JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол описывает изготовление малых, готовых к использованию кассеты, которые могут быть применены для визуального обнаружения нескольких нуклеиновых кислот в единый, тест, который прост в эксплуатации. В этом подходе капиллярные массив был использован для мультиплекс и высокоэффективного обнаружения целей ГИО.

Аннотация

Срочно необходимы нескольких целей, короткое время и ресурс доступные методологии для обнаружения нескольких нуклеиновых кислот в единый, простой в эксплуатации тест в диагностике заболеваний, микробной мониторинг, обнаружение генетически модифицированных организмов (ГМО), и судебно-медицинской экспертизы. Ранее мы описали платформы, называется спокойствия (Capillary Aна основе rray LООП опосредованной изотермической амплификация Multiplex визуального обнаружения нуклеиновых кислот). Здесь мы описываем, совершенствование производства и производительности процессов для этой платформы. Здесь мы применяем небольшой, готовых к использованию Кассета собрана капиллярной массив для мультиплекс визуального обнаружения нуклеиновых кислот. Капиллярные массив предварительно обработанные в шаблон гидрофобных и гидрофильных перед закреплением цикла опосредованной изотермической амплификация (лампа) грунт наборы в капиллярах. После сборки адаптера для загрузки лампа реакционную смесь загружается и изолированных в каждой капилляров, благодаря капиллярные силы один шаг дозирования. ЛАМПА реакции выполняются параллельно в капиллярах. Результаты являются визуально зачитал освещения с портативных Фонарик УФ. С помощью этой платформы, мы демонстрируем, мониторинг 8, часто появляются элементы и гены в образцах ГИО с высокой специфичности и чувствительности. Таким образом платформа, описываемые предназначен для облегчения обнаружения нескольких нуклеиновых кислот. Мы считаем, что это будет широко применяться в областях, где высок объём нуклеинокислотный анализ не требуется.

Введение

В широком диапазоне областей, таких как диагностика1,2,3, ГИО обнаружения4, срочно необходимы недорогой, быстрый и простой в использовании системы для одновременного обнаружения нескольких нуклеиновых кислот 5,6, микробных контроля7,8,9, криминалистического анализа10,11и особенно точки обслуживания тестов (POCTs), где ресурсы Это обычно ограничен12,,1314.

Полимеразной цепной реакции (ПЦР), включая его производные методы ПЦР в реальном времени и мультиплексной ПЦР, является наиболее широко применяемым методом для обнаружения в этих областях. Однако эти методы обычно только обнаруживать цели в один в один тест15 , и они требуют электричества и современное профессиональное оборудование.

Другой многообещающей технологии для обнаружения нуклеиновые кислоты-петля опосредованной изотермической амплификация (лампа), который был впервые описан в 2000 году16. ЛАМПА является высокая эффективность метода обнаружения ДНК. Теоретически это может усилить от 1 экземпляра 109 копий ампликонами, в течение одного часа, все выполняется при постоянной температуре, (то есть, между 60-65 ° C). Успешное усиление будет производить большое количество нерастворимых побочным пирофосфат и приводит к изменению мутности17, который можно непосредственно наблюдать невооруженным глазом. Изменение цвета может также наблюдаться добавлением металлических ионов или флуоресцентными красителями Флуорексон18, нуклеиновые кислоты краситель19и гидроксила Нафтол синий20. Из-за преимущества высокой чувствительностью и удобство эксплуатации лампа широко применяется в обнаружения нуклеиновой кислоты.

В настоящее время главным образом две стратегии для мультиплекс лампа анализов. Один — выполнить несколько анализов лампа, имея несколько лампа грунтовка задает в одной из труб21,,2223. Однако множественности и усиления эффективности будет ограничиваться внутренней вмешательства и конкуренция между различными грунтовка наборы. Кроме того это может быть трудно определить различные продукты лампа в такую же реакцию. Другая стратегия основана на физической изоляции. Наборы различных грунтовка были изолированы в отдельных миниатюрных отсеков, и затем одновременно выполняются несколько реакций лампа24,25. Эти подходы, которые как правило основаны на microfluidic фишки, обеспечивают потенциальное решение для высокой пропускной способности лампа реакций. Однако, производство чипов и мультиплексной Предварительное покрытие грунт наборов сложных, которые могут увеличить издержки и уменьшить воспроизводимость.

