Zebrafish 애벌레의 향상 된 실험적인 조작에 대 한 장기 라이브 이미징 장치

요약

이 원고는 zWEDGI에 설명 합니다 (zebrafish Wounding 및 성장 및 이미징 함정 장치)는 compartmentalized 장치 방향 및 zebrafish 애벌레를 억제 하도록 설계 되었습니다. 디자인 꼬리 transection 및 상처 치유와 재생의 고해상도 형광 현미경 이미지의 장기 수집을 허용합니다.

초록

Zebrafish 애벌레 발달 생물학 및 상처 치유에 대 한 중요 한 모형 유기 체 이다. 또한, zebrafish 애벌레 셀룰러 해상도 시간과 공간에 동적 생물 현상의 라이브 고해상도 현미경 이미징에 대 한 중요 한 시스템 이다. 그러나, 애벌레의 개발 및 조직 regrowth 라이브 이미징 agarose 캡슐화의 전통적인 방법 방해 수 있습니다. 따라서,이 원고는 zWEDGI에 설명 합니다 (zebrafish Wounding 및 성장 및 이미징 함정 장치),이 설계 하 고 허용 하는 동안 고해상도 현미경 검사 법에 대 한 애벌레 하 기능 compartmentalized 장치 조작 꼬리 지 느 러 미 transection 장치 및 후속 억제 꼬리 개발 시간과 다시 성장. 이 장치는 부상 및 생존 능력을 유지 하면서 장기적인 이미징에 대 한 수 있습니다. ZWEDGI 형 3D 인쇄는, 그 형상의 customizability 하기가 쉽게 다양 한 zebrafish 이미징 응용 프로그램에 대 한 수정. 또한,는 zWEDGI 실험 동안 유 충에 부상 또는 시 약의 응용 프로그램에 대 한 액세스와 같은 다양 한 혜택 paralleled 유선형된 이미징에 대 한 여러 애벌레의 방향 및 장치의 재사용성을 제공 합니다.

서문

Zebrafish 애벌레 Danio rerio 의 재생 용량 그들에 대 한 응답 상처 치유와 자라나^1,2,,34검토 이상적인 모델 유기 체를 확인 합니다. 유전자 변형 zebrafish 라인과 zebrafish의 해부학 투명도 추가의 배열에 대 한 액세스 향상 장기 재생 프로세스⁴상처 응답 이벤트의 vivo에서 학문에 대 한 그들의 유틸리티. 따라서 고해상도 시간 경과 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 이러한 생물 학적 과정의 연구는 생존 능력을 유지 하면서 높은 안정성과 제 브라 유 충의 최소한의 움직임을 허용 하는 라이브 이미징 zebrafish 장치를 요구 한다. 그것은 키 장치 허용 효과적인 부상 치유 하는 동안 재생 발생 장치에 의해 영향을 받지 않습니다.

라이브 영상 중 agarose에서 유 충을 포함의 표준 라이브 영상 안정화 방법 성장 제한 및 재생⁵ 상처와 애벌레 4 후 심장 스트레스와 조직 괴 사의 기호를 표시 하기 시작 이후 사망률을 증가 시킬 수 있습니다. 시간⁴. 따라서, 관심 영역에서 agarose의 제거는 종종 정상적인 개발을 허용 하는 데 필요한 및 재생⁶, 애벌레는 agarose로 잠재적인 손상에 노출 버려야. 또한, 기술을 포함 하는 agarose와 사용자 해야 합니다 동양 짧은 시간에 애벌레는 agarose^5,,67고형화 하기 전에. 신속 하 게 사용자의 요구 뿐만 아니라 유 충을 조작, 그것은 또한 유 충에 손상을 위험. 라이브 영상에 대 한 유 충을 안정화 하는 방법 등이 천 우물³ 또는 divets⁸, 등 이러한 단점을 우회 하 설명 되었습니다 있지만 실리콘 진공의 사용 PVC 파이프 또는 기타 이미징 챔버를 만드는 그리스 자료⁶, 그리고 회전 튜브⁹를 이러한 방법의 많은 집중, 더러 워, 자주 재사용 노동 환경 조작에 대 한 허용 하지 않습니다 (약물 치료, 부상 등.) 물고기를 탑재.

