Анализ поведения Arabidopsis thaliana роста в разных качествах свет

Резюме

Здесь мы представляем протокол для изучения поведения роста растений и особенно фенотипов образом воспроизводимость. Мы покажем, как предоставлять переменной и на же время стабильных условиях освещения. Надлежащего анализа зависит от достаточного числа образцов и действительный статистических оценок.

Аннотация

Завод биологи часто требуется наблюдать за поведением роста их выбранных видов. С этой целью растения нуждаются в постоянной экологических и стабильной легких условий, которые предпочтительно переменного количества и качества, так что исследования под различных установок. Эти требования выполняются, климатические камеры, показывая света светоиспускающие диоды (LED) огней, которые можно в отличие от флуоресцентных ламп – установить различных длинах волн. Светодиоды являются энергии сохранение и излучают практически нет тепла даже при интенсивности света, которая зачастую представляет собой проблему с другими источниками света. Представленные протокол обеспечивает шаг за шагом руководство о том, как программировать климатической камере с переменной светодиодные фонари, а также описанием несколько подходов для глубины анализа роста фенотипов. В зависимости от экспериментальной установки может наблюдается и проанализированы различные характеристики выращивания растений. Здесь мы опишем, как определить свежего веса, площади листа, фотосинтетическая активность и устьичного плотности. Мы показываем, что в целях получения достоверных данных и действительный выводы что это обязательно использовать достаточное количество лиц для статистической оценки. Принимая слишком мало растений для такого рода анализа результатов в высокой статистической погрешности и, следовательно, в менее четкой интерпретации данных.

Введение

Резуховидка Таля был модельный организм для исследователей растение молекулярной эпохи для более чем двух десятилетий. Некоторые характеристики делают этот маленький представитель семейства Brassica идеальным кандидатом для генетические и молекулярные исследования: он имеет относительно небольшой генома с только пять хромосом (по сравнению с например Nicotiana tabacum с 24 хромосомы) и геном был полностью секвенирован в 2000 году¹. A. thaliana может быть легко генетически модифицированных Agrobacterium инфекции² и поддается даже Последнее генетическое инструменты такие как ТРИФОСФАТЫ/Cas³. Несмотря на небольшой, цикл роста достаточно быстро, чтобы сделать биохимические эксперименты осуществимо, где требуется большее количество материала. Растения растут на плитах агара или на земле и даже можно выращивать как жидкий культур⁴. Арабидопсис может быть выращен в климатически контролируемых шкафы, например от Персиваль, в климатических камерах или в теплицах. Чтобы иметь возможность сравнивать рост поведение и анализировать фенотипов мутантов важно обеспечить воспроизводимость и на же время гибкого роста условия⁵. В зависимости от научной проблемой, которая должна решаться один может потребоваться различные температуры и постоянные условия освещения, разнообразные света или различные света качества при той же температуре. Свет является очень критическим параметром роста растений и его влияние часто учился в⁶различных подходов. Чтобы обеспечить воспроизводимость и сопоставимости полученных данных важно обеспечить стабильный выпуск и применять такой же источников света.

Обычные источники света в теплицах и климатические камеры состоят из натриевых или люминесцентных ламп, которые способствовать удовлетворяющих рост растений, но имеют ряд недостатков. Во-первых они стареют со временем, которое изменяет спектральных вывода не только в интенсивности, но в качестве (собственных наблюдений). Однако только интенсивность непрерывно обычно контролируется так, что изменения в качество света может остаться незамеченным, но все еще имеют значительные последствия. Во-вторых, оба типа ламп генерировать тепло на более высокой интенсивности света, который сам по себе имеет большое физиологическое влияние на рост растений и могут маскировать любые зависимые свечения. В-третьих спектральные вывода этих источников света неизменна и совсем в отличие от естественного солнечного света⁷. Все эти недостатки были преодолены в случае светодиоды)^8,9,10,11. Они имеют длинный жизни с едва любые изменения в выбросах, не производят тепло даже при очень высокой интенсивности света и они являются очень гибкими, относительно их спектральных вывода.

Здесь мы показывают, как настроить климатической камере с участием отдельных светодиодов красного, синего и белого света и следовать различные параметры роста растений с течением времени. Мы измеряем свежего веса, площади листа, плотность устьиц и фотосинтетической производительности. В то же время мы продемонстрировать важность правильной настройки статистической оценки.

протокол

Этот протокол содержит некоторые примеры того, как анализировать поведение роста растений A. thaliana .

