모 세관 배열에 여러 개의 핵 산의 비주얼 검색

요약

이 프로토콜에서 작동 하기 쉬운 여러 핵 산의 비주얼 검색 적용 될 수 있는 작은, 준비-사용 카세트의 제작을 설명 합니다. 이 방법에서는, 모 세관 배열 멀티플렉스 및 고효율 검출 조합 목표의 사용 되었다.

초록

다중 대상, 짧은 시간, 그리고 단일 테스트 운영 하 게 쉬운에서 여러 핵 산의 검출에 대 한 리소스-저렴 한 방법론은 절실히 필요 질병 진단, 미생물 모니터링, 유전자 변형된 생명체 (GMO) 검출, 그리고 법정 분석입니다. 우리는 이전 진정 (Capillary Array 기반 Loop 중재 등온 증폭 핵 산의 Multiplex 비주얼 검색) 라는 플랫폼을 설명 했습니다. 여기, 우리는 향상 된 제조 및 성능 프로세스가이 플랫폼에 대 한 설명. 여기, 우리는 작은, 준비-사용 카세트 핵 산의 다중 영상 검출을 위한 모 세관 배열에 의해 조립 적용. 모 세관 배열 고정 루프 중재 등온 증폭 (램프) 뇌관 세트 모세 혈관에 전에 미리 소수 성 및 친수성 패턴으로 치료 이다. 로드 어댑터의 조립 후 램프 반응 혼합물은 로드 하 고 각 모 세관, 단일 pipetting 단계에 의해 모 세관 힘 때문에 고립. 램프 반응 모세 혈관에서 병렬로 수행 됩니다. 결과 휴대용 자외선 손전등 조명에 의해 밖으로 시각적으로 읽혀집니다. 이 플랫폼을 사용 하 여, 8 자주 높은 특이성 및 감도 요소와 GMO 샘플에서 유전자 표시의 모니터링 설명 합니다. 요약 하면, 여기에 설명 된 플랫폼 여러 핵 산의 탐지를 촉진 하기 위한 것입니다. 우리는 높은 처리량 핵 산 분석 필요 분야에 광범위 하 게 적용 될 것입니다 믿습니다.

서문

여러 핵 산의 동시 검출을 위한 저가, 빠르고 사용 하기 쉬운 시스템 분야, 임상 진단^1,2,3, GMO 검출^{4, 넓은 범위에서 긴급 하 게 필요 5,6},^7,,89, 정밀 분석^10,11, 그리고 특히 포인트의 케어 테스트 (POCTs), 어디 모니터링 미생물 자원 일반적으로 제한^12,,1314있습니다.

연쇄 반응 (PCR), 실시간 PCR 및 멀티플렉스 PCR 파생 메서드를 포함 하 여 검출이 분야에 가장 널리 적용된 기술입니다. 그러나, 이러한 방법은 일반적으로 검색 한 대상 한 테스트¹⁵ 및 전기 및 정교한 전문 장비 필요한.

핵 산 탐지 하기 위한 또 다른 유망한 기술이 이다 루프 중재 등온 증폭 (램프)는 처음 2000¹⁶에 설명 했다. 램프는 고효율 DNA 검출 방식 이다. 이론적으로, 그것은 수 있는 증폭 1 복사본에서 amplicons 10⁹ 복사본을 일정 한 온도, (즉, 60-65 ° C 사이)에서 모두 1 시간 이내. 성공적인 증폭 불용 성 부산물 파이 인산의 대량 생산 하 고 탁도¹⁷, 맨 눈으로 직접 관찰 될 수 있는 변경 될 것입니다. 색상 변화는 또한 금속 이온 또는 Calcein¹⁸, 핵 산 염색¹⁹, hydroxyl naphthol 블루²⁰등 형광 염료의 추가 의해 관찰할 수 있습니다. 높은 감도의 장점과 운영의 편의 때문에 램프는 핵 산 탐지에서 넓게 적용 되 고.