따라서, zWEDGI 장치 (그림 1) 일부는 시료의 조작을 허용 하는 동안 zebrafish 애벌레의 장기 라이브 이미징 장착 한의 단점을 극복 하기 위해 설계 되었습니다. 로드, 구속, 부상 및 2 ~ 4 일 후 수정 zebrafish 애벌레의 이미징에 대 한 세 반 오픈 compartmentalized 챔버 (그림 1A) 허용 하는 zWEDGI에 의하여 이루어져 있었다. 장치입니다 (PDMS)에서 조작 이며 60 m m 유리 하단 이미징 접시의 커버 슬립에 배치. 그러나 여기에 제시 했다 위한 상처 치유 연구, 모듈형 설계 및 표준 제조 기술을 사용 하 여 만들 zWEDGI 디자인 수정 가능 하 고 다양 한 실험 절차, 특히 절차에 대 한 의무가 있는 실험적인 조작 및 장기적인 이미지와 최소한의 자제를 요구 한다.

프로토콜

참고: 기본 zWEDGI 디자인 2 ~ 4 일 후 수정 (dpf)와 매디슨 위스콘신 대학 연구 동물 자원 센터의 지침에 따라 zebrafish 애벌레에 대 한 공식화 했다.

1. 디자인 및 3D 인쇄의 금형

원하는 형상 및 3d 모델링 소프트웨어 ⁵ 특성 장치

1. 모델은 PDMS 구성 요소. 빈 형과 PDMS 부품의 어셈블리를 만들고 PDSM 부분에 해당 하는 금형에는 구멍을 만들어 PDMS 부분에 대 한 부정적인 형을 생성 합니다. 금형 ( 그림 2, 단계 1.1) 3D 인쇄는.stl 파일로 저장.
   참고: 금형 디자인 여기에 제시 된 ( 그림 1) 스테레오 리소 그래피 형식 (.stl) 파일은 https://morgridge.org/designs/에서 다운로드할 수.
2. 인쇄 금형 photopolymer 3D 프린터 ( 그림 2, 단계 1.2)을 사용 하 여. 여러 개의 금형을 만들어 단일 인쇄에 가능 하다 면, 그래서 더 이상의 장치 주조 될 수 있다 PDMS의 단일 일괄 처리로.
   참고: 예제는 0.075 m m 빔 직경 및 0.05 m m 층 두께, photopolymer 수 지 ⁵를 사용 하 여 고해상도 모드에서 인쇄 했다.
   1. 깨끗 한 금형을 부드럽게 문질러 제거 uncured 수 지 좋은 브러시, 스프레이 병, 그리고 압축 공기에서 변성 된 알콜을 사용 하 여. 아닌 지역에서 모든 자료를 제거.
   2. Uncured 사임 zebrafish 애벌레 ¹⁰ 독성으로 양쪽에 60 분 동안 UV 게시물 치료 장치에 금형을 치료 후.
3. 모든 씰링 표면을 사 포 (채널 형상 및 금형 경계 로드) 접촉까지 평평한 표면에 200 그 릿 샌드 페이퍼로 금형의 캐비티 쪽 모래. 가볍게 모래 종이로 400 및 600 모래 모래, 점차적으로, 부드러운 플러시 표면 ( 그림 2, 1.3 단계) 모든 형상 향함에 걸쳐 생산 하. 설계 깊이 가까이 있는지 확인 하는 다이얼 표시기와 사 포 후 구멍의 깊이 측정 합니다.
   1. 금형을 청소 하 고 또는 실행 물 아래 홍 조는 초음파 청소기 30 분 물으로 채워진에 배치 하 여 디스크 (¼ 인치 두께 붕 규 산 유리 또는 아크릴 x 1 ¾ 인치 직경, 한 유리 형 당 커버) 커버.
   2. 압축 공기 건조 날 려 두 금형을 청소 하 고 이소프로필 알콜와 필터링 된 압축 공기 커버. 공 수 파편에서 오염을 최소화 하기 위해 장치를 조작 하는 곳으로 깨끗 한 벤치를 사용 합니다. 두고 청소 금형과 유리 커버 깨끗 한 벤치 또는 필요할 때까지 덮여 페 트리 접시.