1. Подготовка

1. Прежде чем начать, сделать тщательный план на сколько растения необходимо будет делать надежный статистический анализ экспериментов и затем подготовить соответствующее количество горшков.
   Примечание: Всегда допускает возможность того, что некоторые семена могут не прорасти.
2. Используйте климатической камере с различными уровнями индивидуально программируемый светодиодный для сравнения роста растений на тех же условиях общие экологические (таблица материалов).

2. завод роста и установка Светодиодных огней

1. Подготовить соответствующий номер (в зависимости от различных условий и/или мутанты анализируемым) 6 x 7 см горшки с почвы и растений одно семя в каждом из них.
   Примечание: В этом случае, 36 растений в условиях были посеяны.
2. Vernalize в течение двух дней при 4 ° C.
3. Значение относительной влажности воздуха 65% и температурой до 22 ° C/16 ° C за день 16 h / 8 h ночь цикла. Отрегулируйте свет всех уровней интенсивности 200 мкм/см2/s-¹. Это можно сделать, введя соответствующие значения в программу через сенсорный экран на передней части климатические камеры. Чтобы сравнить четыре разных света качества присвоено светодиоды следующие параметры как это предусмотрено в таблице 1.

Identifyier	395 Нм [%]	440 Нм [%]	3 K [%]	660 нм [%]	770 Нм [%]
«Солнечный свет»	100	11	100	15	100
Красный и синий (РБ)	100	15	25	10	100
Синий (B)	100	15	25	2	25
Red (R)	90	2	25	10	100

Таблица 1: состав интенсивности света, испускаемого от светодиодов

4. Мониторинг спектральной вывода непрерывно, например , используя встроенный калиброванные спектрометр.
5. Поместите растения в климатической камере на различных уровнях и держать их покрыта прозрачной верхней до развитой семядоли видны. Убедитесь, что растения достаточно поливать.
6. Монитор и документ растения на глаз и фотографически, как часто, в случае необходимости, в зависимости от того, как быстро растут растения в выбранных условиях, например каждые два дня. Убедитесь в том использовать штатив для камеры, чтобы обеспечить одинаковое расстояние между камерой и объекты для всех изображений и тем самым позволить сравнения. Использование линейки шкалы, когда это целесообразно.
   Примечание: Термин Дас (дней после посева) относится к фактической посадки семян, включая яровизация.

3. Определение PSII выхода

1. Используйте импульсный модулированный fluorimeter. Настройка камеры головы на соответствующем расстоянии от завода, таким образом, чтобы полный розетка можно увидеть в окне живой.
2. После запуска программного обеспечения появляется окно «выбрать блок». Отметьте «Мини» и затем «ОК». Выбор цвета «синий» в следующем всплывающем окне. Нажмите кнопку «ОК».
   Примечание: Пульс модулированных флуоресценции измерения света автоматически включается. Окно изображения на мониторе, отображается параметр флуоресценции Ft. Завод под камеры теперь может рассматриваться как оранжевый изображения.
3. Резкость изображения и/или выбрать конкретные регионы завода, переключитесь жить видео на отметку в графе «видео» и поверните кольцо регулировки объектива. Закройте окно живого видео, щелкнув поле выхода в правом верхнем углу.
4. Для измерения параметров фотосинтеза, определите области, представляющей интерес (АОИ). Используйте значение по умолчанию для этого, которая представляет собой круг, который автоматически появляется в центре экрана. Красный флажок представляет собой усредненное значение Ft всех пикселей в АОИ. Определите соответствующие АОИ, выбрав из окна АОИ в правой панели, где имеются различные формы. Нажмите кнопку «Добавить» на вкладке АОИ и поместите круг в области листа. Повторите пять раз за лист.
5. Сохранять параметры (вкладка справа) на значения по умолчанию, предоставленный производителем (Таблица 2).

Входданныхизмерения свет	Int.	Частота
	1	1
Акт. Свет	Int.	Ширина
	8	0
Коррекция изображений	МИНИ
Преобразование изображения	Батарея
	16.7V
Получить	5
Демпфирования	1
SAT пульс	Int.	Нет	Интервала s
	8	1	30
Замедляют всасывание	Задержку s	Часы-s	Продолжительность s
	40	20	315
Absortivity	Получить красный	Красный интенсивность	NIR интенсивность
	340	25	13
Дисплей	Цвет
PS Предел	50
ПНГ. Ref. AOI	1
Фактор FM (тик)	1 030

Таблица 2: параметры по умолчанию для измерения PAM, предоставленный производителем.