현재, 다중 램프 분석 실험을 위한 주로 두 가지 전략이 있다. 하나는 여러 개의 램프를 갖는 다중 램프 분석 수행 하는 뇌관 1 개의 관^21,,2223에 설정 합니다. 그러나, 복합성 및 증폭 효율 본질적인 간섭 및 다른 뇌관 세트 간의 경쟁에 의해 제한 될 것 이다. 또한, 그것은 다른 램프 제품 같은 반응에 어려울 수 있습니다. 또 다른 전략은 물리적 격리를 기반으로 합니다. 다른 뇌관 세트 개별 소형된 구획으로 고립 되었다 및 다중 램프 반응을 동시에 수행 됩니다 다음^24,25. 미세 칩에 따라 일반적으로, 이러한 접근 높은 처리량 램프 반응에 대 한 잠재적인 솔루션을 제공 합니다. 그러나, 칩의 제조 및 뇌관 세트의 다중 사전 코팅은 복잡, 비용 증가 재현성을 줄일 수 있습니다.

최근, 몇 가지 연구는 미세 칩의 복잡 한 제조를 무시 하 고 저 비 탐지^26,27달성에 모 세관에서 수행 램프 반응을 설명 했습니다. 그러나, 높은 처리량 분석에 관해서는 이러한 모세 혈관은 비슷합니다 PCR 스트립 튜브의 미니어처 버전 샘플 및 반응 시 약 (를 포함 하 여 다른 뇌관 세트) 개별적으로 준비 하 고 해야 합니다 다른에 게 전달 하기 때문에 모세 혈관 내에서 반응 단위입니다. 병렬 및 다중 분석을 달성 하기 위해 추가 장비, 예를 들어 멀티 채널 주사기 펌프는 샘플 또는 시 약의 병렬 로드에 대 한 필요 합니다.

핵 산의 다중 검출을 위한 현재 메서드에 연결 된 한계를 극복 하기 위해 우리 모 세관 배열로 시각적 램프 기술을 결합 하는 소형된 플랫폼을 개발 했습니다. 이 플랫폼은 다중 대상, 소형 크기, 낮은 비용, 그리고²⁸를 운영 하 게 쉬운. 여기, 모 세관 배열 조작 배열에 램프 반응을 수행 하는 방법의 세부 사항을 설명 합니다. 여기에 설명 된 프로토콜 모델 유전자 변형된 유기 체 (GMO) 검출을 사용 하 여 표준화 되어 있다. 중요 한 것은,이 프로토콜 다른 핵 산 대상의 높은 처리량 검색에도 사용할 수 있습니다.

프로토콜

참고: 베어링 원하는 마이크로 채널 및 로딩 어댑터에 대 한 셰이프 스테인리스 형 되었습니다 이미이 프로토콜 가정 (3D 파일 추가 파일 1로 제공 됩니다과 2. ). 이 프로토콜은 또한 그 식물 DNA 분리 이미 실시 되었습니다 가정 합니다.