2. ZWEDGI 장치의 PDMS 제조

1. 붓는 184에 의해 확인 된 PDMS 실리콘 탄성 중합체입니다 (PDMS) 5:1 (기본 활성기를) 플라스틱 컵으로 비율에서. 빵 반죽 처럼, 자체에 이상 젤 감동 나무 공예 막대기로 2 분 동안 잘 혼합. 5 금형 기지의 고 활성의 2 세대 10 g 사용 하 여.
   1. 드 가스 혼합물 25-45 분 동안 진공 desiccator에 모든 거품이 사라 때까지.
   2. PDMS 몰드를 약간 초승달 모양 ( 그림 2, 단계 2.1)와 오버플로 때까지 10 mL 주사기를 사용 하 여의 약 0.75 mL 각 3D 인쇄 된 금형의 캐비티를 채울.
   3. 드 가스 채울 때 형성 수 있습니다 추가 거품 제거 45 분 채워진된 금형.
2. PDMS 가득 금형 위에 유리 커버 디스크 적용, ( 그림 2, 단계 2.2) 갇혀 각도 거품을 방지 하기 위해 디스크를 누르고. 디스크 커버 유리 적용 되어 퇴 학 초과 PDMS 허용.
3. 사용 금형에 단단히 커버 디스크를 작은 래치 드 클램프.
   참고:이 PDMS은 치료 하 고 3D 인쇄 형상 유리 커버 슬립을 플러시는 구멍을 통해 생산 평평한 표면을 만듭니다. 또는 한 번에 완 치 될 수 있는 장치 수를 늘리려면, 구축 멀티 클램프 장치 (예를 들어. 그림 2, 단계 2.3).
4. 는 PDMS 장치 100 ^o C 오븐에서에 클램핑 된 금형에 90 분 ( 그림 2, 단계 2.4)에 대 한 치료. 금형을 오븐에서 제거 하 고 쉽게 처리할 수 있습니다 때까지 시원한를. 클램핑 장치 금속 인 경우에, 금속 치료 PDMS 잔여 열 때문에 계속 하지 않도록 클램프에서 형과 커버 디스크 어셈블리 제거.
   참고: 장치는 아직도 약간 따뜻하고 완벽 하 게 치료 하는 동안 금형에서 제거 하는 가장 쉬운. 그러나, 일단 금형 오븐에서 제거 하 고 커버 디스크 제거, 장치 demolding를 진행 하기 전에 며칠에 앉을 수 있습니다. 경우 장치는 경화 오븐에서 제거 직후 demolded는, 그것을 완벽 하 게 치료를 하면서 오염 물질을 최소화 하기 위해 덮여 페 트리 접시에 배치.

3. 유리 접시 플라즈마 결합 zWEDGI

1. 클램프 형 벤치 악에서 PDMS 장치를 포함 하 되도록 금형 ' s 형상 직면 하 고, 병렬 작업 역 벤치에.
   1. 시작 평면 밀고 핀셋을 사용 하 여 금형에서 PDMS 당김 탭을 해제 하 여 PDMS 장치를 제거 하려면. (( 그림 2, 단계 3.1) 팬에서 케이크를 제거) 처럼 핀셋으로 금형의 둘레의 주위에 일.
   2. 사용 압축 공기 및 핀셋 부드럽게 당김 탭을 잡고 장치에서 공기를 불어 하는 금형 장치를 필터링. 작업 천천히, 수 있도록 공기 별도 금형에서 PDMS, 얇은 터널 섹션 주위는 핀셋의 끝으로 특별 한 돌.
2. 금지 터널 웨지 ( 2 그림, 3.2 단계) 플라스틱 만지고 있다 그래야 유리 바닥된 접시의 커버의 안쪽에 거꾸로 PDMS 장치 장소.
3. 는 거꾸로 zWEDGI와 해당 유리 바닥된 접시 접시 커버에 자리는 플라즈마 청소기 내부 유리 위 ( 그림 2, 단계 3.3).
   1. 플라즈마 챔버 압력 500 mTorr에 도달할 때까지 청소를 철수.
   2. 세트 높은 무선 주파수 (RF) 전력. 장치를 노출 하 고 약 2 분에 대 한 RF 주파수로 접시 천천히 드 챔버 압력에 그리고 반환 장치 및 접시는 클린 룸 후드.
4. 접시 커버에서 PDMS 장치를 제거. 족집게의 백 엔드를 사용 하 여 신중 하 게
   1. 유리 하단 접시 ( 그림 2, 3.4 단계)의 센터에 그것을 배치 하 여 유리에 올바른 방향 PDMS zWEDGI 이상의 플립, 가볍게는 PDMS에 눌러 공기 방울 되도록 장치 하지 아래 갇혀 있다. 마이크로 채널의 분 형상 주위 압력을 적용 하 고 ( 그림 5C) 가장자리에는 PDMS 부드럽게.
      참고:는 PDMS와 유리 사이의 완벽 한 접촉 플라즈마 결합에서 더 좋은 준수를 보장합니다. ZWEDGI 장치는 플라즈마 유리 바닥 6 잘 같은 다른 바닥 유리 접시 형식에 보 세 수 있습니다.e ( 그림 2C).
   2. 클린 룸 후드에서 제거 하기 전에 장치 접시 커버 장소.
      참고: 장치 유리 수정 되었습니다, 일단 프로토콜 일시 중지할 수 있습니다 그들은 사용 하기 위해 준비가 될 때까지.