6. Примените насыщения вспышка для выполнения измерения параметров фотосинтетической люминесцентные закалки анализ (насыщенность пульс). До этого определите тушения коэффициенты путем измерения флуоресценции минимальная и максимальная доходность dark-adapted завода. С этой целью место завод в темноте (например в ящик или темное поле) за несколько минут. Затем поместите растение под голову камеры, флажки меру и мл (измерения света), в строке ниже изображения выберите «Fv/Fm» на хронометрировать в круг и нажмите Fo, Fm в нижней части экрана.
   Примечание: Fo/Fm представляет PSII доходность dark-adapted завода. Таким образом это значение, к которому нормируется измерения после применения света. Измерение тока Fo/Fm будет оставаться до тех пор, пока новая запись активирована. Все F и Fm' значения определяется насыщенностью импульсы, связанные с Fo/Fm и тушения параметры вычисляются соответственно.
7. Найти эти результаты в закладке отчета и проверьте все ящики на стороне правой руки, которые имеют отношение к эксперимент (например. Y(II), qP, qN, и т.д.).
8. Экспортируйте результаты анализа программного обеспечения например. Excel, нажав на кнопку Экспорт в верхнем левом углу и сохранить под соответствующее имя файла. Создание по меньшей мере пять AOIs на лист и измерить несколько листьев того же завода (не забудьте вскоре темные адаптировать завод снова после каждого измерения), а также несколько растений из одного состояния, которые можно затем статистически оценить.
9. Для статистического анализа создавать средние значения и стандартных отклонений от всех AOIs и по меньшей мере три независимых растений для всех время точек/условия и выполнить студента t тест для оценки, если данные являются значительные¹². Данные оцениваются как значительно отличается, когда значения p ниже 0,05.

4. Определение плотности устьиц

1. Собери три полностью развернут розетка листья из трех отдельных растений на условие в 70% этанол в чашке Петри стекла и извлечь хлорофилла. Инкубировать в этом растворителя на ночь при комнатной температуре или хранить при 4 ° C.
2. Для полного разминирования из пигментов, инкубировать в растворе хлораль гидрат (гидрат хлораль: вода: глицерина = 8: 2: 1 w/v/w) до тех пор, пока листья появляются полностью белым.
3. Принимать дифференциальной помехи изображения микроскопии (DIC) abaxial поверхности в 40 кратном. Количество устьиц в поле зрения и экстраполировать полученный результат с помощью линейки шкалы устьиц на мм². Повторите, что эта процедура для по крайней мере 4 оставляет за условия. Выполнение статистического анализа путем вычисления среднего значения для всех листья одного состояния и от этого вычисления средней ошибки.

5. Определение свежего веса

1. Удалите все листья, включая черешках от розетки из шести растений на состояние с лезвием бритвы. Взвесить все листья сразу и подвергать статистического анализа данных, как описано выше.

6. определение площади листа розетка

1. Использование изображений из восьми растений на условие для анализа поверхности листьев графически. Объединять изображения для одного состояния в единый образ и сохранить как *.jpeg или * .tiff.
2. Загрузите соответствующее программное обеспечение (таблица материалов).
   Примечание: Это, конечно, можно применить любой другой программы, способные выполнять эту задачу.
3. Откройте файл изображения. Выберите инструмент «Выделение свободной руки.» Окружить листья, включая черешках одной розетки. Нажмите на «Анализировать - набор измерений» и «Район», «Min и Max значение серого,» «Комплексной плотность» и «Среднее значение серого.» Выберите соответствующие десятичных мест, лучше всего два или три и нажмите кнопку «ОК».
4. Для получения мм² вместо пикселов используйте команду «масштабировать». Применить средство прямой выбор сделать выбор строки, который соответствует известным расстоянием, например диаметр отпуск, который легко вычислить от линейки шкалы изображений, а затем открыть диалоговое окно Задать масштаб и введите этот определенного расстояния и единица измерение. Затем вернитесь к «анализировать» и нажмите «мерой.»
5. Появляется новое окно, озаглавленный «результаты», которые содержат соответствующие данные для текущего розетки. Повторите эту процедуру с всех растений в изображении и инициализировать области измерений для каждого нового завода с Ctrl + M.
   Примечание: Для небольших растений с non перекроя листья «палочкой» может использоваться чтобы сделать этот процесс проще и быстрее. Как только листья начинают, охватывающие друг друга, это средство не дает надежных результатов.
6. В качестве альтернативы cut off все листья и разместить их таким образом, что изображение обзор может быть принято и затем использовать средство палочка. Примите во внимание, что при использовании этого метода, необходимо больше растений.
7. Выберите «Файл»-«Сохранить как» в окне результаты и создать соответствующее имя файла и расположение в папке компьютера. Файл будет автоматически сохранен в формате Excel.

7. Подготовка РНК

1. Урожай три пробы из десяти отдельных растений для каждого условия. Экстракт всего РНК с помощью растений РНК добыча комплект согласно инструкциям производителя. Определение концентрации РНК, чистоту и целостность с помощью bioanalyzer. РНК могут затем использоваться для вниз по течению приложений, таких как анализ выражения qRT ПЦР или гена например RNASeq¹³.

Результаты

Наблюдение и анализ роста растений и особенно фенотипов от мутантных растений полагаются на стабильной и воспроизводимость условий окружающей среды. Они могут быть предоставлены в климатических камерах. Количество света и особенно качество критически зависит от занятого источник света, который в этом исследовании была предоставлена светодиодные фонари.

Рисунок 1 показывает пример климатические камеры оснащены Светодиодных панелей. Рисунок 1A показана копия экрана панели управления, где можно отрегулировать все климатические и легкие условия. В течение 24 часов можно задать двадцать различных таймфреймах. В этом примере были запрограммированы длинный день условия с 16 свет/8 h темно. Эта камера имеет четыре уровня, которые могут быть отдельно запрограммированы таким образом, чтобы рост растений на четыре различные настройки света могут быть изучены точно на тех же условиях окружающей среды. Верхний левый уровень присваивается спектральных вывода, подражая солнечного света, насколько это технически возможно, верхней правой уровня представляет повышенный красный (660 нм) и синий свет (440 Нм) с уменьшенными белый свет (3K). Левый нижний уровень был установлен для повышенных синий свет и на нижней правой уровне преимущественно красный свет. Рисунок 1B иллюстрирует светодиоды на различные параметры как обзор (средняя группа) и соответствующих зум Син (Внешние малые панели). Разница в свет качества можно легко увидеть глазом.

Встроенный спектрометр постоянно измеряет, контролирует и регулирует спектральных вывода. На рисунке 2 показан весь спектр от левого верхнего уровня 1.1, которая была создана для имитации солнечного света. По сравнению с Стандартный флуоресцентные лампочки часть УФ и синий свет является гораздо выше⁷.

Figure 3 пример A. thaliana растений из всех четырех условий, 10, 13 и 17 дней, соответственно, после посева изображен. Все заводы были сфотографированы на том же расстоянии монтажа камеры на штатив. Линейки шкалы представляет 1 см. После 10 дней не так много различий в размер или цвет можно выделить, но после 17 дней очевидно быстрее роста под красный свет. Помимо этого визуального анализа несколько физиологических анализы.

Рисунок 4 следует различные этапы PAM измерений, который анализирует например фотосинтетический потенциал. В рисунке 4A скриншот live видео показано, что является параметром для чего завод в фокус для обеспечения оптимального качества измерений. Вместо сосредоточения внимания на весь завод, можно также выбрать один лист для анализа. Рисунок 4B демонстрирует текущая доходность флуоресцентные Ft dark-adapted завода до начала фактического измерения. В этом случае были выбраны пять круговой области, представляющие интерес (AOIs). Числа в красные коробки рядом с каждой АОИ непосредственно дает числовой результат, который также могут быть сохранены в виде таблицы. Чтобы начать измерение параметров фотосинтетической Fo, Fm необходимо установить. Скриншот метрах после этого изображена на рисунке 4 c. Обратите внимание, что теперь больше не активна кнопка «Fo, Fm». Чтобы начать новое измерение, «Новая запись» должна быть нажата, чтобы стереть предыдущий нормализации. Наконец Рисунок 4 d показывает эффективной доходности квантовой PSII Y(II) после предоставления насыщения светового импульса («SAT-пульс»). Количественная оценка образцовую данных показано на рисунке 5. Растения, выращенные под солнечним светом на 200 мкм/см2/s¹ (Рисунок 5A) были проанализированы 12, 21 и 28 дней после посева, соответственно. Наши данные показывают, что PSII урожайность значительно выше, в листьях растений, выращенных на три недели, чем за 12 дней. Разница между 28 и 12 дней по-прежнему значительна, но p значение выше. В Рисунок 4Bсравнивали PSII урожайности из растений, выращенных на две недели из различных света качества. Интересно, что постоянный рост под свет, содержащих высокую часть синего света приводит к значительно большую доходность PSII. Аналогичный эффект наблюдался для растений, выращиваемых под обогащенного красный свет, но это увеличение было немного ниже.

Эффект устьиц развития¹⁴были продемонстрированы различные качества света. Таким образом было расследовано устьичного плотности. Рисунок 6 показывает, как выглядит лист после извлечения пигмента. Один эпидермальные клетки могут быть хорошо уважаемых и стомы можно легко пересчитать. На рисунке отдельные устьиц обозначены звездочкой. Подробные данные об удельных устьичных плотность растений от различные настройки света можно найти в других⁹.

Помимо визуального осмотра (рис. 3) свежего веса обеспечивает хорошей мерой прогресса роста. В этом примере листья из растений, выращенных под «солнечный свет» после 8, 10 и 12 дней после посева, соответственно, были взвешены. Статистические оценки этих данных можно увидеть на рисунке 7. Как и ожидалось, свежие вес увеличивается с течением времени.

Помимо свежих вес площади листа является хорошей мерой для роста. Здесь развития завода последовал от 10, 13 и 17 дней после посева (рис. 8A). Для получения достоверных статистических данных регулярно оценивались по меньшей мере шесть отдельных растений. Чтобы продемонстрировать важность высокой выборки, рассчитывался процент ошибка среднего значения, от анализа двух и шести растений, соответственно, (Рисунок 8B). Это означает, что был определен процент стандартное отклонение относительно среднего значения. Это очень ясно, что в случае небольшой размер выборки ошибка является 5-10% выше, чем в случае выше размер выборки. Увеличивая количество растений, которые оцениваются, ошибка может свести к минимуму, что делает интерпретации данных гораздо яснее.

Рисунок 1: различные света качества предоставляемых светодиодов. A) скриншот из панели управления индикатор камеры. Длина день равен 16 h (в правом верхнем углу) и интенсивности света имеет значение 200 мкмоль см^-2 s^-1. Качество света отличается на всех четырех уровнях: 1.1 представляет спектра как похож на Солнечный свет как технически возможно, 1.2 представляет высокий процент красных и синих длин волн (РБ) света, 2.1 преимущественно устанавливается на синий (B), 2,2 представляет главным образом красный свет (R). B) средней панели показывает обзор всех уровней; Внешние панели показывают отдельные уровни в выше зум. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2: волны спектр от имитации солнечного света параметров. Показано скриншот из встроенной спектрометр в зале LED, который был установлен на уровне 1.1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3: развития через неделю растений. Представитель A. thaliana растений из всех четырех освещенности от 10, 13 и 17 дас. Растения были сфотографированы с цифровой зеркальный фотоаппарат на штатив. Линейки шкалы представляет 1 см для всех изображений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4: Скриншоты от представителя шагов PAM измерений растений A. thaliana . A) скриншот из представления «Видео», где можно отрегулировать фокус изображения. B) текущая доходность флуоресценции метрах перед применением любых световых импульсов. C) текущая доходность флуоресценции метрах после установки Fo/Fm. D) осуществление PSII квантовый выход после установки насыщения светового импульса. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 5: графическое представление осуществление PSII квантовый выход (YII). A) данные из растений 12, 21 и 28 дней после посева и вырос до 200 мкмоль/см2/s¹ под имитации солнечного света («Солнечный свет») подвергнуты анализу PAM статистически были оценены. Приведены средние значения пяти растений и пять AOIs в день. Одна звездочка указывает на существенное различие с p значение < 0,05 по сравнению с день 12 и две звездочки показывают весьма существенные различия с p значение < 0.02 согласно студентов t теста. B) данные из растений, выращенных на 200 мкмоль/см 2/s¹ под имитации солнечного света (SL), обогащенный синий (B) или красный (R) света, соответственно, были статистически вычисляются. Приведены средние значения пяти растений и пять AOIs в день. Существенные различия были рассчитаны по сравнению с «солнечного света.»

Рисунок 6: представитель образ устьиц на abaxial стороне листа A. thaliana . Листья подготовлен как описано выше и визуально были проанализированы под микроскопом света с параметрами ДВС на 40 кратном. Устьиц, учитываются в видимой области по крайней мере 4 листьев в условие. Фотография была сделана с цифровой камеры, подключенной к тубус микроскопа. Число устьиц на мм² рассчитывается с помощью линейки шкалы. Звездочки указывают одну стому. Линейки шкалы представляет 200 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 7: графическое представление свежего веса от A. thaliana растений, выращенных в имитации солнечного света/200 мкмоль/см2/s¹. Розетка листьев были отрезаны от растений, восемь, десять и двенадцать дней после посева. Средние значения в мг от шести растений в день изображены. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 8: Статистическая оценка A. thaliana листовой поверхности растений, выращенных при различных условиях освещения. A) площади листа от A. thaliana выросли на 10, 13 и 17 дней графически определялся с ImageJ и данные из n = 6 растения статистически были оценены. Площади листа от всех шести розеток от каждого состояния подведены и разделена на шесть получить среднее значение. Это значение вычисляется стандартное отклонение, и это представлено погрешностей. B) поверхности листьев графически определялся с ImageJ и данных из обоих n = 2 или n = 6 заводов, соответственно, были статистически проанализированы как описано для группы A. Затем ошибка в % среднее значение рассчитывается и изображены графически. Зеленые бары показывают процент ошибки анализа n = 6, голубой баров из n = 2 растения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Обсуждение

Первым шагом в изучении роста растений является создание климатической камере в зависимости от желаемых условий. Это делается легко, введя всех переменных в программе маску соответствующего программного обеспечения (рис. 1A). На этом шаге многие изменения могут осуществляться путем изменения светового режима и/или температуры. Убедитесь в том, чтобы постоянно контролировать температуры, влажности и освещенности (рис. 2), чтобы предотвратить губит эксперимент технического сбоя. Это является критической точкой для получения воспроизводимых результатов. Хотя эта настройка предлагает множество переменных и гибко настраивается, он имеет свои ограничения. В настоящее время светодиодные огни не может имитировать солнечный свет на сто процентов и климатические условия внутри климатической камере может никогда не полностью отражать, что происходит за пределами¹⁵.

По сравнению с широко используются люминесцентные лампы Светодиодные огни являются более универсальными, нужно меньше энергии и показать практически не теплового излучения. Эти преимущества привели индустрии большой крытый земледелия для оснащения климатические камеры и оранжереи с¹⁶светодиодов. Учитывая огромные успехи сообщили в этой области, светодиодная техника наверняка найдете много больше приложений.

При наблюдении фенотипа и особенно для определения площади листа, при этом важно учитывать, в старых растений листья накладок (рис. 3). Таким образом графической оценки всего розеток, как правило, является неточным. В этом случае это гораздо более точно отрезать все листья и идти оттуда.

Оценки роста поведения и особенно различия роста и развития в различных условиях зависит от достаточного размера выборки. В этом исследовании по крайней мере шесть заводов были использованы для определения например фотосинтетической доходности (рис. 5), свежие вес (рис. 7), и площади листа (рис. 8A) но 30 отдельных семена были посажены в начале исследования для обеспечения что во-первых, достаточно семена прорастают, и во-вторых, выбор «типичного» растений может быть сделан. Даже в рамках одной популяции, т.е. растения в одном горшки в панели же точно тех же условиях, показал различной фенотипов. Это затем конечно отражается в стандартное отклонение в ходе статистического анализа, но интерпретации данных является более надежным, как правило, когда небольшие статистические ошибки наблюдаются (Рисунок 8B).

Измерение фотосинтетической производительности по PAM (рис. 4, рис. 5) может быть сделано для нескольких параметров. В этом случае акцент был сделан на урожайность PSII Y(II) в качестве примера, но это можно также определить, например номера фотохимического тушения, квантовый выход диссипация энергии регулируемых и нерегулируемых или света ремиссии. Важным здесь является выбрать по крайней мере пять AOIs на лист, равномерно распределенных по поверхности листа и затем измерения по меньшей мере шесть листья из различных растений. Недостатком этого метода является, что не может обнаружить любое воздействие на PSI; для этой цели необходима различного оборудования.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Climatic chamber equipped with LED panels	Rhenac Green Tec AG		These chambers are custom made.
Spectrometer	OceanOptics	USB-650
Imaging PAM	Walz	IMAGING-PAM M-Series	There are several suitable models depending on the broader use.
Microscope+ 40x objective	Leica	DM1000	Other companies also produce suitable microscopes.
Software ImageJ			Free download from website
Plant RNA extraction kit	Qiagen	74903
Bioanalyser	Agilent	G2939BA	Needs an additional computer