Недавно несколько исследований описал исполняющая лампа реакции в капиллярах обойти сложные изготовление microfluidic чипов и достигли лоу кост обнаружения26,27. Однако относительно высок объём анализа, эти капилляры похожи на миниатюрные версии ПЦР газа трубок, потому что образцы и реагенты реакции (включая наборы различных грунтовка) должны быть индивидуально подготовлен и доставлены в различные реакция подразделения капилляров. Для достижения анализа параллельных и мультиплекс, дополнительное оборудование, например многоканальный шприцевый насос, является обязательным для параллельной загрузки образцов или реагенты.

Чтобы преодолеть ограничения, связанные с текущими методами для мультиплекс обнаружения нуклеиновых кислот, мы разработали миниатюрных платформу, которая сочетает в себе технологию визуального лампа с массивом капилляров. Эта платформа нескольких целей, компактный размер, низкая стоимость и легко работать28. Здесь мы описываем подробности о том, как изготовить капиллярного массив и выполнять лампа реакции в массиве. Протокол, описанные здесь был унифицирован с использованием генетически измененных организмов (ГИО) обнаружения как модель. Важно отметить, что этот протокол может использоваться также в высокой пропускной способности обнаружения других целей нуклеиновых кислот.

протокол

Примечание: этот протокол предполагает, что уже были сделаны из нержавеющей стали плесень, принимая форму желаемого микро каналы и загрузки адаптер (3D файлы предоставляются как Дополнительные файлы 1 и 2. ). Этот протокол также предполагается, что завод изоляции ДНК уже были проведены.