4. 채널 준비 및 로드 애벌레

참고: 일반 zebrafish 축산은 http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html에서 온라인 Zebrafish 책, 사용할 수 당 실시 했다. 성인 제 브라와 배아 ¹ 위에서 설명한 대로 유지 되었다. 야생 타입 AB 변형 사용 되었다. 기관에 따라 ’ 라이브 애벌레 이미징에 대 한 요구 사항에 관한 구체적인 동물 관리 프로토콜 s.

1. 린스는 micropipette는 접근 금지를 통해 린스를 사용 하 여 채널당 100 µ L 70% 에탄올의 최소 채널 터널. 에탄올과 2 또는 3 배 두 배 증류수 린스를 제거 합니다. 건조 공기에 있습니다.
2. 접시의 유리 coverslip 애벌레의 준수를 최소화 하기 위해 실 온에서 10 분 (물에 희석 하는 1%의 농도)에 탈지 우유와 함께 채널을 채우기. 그런 다음, 부드럽게 여러 번을 씻어 두 배 증류수에 장치 잠수함. 수 있게 공기 건조 거꾸로.
   참고: 프로토콜 수 있습니다 수 일시 중지 여기. ZWEDGI 장치의이 준비는 사용 하기 몇 일 전에 할 수 있습니다. 스토어 실 온에서 커버.
3. 준비 1% 낮은 녹는 포인트 100 µ L 2와 100 µ L 2% 녹아 LMP agarose를 결합 하 여 (LMP) agarose E3 버퍼 ¹¹에 x Tricaine (0.4 mg/mL Tricaine-에틸 3-aminobenzoate) 미리 예 열을 38 ^o c. 1% 유지 38 ^o C 고 방지 하기 위해 뜨거운 블록에서에서 agarose/tricaine 솔루션.
   참고: multiphoton 현미경 ¹¹ (예: 캐스퍼 ¹²) 취소 안료 zebrafish 변종 중 하나를 사용 하 여 또는 0.2 m m N-phenylthiourea 색소 형성을 방지를 포함 하는 e 3에서 애벌레를 유지 가까운 적외선 파장의 색소에 의해 흡수를 최소화 하기 위해 ¹¹.
   주의: N-phenylthiourea 독성이 있다. 기관에 따라 ' 처리에 대 한 s 규칙.
4. Anesthetize 애벌레 E3에서 버퍼 포함 0.2 mg/mL tricaine (Tricaine/E3) ¹¹. 애벌레는 움직이지 않는 비 접촉 자극에 응답 될 때까지 기다립니다.
5. 사전 Tricaine/e 3의 약간 microliters와 채널 젖은.
6. 선택 넓은 구멍 피 펫 팁을 사용 하 여 하나의 유 충을
   . 로드 채널 ( 그림 3A)에 애벌레를 입금. 지 면 로드 챔버와 금지 터널 ( 그림 3B)으로 꼬리 얼굴 똑바로 가장자리는 로드 챔버에 유 충을 동양 피 펫 팁 또는 유사한 도구를 사용 하 여.
   1. 신중 하 게 접근 금지 터널 ( 그림 3C) 흘러 유 충을 허용 부상 약 실에서 액체를 철회. 유 충 ( 그림 3D) 주위 수 분을 유지 하면서 액체의 대부분을 제거 합니다. 이 프로세스는 부상 챔버 쪽으로 약간 접시를 기울이기로 지원 수.
7. Tricaine/E3에 1% LMP agarose를 배치 (~ 38 ^o C) 유 충을 통해 ' s 머리, 로드 챔버 ( 그림 3E) 작성. 적절 한 위치에 있는 애벌레를 공고히 agarose를 허용 합니다. 수 분을 유지 하기 위해 필요에 따라 Tricaine/E3 부상 챔버를 추가 합니다. 이 로드 나머지 2 채널에 대 한 프로세스를 반복.
8. 금지 터널을 통해 부상 챔버 ( 그림 3 층)로 새 어 모든 agarose를 조심 스럽게 제거 주사기 바늘을 사용 하 여. 추가적인 tricaine/E3 이상 (대 한 부상, 단기 영상, 또는 상처 치료 격리) agarose 중 추가 또는 (장기 영상)에 대 한 문화 접시를 채우기 위해. 증발을 방지 하기 위해 문화 접시 뚜껑을 교체 합니다. 애벌레는 (unwounded)이이 시점에서 몇 군데 수 있습니다 또는 부상.