1. 모 세관 배열 기반 준비-사용 카세트의 제작

1. 스테인리스 스틸 금형 청소.
2. 잠재적인 오염 물질을 제거 하 세척 세제, 에탄올, 그리고 이온된 수 스테인리스 형
   . 질소에 의해 금형을 건조.
3. 모세 혈관 청소
   1. 착용 안전 고글, 실험실, 균일 하 고 화학 보호 장갑.
   2. 비 커에 장소 모 세관입니다. 유기 물질을 제거 하 5 분 30 mL 아세톤으로 모세 혈관을 청소 하 고 다음 씻어 이온된 수와 모세 혈관.
      주의: 증기 두건에서 아세톤 처리.
   3. 는 H ₂ O ₂의 10 mL를 비이 커에 부 어 하 고 ₄와 H ₂ O ₂로 느린 과열을 방지 하기 위해 떨고 그래서 H ₂의 30 mL를 추가 합니다. 솔루션 (피 솔루션) 완전히 적어도 30 분에 대 한 모세 혈관을 커버 있는지 확인
      주의: 피 솔루션을 처리 하는 동안 조심 (H ₂ 이렇게 4/H ₂ O ₂ = 3: 1, v/v) _. 피 솔루션을 유출 하는 경우 많은 양의 물으로 신속 하 게 솔루션을 씻어 하 고 닦아 종이 타 올으로 표면.
      참고: 모 세관의 철저 한 청소 램프 반응의 성공을 위해 핵심 포인트 중 하나입니다. 그것은 모세에 거품을 제거 하는 청소 과정 동안 산 실린더를 흔들 필요가 그리고 깨끗 한 시간 필요할 때 확장할 수도 있습니다.
   4. 피 솔루션 많은 양의 물으로 씻어. 에탄올과 5 분 이온된 수와 모세 혈관을 씻어. 건조 건조 오븐에서 모세 혈관.
4. 입니다 (PDMS)을 부 어
   1. PDMS 기본 및 치료 시 약 50 mL 튜브에 1: 1의 비율으로 무게. 일반적으로, 혼합의 탄성 중합체 고무 경화제의 5 g에 기본 5 g.
   2. 철저 하 게 유리 막대와 약 5 분을 위한 혼합물을 저 어. PDMS와 튜브 드 가스에 대 일 분 동안 진공 벨 항아리에 배치.
   3. 스테인리스 스틸 금형의 실린더에는 PDMS를 천천히 부 어. 건조 오븐에서 60 ℃에서 3 h에 대 한 치료 PDMS 허용
      참고: PDMS 붓는 때 공기 방울을 피하기 위해 조심. 붓는 PDMS 후 PDMS에서 거품의 자연적인 제거를 위한 5 분 동안 서 서 허용 그것.
5. 에서 PDMS 몰드를 제거
   1. 는 PDMS, 경화 후 제거 형 실린더와 금형 밖으로 당겨. 메스와 금형의 여백 절단 하 여 원통에서 PDMS를 제거.
   2. 세척 PDMS 세 번와 에탄올 이온된 수. 질소 건조는 PDMS 지원.
6. 소수 수 PDMS 지원의 낮은 표면 처리. 담가 PDMS에 슈퍼 소수 지원 코트 1 s. 드라이 실 온에서 10 분.
7. 1. PDMS 지원에 모 세관을 삽입 PDMS 지원 구멍에 청소 4mm 모세 혈관을 삽입 하 고 떠나 PDMS 지원의 위쪽 표면 밖에 모 세관의 0.5 m m. 모 세관의 끝은 동일한 수준에 있는지 확인 하십시오.
8. 은 모세 혈관의 외부 표면 및 소수 성 수 PDMS 지원의 위쪽 표면 치료.
9. 추가 15 µ L 슈퍼 소수 코트는 PDMS의 위쪽 표면에
   지원. 코팅 즉시 모 세관 힘에 의해 (를 포함 하 여 PDMS 지원의 위쪽 표면 및 모 세관의 노출된 부분의 외부 표면) 상단 표면 전체 스프레드.
   1. 공기 건조 슈퍼 소수 수정된 모 세관 배열.
10. 모 세관 배열에 뇌관을 수정
    1. 뇌관 솔루션을 준비. 0.65 g 키토 산 밖으로 무게 (분자 공식: (C ₆ H ₁₁ 아무 ₄) _n) 4.5-5.5 1.3%의 키토 산 농도 달성 하기 위해 초 산으로 pH를 조정 하 여 50 mL 이온된 수로 그것을 해산 하 고. 표 1에 의하여 뇌관 구성 믹스를 준비 합니다. 프라이 머에 대 한 보충 표 1을 참조 하십시오
    2. 집합이 미리 정의 된 순서에 따라 모 세관 배열의 한 해당 모 세관 채우기 위해 뇌관의 혼합물의 추가 1.6 µ L.
       참고: 나머지 두 빈 모 세관 부정적인 컨트롤로 설정 했다.
    3. 앵커에 표준 플랫 바닥 96 잘 접시의 투명 한 잘 배열 하 고 적어도 2 h. 60 ° C에서 배열 건조

< td > 1.0/1.0

램프 뇌관 믹스 구성 요소 (초기 농도) 고정	볼륨 (μ)
ddH 2 O	17.0
키토 산 (1.3%)	1.0
FIP/BIP 뇌관 (20 μ M)	2.0/2.0
LoopF/LoopB 뇌관 (20 μ M)
f 3/B3 뇌관 (20 μ M)	0.5/0.5
총 볼륨	25.0

표 1: 램프의 구성 요소 담합 시 약 뇌관. 램프 뇌관 고정 믹스의 구성 요소는 테이블의 왼쪽된 열에 나열 된 및 각 부품의 오른쪽 열에 나열 됩니다.