1. Изготовление кассеты готовых к использованию на основе капиллярного массива

  1. чистой нержавеющей стали плесень.
    1. Умывальник из нержавеющей стали плесень, моющих средств, этанола и обессоленной воды для удаления возможных загрязнений. Сухой плесени азотом.
  2. Очистки капилляров
    1. носить защитные очки, лаборатории единообразной и химические защитные перчатки.
    2. Место капилляров в стакан. Очистить капилляров с 30 мл ацетона для 5 мин для удаления органических веществ, а затем вымыть капилляров с дейонизированной водой.
      Предупреждение: Обрабатывать ацетона в зонта.
    3. Налейте в стакан 10 мл H 2 O 2 и затем добавьте 30 мл 2 H, 4 H 2 O 2 с медленно покачивая для предотвращения перегрева. Убедитесь, что раствор (Пиранья) полностью покрывает капилляров для по крайней мере 30 мин
      Внимание: Будьте внимательны при обработке Пиранья решение (H 2 SO 4/h 2 O 2 = 3: 1, v/v) . Если пролитой решения пираньи, смыть раствор быстро с большим количеством воды и протрите поверхность с бумажными полотенцами.
      Примечание: Тщательной очистки капилляров является одним из ключевых моментов, чтобы обеспечить успех лампа реакции. Это необходимо встряхнуть кислоты цилиндра во время процесса очистки для удаления пузырьков в капиллярах и чистого времени также могут быть расширены, когда требуется.
    4. Смыть раствор Пиранья с большим количеством воды. Вымойте капилляров с этанолом и деионизированную воду на 5 мин. Сухие капилляров в сушильной печи.
  3. Pour полидиметилсилоксан (PDMS)
    1. вес из PDMS базы и отверждения реагентов с соотношением 1:1 в 50 мл трубки. Как правило, смесь 5 g эластомера базы до 5 g эластомера Вулканизирующий агент.
    2. Перемешать смесь тщательно для около 5 мин с стеклянной палочкой. Поместите трубку с PDMS в вакуумной колпаком для 30 минут для исключения газообразования.
    3. Медленно Налейте PDMS цилиндр плесень из нержавеющей стали. Разрешить PDMS вылечить за 3 ч в сушильном шкафу при температуре 60 ° C
      Примечание: Будьте осторожны, чтобы избежать воздушных пузырей при заливке PDMS. После заливки PDMS, дайте ему постоять 5 мин для естественных удаления пузырей из PDMS.
  4. Удалить плесень из PDMS
    1. после отверждения PDMS, удалить плесень, потянув плесень с цилиндром. Удаление PDMS из цилиндра путем разрезания поля формы с помощью скальпеля.
    2. Мыть PDMS три раза с этанолом и обессоленной воды. Сухой PDMS поддержки по азотом.
  5. Относиться к нижней поверхности PDMS поддержки быть гидрофобным. Замочите PDMS поддержки в супер-гидрофобная пальто для 1 s. сухой за 10 мин при комнатной температуре.
    6. Вставьте капилляр в поддержку PDMS
    2. вставьте очищенный 4 мм капилляров в отверстия PDMS поддержки и оставить 0,5 мм капилляров за пределами верхней поверхности PDMS поддержки. Убедитесь, что концы капилляров находятся на одном уровне.
  6. Лечения на наружную поверхность капилляры и верхней поверхности PDMS поддержки быть гидрофобной. Поддержка
    1. Добавить 15 мкл супер-гидрофобные слоя на верхней поверхности PDMS. Обратите внимание, что покрытие немедленно распространяется по всей поверхности (включая верхней поверхности PDMS поддержки и внешние поверхности подвергаются частью капилляров), капиллярные силы.
    2. Воздух сухой супер-гидрофобная модифицированных капиллярной массива.
  7. Исправить грунт в капиллярной массив
    1. подготовить грунтовочный раствор. Вес, 0,65 г хитозана (Молекулярная формула: (C 6 H 11 NO 4) n) и растворяют в 50 мл деионизированной воды, регулируя pH 4,5-5,5 с уксусной кислотой для достижения хитозана концентрации 1,3%. Подготовьте грунт компонентов смеси согласно таблице 1. Просмотреть Дополнительные таблицы 1 для грунтовки
    2. Добавить 1,6 мкл смеси одного набора грунтовки заполнить один соответствующий капиллярные капиллярного массива pre-конструированные порядке.
      Примечание: Оставшиеся два пустых капилляров были установлены как негативный контроль.
    3. Фиксированный массив в прозрачной ну стандартный плоский днище 96-луночных и сухой массив при 60 ° C для по крайней мере 2 h.
< td > 1.0/1.0
грунтовка лампа фиксации смесь компонентов (начальной концентрации)объем (мкл)
ddH 2 O17,0
хитозана (1,3%)1.0
МФП/BIP грунтовка (20 мкм)2.0/2.0
LoopF/LoopB грунт (20 мкм)
F3/B3 грунтовка (20 мкм)0.5/0,5
объема25,0

Таблица 1: компоненты лампа Грунтовка, фиксации реагентов. В левой колонке таблицы перечислены компоненты праймера лампа фиксации смеси, и объем каждого компонента отображается в правой колонке.

  1. собрать кассеты следующим образом. Поместите адаптер загрузки на вершину якорь массива. Убедитесь, что блюдо адаптер просто покрывает открытые части всех десяти капилляров (см. Рисунок 1).

figure-protocol-6107
Рисунок 1: Изготовление кассет и Ассамблея. () нержавеющей плесени и PDMS поддержки. Форма состоит из 3 частей: цилиндр, дам Совет и столб пластины. (b) схемы PDMS поддержки изготовления и Ассамблеи капиллярного кассеты. Весь процесс содержит 5 шагов: 1. PDMS заливки, 2. плесень удаление, 3. Вставка капилляров и покрытие поверхности, 4. грунтовка фиксации и 5. Кассета якорь. 1. Залейте PDMS в цилиндр плесень; 2. Нажмите, дам Совет, чтобы удалить плесень из PDMS поддержки; 3. пальто вниз поверхности PDMS поддержки и затем вставьте капилляров в PDMS поддержки, наконец пальто верхней поверхности PDMS поддержки и подвергаются капилляров. Толстая синяя линия показывает супер-гидрофобная пальто; 4. загрузить грунт в отдельных капилляров; 5. якорь капиллярного массив в одной пластине 96-луночных и установить пример загрузки адаптер на него. Детали были описаны в протоколе шагов 1,1-1,9. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