5. 부상 및 이미징 애벌레

1. 는 꼬리 지 느 러 미 ( 그림 3 G, H) 부상 챔버에서 notochord ¹¹ 후부 transect 살 균 메스 블레이드를 사용 하 여. 필요한 경우 추가 tricaine/e 3를 추가 하 고 문화 접시 뚜껑 교체.
   참고: 또는, 관심의 발달 시간대에 따라, 애벌레 부상, E3에서 복구 수 고 수 원하는 영상 시간, 어떤 시점에서 그들은으로 채널에 로드 될 수 있습니다 때까지 인큐베이터 (28.5 ^o C)에서 유지 위에서 설명한.
2. 60 m m 유리 하단 접시를 수용할 것 이다 단계 삽입에는 거꾸로 한 현미경에 애벌레를 마 취를 zWEDGI 장치를 설치 합니다. 원하는 위치에 꼬리를 얻을 하는 데 필요한 접시를 회전 위 대부분 채널에서 유 충의 꼬리를 찾습니다. 특정 실험에 필요한 이미지.
   참고:는 zWEDGI widefield 형광과 레이저 스캐닝 현미경 검사 법을 포함 하 여 고해상도 가벼운 현미경 검사 법에 대 한 광범위 하 게 적용 됩니다. Zebrafish 애벌레, 이미징 때 매개 변수 고려 수 있다 하지만 특정 매개 변수를 이미징 악기, 샘플 및 종속 실험. 여기, 애벌레 꼬리는 다음 매개 변수를 활용 하 여 사용자 지정 빌드 multiphoton 현미경 ^{5 , 11}에 몇 군데: 긴 작업 거리 물 침수 목표, 890 nm 레이저 여기, X 40 445/20 nm 방출 필터 및 512 x 512 해상도.

6. 실험의 끝

1. 제거 현미경에서 zWEDGI 접시. 얼음 물 목욕 또는 4 ^o C 적어도 20 분 동안에 zWEDGI를 배치 하 여 애벌레를 안락사 하 고 하트 비트 및 순환의 부재에 대 한 평가.
   참고: 애벌레 별도 구획에 유지 되므로, 애벌레 복구할 수 있습니다 개별적으로 겸 자 또는 피 펫으로는 agar를 살짝 당겨. 한 머리 및 유 충 항 체 얼룩이 지기에 대 한 고정 등 추가 절차에 대 한 사용 또는 RNA 또는 단백질 추출에 대 한 처리에서 제거할 수 있습니다.
2. 애벌레와 agar의 제거, 다음 에탄올 zWEDGI 청소와 증류수, 4.1 단계에서 설명한 대로 설정 거꾸로 공기 건조. 스토어 건조 위치에 덮여. 다음 사용 하기 전에 필요에 따라 다시 코트 탈지 우유 (4.2 단계)로.
   참고: zWEDGIs 다시 사용할 수 있는 여러 번은 PDMS 유리 떨어져 올 때까지.

결과

ZWEDGI PDMS 미세 장치 관련 된 부상 치유 그리고 zebrafish 애벌레에서 자라나는 꼬리 지 느 러 미의 라이브 영상 (아래)의 주요 기능 4 개를 수용 하도록 설계 된 기능 compartmentalized 장치가 이다. 그것은 단지 쉽게 사용할 수 있기 때문에 그리고 업계 표준 금형에서 잘 작동 뿐만 아니라 생체 적합성, PDMS zWEDGI 제작을 위해 선택 되었다. 또한, PDMS 만드는 장치 재사용 가능한 하드 ?...

토론

ZWEDGI 장치의 목적은 안정화와 고해상도 현미경 목표의 작은 작업 거리 물고기 방향을 이미징 3D 시간 경과 잡으려고. 이러한 설계 사양을 충족 하는 동안 그것은 또한 개선 라이브 이미징에 대 한 전통적인 천 기반 준비 에입니다. 제대로 하지 발생할 수 있습니다 결함이 있는 장치는, zWEDGI의 제작에는 3 개의 중요 한 단계 (아래 참조) 있습니다.

PDMS 준비 (그림 5A...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fabricate molds
Solidworks Professional Accedemic Research 3D modeling software	Dassault Systemes	SPX0117-01	Fisher Unitech
Viper Si2 SLA 3D printer	3D Systems Inc.	23200-902	3D Systems Inc.
Accura 60 photopolymer resin	3D Systems Inc.	24075-902	3D Systems Inc.
denatured alcohol	Sunnyside	5613735	Menards
UV post cure apparatus	3D Systems Inc.	23363-101-00	3D Systems Inc.
TouchNTuff nitrile gloves	Ansell	92-600	McMaster Carr
220B, 400B, 600 grit T414 blue-bak sandpaper	Norton	66261139359, 54, 52	MSC
borosilicate glass disc, 2" diameter	McMaster-Carr	MIL-G-47033	McMaster-Carr
ultrasonicator cleaner	Branson	1510R-MTH
isopropyl rubbing alcohol 70%	Hydrox	54845T43	McMaster-Carr
10oz clear plastic cup	WNA Masterpiece	557405	Amazon
6"craft stick	Perfect Stix	Craft WTD-500	Amazon
Name	Company	Catalog Number	Comments
Fabricate zWEDGI PDMS device
Sylgard 184 silicon elastomeric kit	Dow-Corning	4019862	Ellworth Adhesives
10mL syringe	Becton Dickinson	305219	Vitality Medical Inc
desiccator	Bel-Art Scienceware	F42027-0000	Amazon
4 in ratcheting bar clamp	Pittsburgh	68974	Harbor Freight
lab oven	Quincy Lab Inc.	20GC	Global Industrial
tweezer set	Aven	549825	McMaster-Carr
compressed air filtered nozzle	Innotech	TA-N2-2000FT	Cleanroom Supply
vacuum bench vise	Wilton Tool Group	63500	MSC Industrial
55mm glass bottom dish; 30mm micro-well #1.5 cover glass	Cellvis	D60-30-1.5-N	Cellvis
plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-001	Harrick Plasma
Name	Company	Catalog Number	Comments
Loading Larvae
Pipetteman, P200	Gilson	F123601
100% ethanol (diluted to 70% with water prior to use)	Pharmco-aaper	111000200
Transfer pipette	Fisherbrand	13-711-5A	Fisher Scientific
powdered skim milk		2902887	MP Biomedicals
double distilled water
N-phenylthiorurea	Sigma-Aldrich	P7629	Sigma-Aldrich
tricaine (ethyl 3-aminobenzoate)		C-FINQ-UE	Western Chemical
low melting point agarose	Sigma-Aldrich	A0701	Sigma-Aldrich
heat block (dry bath incubator)	Fisher Scientific	11-718-2	Fisher Scientific
E3 buffer
large orifice pipette tip, 200 uL	Fisherbrand	02-707-134	Fisher Scientific
General purpose pipette tip, 200 uL	Fisherbrand	21-197-8E	Fisher Scientific
#15 scalpel blade	Feather	2976	Amazon
25G syringe needle	BD	BD305122	Fisher Scientific
Name	Company	Catalog Number	Comments
Imaging
inverted microscope
Imaris imaging software	Bitplane