфера ¹¹ предварительно разогретую до 38 ^o C. поддерживать 1% агарозы/tricaine решение на 38 ^o C в блоке горячей предотвратить гелеобразующего.
   Примечание: Для многофотонную микроскопии ¹¹, используйте либо снимите пигментированной данио рерио варианты (например, Каспер ¹²) или поддерживать личинок в E3 содержащие 0,2 мм N-фенилтиомочевины, чтобы предотвратить образование пигмента ¹¹ к минимуму поглощения вблизи инфракрасных волн пигмент.
   Предупреждение: N-фенилтиомочевины является токсичным. Следовать за учреждение ' s правила утилизации.
4. Anesthetize личинок в E3 буфера содержащие 0,2 мг/мл tricaine (Tricaine/E3) ¹¹. Подождите пока личинки неподвижно и не отвечают на прикосновение раздражитель.
5. Предварительно Намочите каналы с нескольких микролитров Tricaine/E3.
   1. Выбрать вверх один личинка с помощью кончика пипетки широкие отверстия. Депонировать личинки на загрузку канала ( рис. 3A). С помощью кончика пипетки или аналогичный инструмент, Ориент личинка в камере загрузки, таким образом, что спинной стороне сталкивается прямее края грузового пространства и хвост лица направлении запретительных туннеля ( рис. 3B).
   2. Тщательно снять жидкости из ранив камеры, позволяя личинка поступать в запретительный туннеля ( рис. 3 c). Удалите большую часть жидкости при сохранении влаги вокруг личинок ( рис. 3D). Этот процесс может оказываться, наклоняя блюдо слегка к палате ранив.
6. Место LMP агарозы 1% в Tricaine/E3 (~ 38 ^o C) над личинка ' s голова, заполнение грузового пространства ( Рисунок 3E). Разрешить агарозы для закрепления с личинки в правильном положении. Добавьте Tricaine/E3 ранив камеры при необходимости для поддержания гидратации. Повторите этот процесс оставшиеся 2 каналов для загрузки.
7. Иглой шприца, осторожно удалите любые агарозы, которая просочилась через туннель запретительного в зале ранения ( Рисунок 3F). Добавьте дополнительные tricaine/E3, либо чуть более агарозы (для ранения, короткий срок изображений или изоляции лечение ране) или заполнить культуры блюдо (за долгосрочное изображений). Замените крышку культуры блюдо для предотвращения испарения. Личинки могут отражаться в этой точке (разматывать) или раненых.

5. Ранения и изображений личинки

1. с помощью стерильным скальпель лезвие, разрез хвостовой плавник кзади хорда ¹¹ в зале ранения ( Рисунок 3 G, H). При необходимости добавьте дополнительные tricaine/E3 и заменить крышку культуры блюдо.
   Примечание: в качестве альтернативы, в зависимости от развития время окна интерес, личинки можно раненых, разрешено восстановить в E3 и поддерживается в инкубаторе (28,5 ^o C) до желаемого времени изображений, в какой-то момент они могут быть загружены в каналы как вышеописанные.
2. Установить zWEDGI устройство с наркотизированных личинок на инвертированным микроскопом в стадии вставки, которая приспособит блюдо дно стеклянной 60 мм. Найдите хвост личинка в верхнем большинство канале, вращающихся блюдо, как необходимо получить хвост в нужном положении. Изображения, необходимые для конкретного эксперимента.
   Примечание: ZWEDGI широко применяется для высокого разрешения световой микроскопии, включая widefield флуоресценции и лазерной сканирующей микроскопии. Существует ряд параметров соображений при визуализации данио рерио личинок, но конкретные параметры визуализации инструмент, выборки и эксперимент зависимых. Здесь, личинок хвост был воспроизведен образ на настраиваемого построения multiphoton микроскопа ^{5 , 11} используя следующие параметры: 40 X долго рабочей расстояние воды погружение цель, 890 Нм лазер возбуждения, 445/20 нм фильтра выбросов и резолюции 512 x 512.

6. Конце эксперимента

1. Удалить zWEDGI блюдо от Микроскоп. Усыпить личинки, поместив zWEDGI Ванна ледяной водой или по 4 ^o C на по крайней мере 20 мин и оценить отсутствие сердцебиения и циркуляцию.
   Примечание: Поскольку личинки сохраняются в отдельных отсеков, личинки могут быть индивидуально восстановлены, осторожно потянув на агаре с щипцами или пипетки. Агар могут быть удалены из головы региона и личинка используется для дополнительных процедур, таких как фиксации для пятнать антитела или обработаны для извлечение RNA или протеина.
2. После удаления личинок и агар, очистить zWEDGI с этанолом и дистиллированной воды, как описано в шаге 4.1 и установить вверх дном воздух сухой. Магазина охватывают в прохладном, сухом месте. Повторно пальто с обезжиренным молоком (шаг 4.2), при необходимости до следующего использования.
   Примечание: zWEDGIs может быть повторно использован несколько раз, до тех пор, пока PDMS начинает уходить стекла.

Результаты

ZWEDGI PDMS microfluidic устройство является устройством функционально разобщенным, предназначенные для размещения четырех основных функций (перечислены ниже), связанные с живой изображений хвостового плавника, ранив исцеления и волоски в zebrafish личинки. PDMS был выбран для изгот?...

Обсуждение

Устройство zWEDGI предназначен для захвата 3D Замедленная съемка изображений путем стабилизации и ориентации рыбы в пределах небольшой рабочее расстояние объектив высокого разрешения Микроскоп. Выполняя эти спецификации, это также улучшение над традиционными агар основе подготовки для...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fabricate molds
Solidworks Professional Accedemic Research 3D modeling software	Dassault Systemes	SPX0117-01	Fisher Unitech
Viper Si2 SLA 3D printer	3D Systems Inc.	23200-902	3D Systems Inc.
Accura 60 photopolymer resin	3D Systems Inc.	24075-902	3D Systems Inc.
denatured alcohol	Sunnyside	5613735	Menards
UV post cure apparatus	3D Systems Inc.	23363-101-00	3D Systems Inc.
TouchNTuff nitrile gloves	Ansell	92-600	McMaster Carr
220B, 400B, 600 grit T414 blue-bak sandpaper	Norton	66261139359, 54, 52	MSC
borosilicate glass disc, 2" diameter	McMaster-Carr	MIL-G-47033	McMaster-Carr
ultrasonicator cleaner	Branson	1510R-MTH
isopropyl rubbing alcohol 70%	Hydrox	54845T43	McMaster-Carr
10oz clear plastic cup	WNA Masterpiece	557405	Amazon
6"craft stick	Perfect Stix	Craft WTD-500	Amazon
Name	Company	Catalog Number	Comments
Fabricate zWEDGI PDMS device
Sylgard 184 silicon elastomeric kit	Dow-Corning	4019862	Ellworth Adhesives
10mL syringe	Becton Dickinson	305219	Vitality Medical Inc
desiccator	Bel-Art Scienceware	F42027-0000	Amazon
4 in ratcheting bar clamp	Pittsburgh	68974	Harbor Freight
lab oven	Quincy Lab Inc.	20GC	Global Industrial
tweezer set	Aven	549825	McMaster-Carr
compressed air filtered nozzle	Innotech	TA-N2-2000FT	Cleanroom Supply
vacuum bench vise	Wilton Tool Group	63500	MSC Industrial
55mm glass bottom dish; 30mm micro-well #1.5 cover glass	Cellvis	D60-30-1.5-N	Cellvis
plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-001	Harrick Plasma
Name	Company	Catalog Number	Comments
Loading Larvae
Pipetteman, P200	Gilson	F123601
100% ethanol (diluted to 70% with water prior to use)	Pharmco-aaper	111000200
Transfer pipette	Fisherbrand	13-711-5A	Fisher Scientific
powdered skim milk		2902887	MP Biomedicals
double distilled water
N-phenylthiorurea	Sigma-Aldrich	P7629	Sigma-Aldrich
tricaine (ethyl 3-aminobenzoate)		C-FINQ-UE	Western Chemical
low melting point agarose	Sigma-Aldrich	A0701	Sigma-Aldrich
heat block (dry bath incubator)	Fisher Scientific	11-718-2	Fisher Scientific
E3 buffer
large orifice pipette tip, 200 uL	Fisherbrand	02-707-134	Fisher Scientific
General purpose pipette tip, 200 uL	Fisherbrand	21-197-8E	Fisher Scientific
#15 scalpel blade	Feather	2976	Amazon
25G syringe needle	BD	BD305122	Fisher Scientific
Name	Company	Catalog Number	Comments
Imaging
inverted microscope
Imaris imaging software	Bitplane