2. производительность лампы реакции в капиллярной массив

  1. подготовить смесь реакции
    1. подготовить смесь реакции лампа согласно T состоянии 2.
    2. Реагенты добавить к смеси согласно выбранной порядок, как и в таблице 2 и вихрь реакционной смеси для 5 s после добавления Флуорексон. Аккуратно ввер добавляется трубки 20 раз после Bst полимеразы.
лампа компоненты (Начальная концентрация)объем (мкл)
ddH 2 O11,6
MgSO 4 (100 мм)2.0
дНТФ (25 мм)1,4 < / t d >
бетаин (5 М)4.0
буфера (10 x)2,5
Флуорексон (1,25 мм)0,5
0,5НКД 2 (25 мм)
Bst < / EM > полимераза (8 U/мкл)1,5
Растительная ДНК (10 нг/мкл)1.0
Общий объем25,0

Таблица 2: Реакции система капиллярного массив лампу. Компоненты реакции системы капиллярного массив лампа компонентов перечислены в левом столбце, и объем каждого компонента отображается в правой колонке.

  1. загрузить реагентов и уплотнение кассеты
    1. пипетку 20 мкл лампа реакционную смесь с стандартных 100 мкл наконечник. Вставьте наконечник в входной адаптер загрузки для его блокировки. Аккуратно привнести реакционной смеси в блюдо адаптер; реакционную смесь быстро заполнить блюдо и затем загрузить капилляров автоматически через капиллярные силы.
    2. Удалить адаптер с заблокированной кончиком и печатью хорошо пленкой прозрачной герметизации ПЦР совместимых.
      Примечание: Только капилляров, касаясь реакционной смеси в гидрофильной блюдо может быть заполнена. Поэтому убедитесь, что в верхней части всех капилляров, той же высоте (см. Рисунок 2).

figure-protocol-9640
Рисунок 2: Схема выборки-загрузки, с помощью адаптера загрузки. На рисунке показан процесс загрузки, используя синий решение в качестве примера. Вставьте наконечник в входе и привнести образца в адаптер медленно и затем удалить адаптер с заблокированной кончиком. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

  1. инкубировать капиллярного массив в инкубаторе на 63 ° C в течение 1 ч.

3. индикация результатов и анализа данных

  1. получить изображения эмиссии флуоресцирования.
    1. Исправить УФ-фильтр на верхней поверхности небольшой ручной UV LED фонарик для фильтрации видимого света.
    2. Возбуждают диссоциированных Флуорексон выдавать флуоресценции с УФ фонарика. Захват изображения из верхней части капилляра массива или цифровую камеру или смартфон.
    3. При съемке изображения, убедитесь, что камера увеличена на площади капилляров, насколько это возможно получить высокое качество, четкие изображения.
  2. Анализировать результаты
    1. открытое программное обеспечение анализа изображений, изображений, а затем выберите " изображение > формы > серого > да " и " изображение > плесень > 16 бит > да ". Выберите " файл > сохранить как > формат > TIFF " с конвертировать изображения в 16-битных TIFF формат.
    2. Извлекает значение интенсивности флуоресценции
      1. Открыть microarray анализ программного обеспечения. Перетащите изображения формат TIFF 16-битный интерфейс программного обеспечения, а затем выберите на длине волны " 532 нм " и цвет " зеленый " для отображения изображения.
      2. Создать новый блок, чтобы найти флуоресценции сигнал от капилляров. Выберите " инструменты > новые блоки " и введите количество столбцов и строк как " 1; 1 " и " 2; 5 " в ' блоков ' и ' функции ' интерфейсы отдельно.
      3. Право нажмите и выберите " функции " модель и затем настроить расположение и диаметр до размеров области флуоресценции капилляров. Выберите " анализ " для извлечения значения интенсивности флуоресценции.
      4. Выберите " файл > сохранить настройки как " чтобы сохранить документы блоки и выберите " файл > сохранить результаты как " спасти флюоресценция интенсивности результаты. Рассчитать SNR для определения, выполняется ли успешно лампа в капиллярах.
        Примечание: Сигналы капилляров были получены путем записи значения серого пятна и сигнал соотношения шум (SNR) были определены как соотношение значения сигналов переднем плане целей, чтобы средние средние значения переднего сигналов двух негативных элементы управления. Отсечки для определения позитивных сигналов был задан как SNR > 2.