9. 조립 카세트 다음과 같습니다. 고정된 배열 위에 로드 어댑터를 넣어. 어댑터의 접시는 그냥 모든 10 모세 (참조 그림 1)의 노출된 부분을 다루고 있는지 확인 하십시오.

그림 1: 카세트 제조 및 어셈블리. (한) 스테인레스 형과 PDMS를 지원합니다. 금형 3 부분으로 구성 됩니다: 실린더, 댐 보드, 그리고 기둥 판. (b) PDMS의 회로도 지원 제조 그리고 모 세관 카세트의 조립. 5 단계를 포함 하는 전체 과정: 1. PDMS 따르고, 2. 곰 팡이 제거, 3. 모 세관 삽입 및 표면 코팅, 4. 뇌관 및 5. 카세트 정박입니다. 1. 금형;의 실린더 내 PDMS 붓으십시오 2. 댐 보드 밖으로 밀어 PDMS 몰드를 제거 지원; 3. 코트 PDMS의 아래쪽 표면 지원과 다음 모세는 PDMS 삽입 지원, 마지막으로 하 게 PDMS 지원의 상부 표면 코트 하 고 모세 혈관을 노출. 두꺼운 파란색 선이 나타냅니다 슈퍼 소수 코트; 4. 로드 뇌관 개별 모세 혈관;로 설정 5. 앵커 단일 96 잘 접시에 모 세관 배열 및 그것에 어댑터를 로드 하는 예제를 설치 합니다. 세부는 프로토콜 단계 1.1-1.9에에서 설명 했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

2. 모 세관 배열에서 램프의 성능 반응

1. 준비 반응 혼합
   1. T 수 2에 의하여 램프 반응 혼합 준비.
   2. 선택한 순서 대로, 표 2, 그리고 소용돌이 반응 혼합물 5 혼합물에 추가 시 약 s calcein를 추가한 후. 부드럽게에버텍스 Bst 중 합 효소 후 20 번 튜브 추가 됩니다.

램프 구성 요소 (초기 농도)	볼륨 (μ)
ddH 2 O	11.6
MgSO 4 (100mm)	2.0
dNTPs (25 mM)	1.4 < /t d >
Betaine (5m)	4.0
버퍼 (10 배)	2.5
Calcein (1.25 m m)	0.5
MnCl 2 (25 mM)	0.5
Bst < /em > 중 합 효소 (8 U/μ)	1.5
DNA를 식물 (10 ng/μ)	1.0
총 볼륨	25.0

표 2: 모 세관 배열 램프의 반응 시스템. 모 세관 배열 램프 구성 요소 반응 시스템의 구성 요소 왼쪽된 열에 나열 되 고 각 구성의 오른쪽 열에 나열 됩니다.

는 시 약을 로드 하 고 카세트 인감
2. 1. 피 펫 20 µ L 램프 반응 혼합물 표준 100 µ L 팁. 에 그것을 잠글 수 로드 어댑터의 끝을 삽입 합니다. 부드럽게 어댑터;의 접시에 반응 혼합물을 주사 반응 혼합물 것입니다 신속 하 게 요리를 모 세관 힘을 통해 자동으로 모 세관 로드.
   2. 잠긴된 팁과 어댑터를 제거 하 고 PCR 호환 투명 봉인 영화도 잘 봉인.
      참고: 친수성 접시에 반응 혼합물을 만지고 모세 혈관만 가득 수 있습니다. 그래서 같은 높이 (참조 그림 2)의 모든 모세 혈관의 상부는 다는 것을 확인.

그림 2: 샘플 로딩 로딩 어댑터를 사용 하 여 다이어그램. 그림 예를 들어 블루 솔루션을 채용 하는 로드 프로세스를 보여 줍니다. 에 팁을 삽입 하 고 주입 샘플 어댑터 천천히, 잠긴된 팁과 어댑터를 제거 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

3. 품 1 h. 63 ° C에서 인큐베이터에서 모 세관 배열

3. 결과 판독 및 데이터 분석

1. 형광 방출의 이미지.
   1. 가시 광선을 필터링 하는 작은 휴대용 UV LED 손전등의 위쪽 표면에 UV 필터를 수정.
   2. 는 자외선 손전등과 형광을 방출 하는 해리 calcein를 자극 합니다. 디지털 카메라 또는 스마트폰으로 모 세관 배열 위에서 이미지를 캡처.
   3. 이미지를 찍을 때 카메라는 모세 혈관을 높은 품질, 이미지 취소 가능한 만큼의 영역 확대 된 확인 하십시오.
2. 분석 결과
   1. 이미지에 의해 이미지 분석 소프트웨어를 열고 다음 선택 " 이미지 > 형 > 회색조 > 예 "와 " 이미지 > 형 > 16 비트 > 네 ". 선택 " 파일 >로 저장 > 형식 > TIFF " 16 비트 TIFF 형식으로 이미지 변환 하.
   2. 는 Microarray 분석 소프트웨어
      1. 오픈 형광 강도의 값을 추출합니다. 소프트웨어의 인터페이스에 16 비트 TIFF 형식 이미지를 끌어서 다음의 파장을 선택 " 532 nm "의 색과 " 녹색 " 이미지를 표시 하.
      2. 만들기 새로운 블록을 모세 혈관에서 형광 신호를 찾습니다. 선택 " 도구 > 새로운 블록 "로 행과 열 수를 입력 하 고 " 1; 1 " 및 " 2; 5 "에 ' 블록 ' 및 ' 기능 ' 별도로 인터페이스.
      3. 오른쪽 클릭 하 고 선택 " 기능 " 모델 및 위치와 직경 모 세관의 형광 영역에 맞게 조정 합니다. 선택 " 분석 " 형광 강도의 값을 추출 하.
      4. 선택 " 파일 >로 설정을 저장 " 블록 문서 저장을 선택 " 파일 >으로 결과 저장 " 형광 강도 결과 저장 하려면. 램프는 모 세관에서 성공적으로 수행 되는지 여부를 정의 하는 SNR 계산.
         참고:은 모세 혈관의 신호 기록 관광 명소 및 신호 잡음 비율 (SNRs)를의 회색 값 두 부정적인 전경 신호의 평균 평균값을 대상의 전경 신호의 평균값의 비율으로 정의 된에 의해 가져온 제어 합니다. 긍정적인 신호를 확인 하기 위해 컷오프 SNR로 설정 된 > 2.

결과

이 방법에서는, 그것은 샘플 로드 하는 동안 다른 모세 혈관 간의 교차 오염을 방지 하는 것이 중요입니다. 이 개별 모 세관에 뇌관을 유지 수 있는 키토 산 도입 되었다. 그것은 일 또는 하지 여부를 테스트 하려면 우리 미리 고정 ADH1 (옥수수의 유전자 생 참조) 뇌관 "T"와 "U"의 패턴으로 모 세관 카세트에 설정에서 볼 수 있듯이 그림 3a. <...

토론

진정 플랫폼 시연, 여기는 모 세관 배열 램프 기술을 결합, 단일, 매우 효과적이 고 테스트를 운영 하 게 쉬운에서 여러 유전자 GMO 관련 목표의 동시 탐지를 가능 하 게.

카세트에서 다중 램프 반응을 성공적으로 수행 하려면 세 가지 중요 한 포인트 주의 될 필요가 있다. 첫째, 모세 혈관의 상부 및 모 세관 배열의 친수성 및 소수 성 패턴에 대 한 동일한 높이 달성가 동시에 모?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
UltraEverDry(super-hydrophobic coat)	UltraTech	4001	supplier:Exiron chemistry(CHINA) CO.,LTD.
PDMS	Dow Corning	8332557
Bst polymerase	New England BioLabs	M0275L
betain	Sigma-Aldrich	B0300-1VL
calcein	Sigma-Aldrich	C0875-5G
MnCl2	Sigma-Aldrich	MKBP0495V
MgSO4	New England BioLabs	B1003S
dNTPs	Shanghai Sangon	B804BA0022
chitosan	Shanghai Sangon	LJ0805S309J
Photoshop 7.0 software	Adobe Systems Inc., CA, USA		Image analysis
GenePix Pro 6.1	Molecular Devices, CA, USA		microarray analysis software
AutoCAD	Adobe Systems Inc.		3D construction software
UV filter (ZWB2)	YXSensing		supplier : taobao