Результаты

В этом методе он имеет важное значение для предотвращения перекрестного инфицирования среди различных капилляры во время загрузки образца. Для этой цели была введена хитозана, которая может сохранить грунтовки в отдельных капилляров. Чтобы проверить ли он работал ил...

Обсуждение

СПОКОЙНЫМ платформы продемонстрировали здесь, который сочетает в себе технологии лампы с массивом капилляров, позволяет одновременное обнаружение нескольких генов, связанных с ГИО целей в единый, высоко эффективный и простой в эксплуатации тест.

Чтобы успешно выполнит...

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Это исследование финансировалось частично национальных естественных наук из Китая гранты фонда (31370813, 3147670, 31670831 и 31600672,), Национальный трансгенных растений Специальный фонд (2016ZX08012-003, 2016ZX08012-005), программа для нового века отличные таланты в Университет, национальных исследований и проект развития Китая (2016YFA0500601) и Китай Докторантура научный фонд (2016 М 591667).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
UltraEverDry(super-hydrophobic coat)UltraTech4001supplier:Exiron chemistry(CHINA) CO.,LTD.
PDMSDow Corning8332557
Bst polymeraseNew England BioLabsM0275L
betainSigma-AldrichB0300-1VL
calceinSigma-AldrichC0875-5G
MnCl2Sigma-AldrichMKBP0495V
MgSO4New England BioLabsB1003S
dNTPsShanghai SangonB804BA0022
chitosanShanghai SangonLJ0805S309J
Photoshop 7.0 softwareAdobe Systems Inc., CA, USAImage analysis
GenePix Pro 6.1Molecular Devices, CA, USAmicroarray analysis software
AutoCADAdobe Systems Inc.3D construction software
UV filter (ZWB2)YXSensingsupplier : taobao

Ссылки

  1. Urdea, M., et al. Requirements for high impact diagnostics in the developing world. Nature. 444, 73-79 (2006).
  2. Yager, P., Domingo, G. J., Gerdes, J. Point-of-care diagnostics for global health. Annu Rev Biomed Eng. 10, 107-144 (2008).
  3. Opota, O., Jaton, K., Greub, G. Microbial diagnosis of bloodstream infection: towards molecular diagnosis directly from blood. Clin Microbiol Infec. 21 (4), 323-331 (2015).
  4. Guo, J., et al. MPIC: A High-Throughput Analytical Method for Multiple DNA Targets. Anal Chem. 83 (5), 1579-1586 (2011).
  5. Shao, N., et al. MACRO: a combined microchip-PCR and microarray system for high-throughput monitoring of genetically modified organisms. Anal Chem. 86 (2), 1269-1276 (2014).
  6. Kamle, S., Ali, S. Genetically modified crops: detection strategies and biosafety issues. Gene. 522 (2), 123-132 (2013).
  7. Galvin, S., Dolan, A., Cahill, O., Daniels, S., Humphreys, H. Microbial monitoring of the hospital environment: why and how?. J Hosp Infect. 82 (3), 143-151 (2012).
  8. Sciancalepore, A. G., et al. Microdroplet-based multiplex PCR on chip to detect foodborne bacteria producing biogenic amines. Food Microbiol. 35 (1), 10-14 (2013).
  9. Saxena, G., Bharagava, R. N., Kaithwas, G., Raj, A. Microbial indicators, pathogens and methods for their monitoring in water environment. J Water Health. 13 (2), 319-339 (2015).
  10. Hopwood, A. J., et al. Integrated Microfluidic System for Rapid Forensic DNA Analysis: Sample Collection to DNA Profile. Anal Chem. 82 (16), 6991-6999 (2010).
  11. Estes, M. D., et al. Optimization of multiplexed PCR on an integrated microfluidic forensic platform for rapid DNA analysis. Analyst. 137 (23), 5510-5519 (2012).
  12. Niemz, A., Ferguson, T. M., Boyle, D. S. Point-of-care nucleic acid testing for infectious diseases. Trends Biotechnol. 29 (5), 240-250 (2011).
  13. Peeling, R. W., Mabey, D. Point-of-care tests for diagnosing infections in the developing world. Clin Microbiol Infec. 16 (8), 1062-1069 (2010).
  14. Perkins, M. D., Kessel, M. What Ebola tells us about outbreak diagnostic readiness. Nat Biotechnol. 33 (5), 464-469 (2015).
  15. Li, Y., et al. A universal multiplex PCR strategy for 100-plex amplification using a hydrophobically patterned microarray. Lab Chip. 11 (21), 3609-3618 (2011).
  16. Notomi, T., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 28 (12), (2000).
  17. Mori, Y., Nagamine, K., Tomita, N., Notomi, T. Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation. Biochem Biophys Res Commun. 289 (1), 150-154 (2001).
  18. Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products. Nat Protoc. 3 (5), 877-882 (2008).
  19. Iwamoto, T., Sonobe, T., Hayashi, K. Loop-mediated isothermal amplification for direct detection of Mycobacterium tuberculosis complex, M-avium, and M-intracellulare in sputum samples. J Clin Microbiol. 41 (6), 2616-2622 (2003).
  20. Goto, M., Honda, E., Ogura, A., Nomoto, A., Hanaki, K. Colorimetric detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by using hydroxy naphthol blue. Biotechniques. 46 (3), 167-172 (2009).
  21. Iseki, H., et al. Development of a multiplex loop-mediated isothermal amplification (mLAMP) method for the simultaneous detection of bovine Babesia parasites. J Microbiol Methods. 71 (3), 281-287 (2007).
  22. Liang, C., et al. Multiplex loop-mediated isothermal amplification detection by sequence-based barcodes coupled with nicking endonuclease-mediated pyrosequencing. Anal Chem. 84 (8), 3758-3763 (2012).
  23. Shao, Y., Zhu, S., Jin, C., Chen, F. Development of multiplex loop-mediated isothermal amplification-RFLP (mLAMP-RFLP) to detect Salmonella spp. and Shigella spp. in milk. Int J Food Microbiol. 148 (2), 75-79 (2011).
  24. Fang, X., Chen, H., Yu, S., Jiang, X., Kong, J. Predicting viruses accurately by a multiplex microfluidic loop-mediated isothermal amplification chip. Anal Chem. 83 (3), 690-695 (2011).
  25. Stedtfeld, R. D., et al. Gene-Z: a device for point of care genetic testing using a smartphone. Lab Chip. 12 (8), 1454-1462 (2012).
  26. Liu, D., Liang, G., Zhang, Q., Chen, B. Detection of Mycobacterium tuberculosis using a capillary-array microsystem with integrated DNA extraction, loop-mediated isothermal amplification, and fluorescence detection. Anal Chem. 85 (9), 4698-4704 (2013).
  27. Zhang, Y., et al. Point-of-Care Multiplexed Assays of Nucleic Acids Using Microcapillary-based Loop-Mediated Isothermal Amplification. Anal Chem. 86 (14), 7057-7062 (2014).
  28. Shao, N., et al. Visual detection of multiple genetically modified organisms in a capillary array. Lab Chip. 17 (3), 521-529 (2017).
  29. Lizardi, P. M., et al. Mutation detection and single-moledule counting using isothermal rolling-circle amplification. Nat Genet. , (1998).
  30. Piepenburg, O., Williams, C. H., Stemple, D. L., Armes, N. A. DNA detection using recombination proteins. Plos Biol. 4 (7), 1115-1121 (2006).
  31. Opota, O., Jaton, K., Greub, G. Microbial diagnosis of bloodstream infection: towards molecular diagnosis directly from blood. Clin Microbiol Infect. 21 (4), 323-331 (2015).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

129

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены