JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Планарии Schmidtea mediterranea является прекрасной моделью для изучения стволовых клеток и регенерации тканей. Эта публикация описывает метод выборочно удалить один орган, глотки, подвергая животных для азид химического натрия. Этот протокол также излагаются методы мониторинга глотки регенерации.

Аннотация

Planarians, трематодами, которые являются чрезвычайно эффективными в регенерации. Они задолжают эта способность большое количество стволовых клеток, которые могут быстро реагировать на любой тип травмы. Общие травмы модели в этих животных удалить большое количество ткани, которая наносит ущерб несколько органов. Чтобы преодолеть этот ущерб широких тканей, мы описываем здесь метод для выборочного удаления единым органом, глотки, в Планарии Schmidtea mediterranea. Мы добиться этого путем замачивания животных в растворе, содержащие азид натрия ингибитором цитохрома-оксидазы. Кратковременного воздействия азид натрия вызывает выдавливания глотки от животного, которое мы называем «химическая ампутации.» Химические ампутации удаляет весь глотки и создает небольшую рану, где глотки придает кишечника. После ополаскивания обширные, ампутировали животные регенерировать полностью функциональный глотки в течение примерно одной недели. Стволовые клетки в остальной части тела диск регенерации новых глотки. Здесь, мы предоставляем подробный протокол для химических ампутации и описать гистологические и поведенческие методы для оценки успешных ампутации и регенерации.

Введение

Регенерация представляет собой явление, которое происходит во всем животном, с регенеративной емкостью от регенерации тела в некоторых беспозвоночных более ограниченной способности в позвоночных1. Замена функциональных тканей — это сложный процесс и часто влечет за собой одновременное восстановление нескольких типов клеток. Например для регенерации конечностей саламандра, остеобласты, хрящевые клетки, нейронов, мышц и эпителиальные клетки должны быть заменены2. Эти типы созданный клеток также должны быть организованы должным образом содействовать новой функции конечности. Понимание этих сложных процессов требует методов, которые сосредоточены на регенерации типов конкретных клеток и их интеграции в органы.

Одна из стратегий, используемых для упрощения изучение восстановительных реакций является целевой абляции либо определенные типы клеток или больших коллекций тканей. Например в данио рерио, выражение nitroreductase в типах конкретных клеток приводит к их разрушению после применения метронидазол3,4. В личинки дрозофилы выражения про apoptotic гены под ткани конкретных промоутеров может выборочно удалять конкретные регионы имагинальных дисков5,6. Оба из этих стратегий быстрого, но контролируемые повредить и были использованы для того чтобы рассечь молекулярных и клеточных механизмов, отвечающих за регенерацию.

В этой рукописи мы опишем способ выборочно удалять весь орган, называемый глотки в Планарии Schmidtea mediterranea. Planarians являются классической модели регенерации, известный для их плодовитый регенерационной способности, где даже минута фрагменты можно вырастить весь животных 7,8. Они имеют большой, гетерогенных население стволовых клеток, состоящий из плюрипотентных клеток и восходящей линии ограничена9,10,11. Эти клетки размножаются и дифференцировать для замены всех отсутствующих тканей, в том числе глотки, нервной, пищеварительной и выделительной систем и мышцы и эпителиальных клеток9,10,12. Хотя мы знаем, что эти стволовые клетки инициировать регенерации, мы не полностью понимаем молекулярные механизмы, которые управляют их заменить всех этих различных типов клеток. Определенных ранив методы, которые вызывают точные стволовых клеток ответов могут помочь определить этот сложный процесс.

Глотки большой, цилиндрические трубки, необходимых для кормления и содержит нейронов, мышцы, эпителиальных и секреторные клетки13,29. Обычно скрыты в чехле на вентральной стороне животного, он простирается через единый орган животного, открытие после зондирования присутствие пищи. Чтобы выборочно ампутировать глотки, мы замочить planarians в азид химических называется натрия, широко используемых анестетика в C. elegans14,,1516. Его использование в planarians впервые сообщили Адлер и др., в 2014 году12. В течение нескольких минут воздействия азид натрия planarians выдавливать их фарингит, и с нежным агитации, глотки отсоединяется от животного. Мы ссылаемся на этот полный и выборочный потери глотки как «химическая ампутации конечностей». Через одну неделю после ампутации, полностью функциональный глотки находится восстановленный12. Потому что глотки требуется для кормления, функциональных регенерации может измеряться путем мониторинга питания поведение. Ниже мы описываем протокол для химического ампутации и для оценки регенерации глотки и восстановления кормления поведение.

протокол

1. Подготовка

  1. Подготовка воды planaria 17
    1. Сохранить planarians в 1 X Montjuïc солевой раствор. Подготовить Планарии воды, сделайте индивидуальные запасов решения CaCl 1 М2, 1М MgSO4, 1 М MgCl2, 1М KCl и 5 М NaCl в ультрачистая вода. Фильтр стерилизации с длительного хранения бутылки Топ filterfor 0,2 мкм.
      Примечание: Используйте только сверхчистого деионизированную воду (с удельным сопротивлением 18.2 MΩ при 25 ° C) для подготовки Монжуик соли.
    2. Для приготовления 1 Л запас соли раствора 5 X, объедините 5 мл 1 М CaCl2, 5 мл 1 М MgSO4, 0,5 мл MgCl2, 0,5 мл хлористого калия и 1,6 мл растворов NaCl 5 М в 900 мл ультрачистая вода. Это решение добавьте 0,504 г NaHCO3 и перемешать, чтобы смесь. Отрегулируйте пэ-аш до 7.0 с соляной кислотой.
    3. Разбавляют этот 5 X Стоковый раствор 1 X рабочей концентрации в ультрачистая вода в стерильный контейнер например оплетенная бутыль большой емкости (см. Таблицу материалов). Используйте этот 1 X решение для поддержания бесполое planarians.
      Примечание: Как альтернатива раствор соли Монжуик, использовать локально приобрели родниковой воды или ультрачистая вода, содержащая коммерчески доступных аквариум соли смешивают (см. Таблицу материалы) в г/Л концентрации в of0.518.
    4. Для предотвращения бактериальной инфекции в статической культуры19, поддерживать planarians в воде, содержащей антибиотик. Подготовка 50 мг/мл, раствор гентамицина сульфата в ультрачистая вода и фильтр стерилизации. Для контейнеров, где поддерживаются животных добавьте гентамицина сульфат в конечной концентрации 50 мкг/мл (разбавления 1: 1000).
  2. Подготовка печени пасты
    1. Как planarians процветают на диете из органических, травы кормили говядиной печени, приобрести свежие печени и процесс в течение 24 ч. Удалите мембранное капсула, инкапсуляции печени с отшелушивающим осторожно. Нарезать кубиками ~ 1 см печени и используйте лезвия соскрести и отбросить все печеночных вен и артерий.
    2. Размачиваем печени куски с помощью мясорубку или кухонном комбайне и затем передать его через сетчатый фильтр питания проволоки. Объединить в кондитерские мешки, а обойтись в шприцы или Петри 35-мм. До кормления, центрифуга осторожно удалить пузырьки воздуха.
    3. Хранить аликвоты печени на-80 ° C до года и оттепели перед использованием. После оттаивания, повторно заблокировать любые остатки печени один раз, или хранить при 4 ° C до 24 ч.
  3. Содержание животных
    1. Planarians будет расти и уменьшаться для различных размеров в зависимости от частоты кормления. Кормите planarians каждую неделю (один раз каждые 14 дней). Для долгосрочной массовой культуры используйте пластиковые контейнеры различных размеров (см. Таблицу материалы).
    2. Кормить животных, используйте металлический шпатель или пипетки пластиковые передачи поставить горошину капля печени в коробке. Разрешить животных, чтобы поесть за 1-2 ч. удалить оставшиеся питания перед очисткой поле.
    3. Очистить червей дважды в неделю, если ФРС (один раз сразу после кормления и один раз в два дня спустя), или один раз в неделю, если не кормили. Для очистки, слейте воду в пластиковый стакан, тщательно выливание воды при сохранении planarians в поле. Протрите поверхность коробка с бумажным полотенцем, затем повторять со всех сторон до тех пор, пока поле является чистым.
    4. Замените воду (к приблизительно на ¾ объема поле) и добавить гентамицина в конечной концентрации 50 мкг/мл. Магазин животных в темный шкаф или в инкубаторе 20 ° C.
  4. Выбор червей
    1. Выберите червей, которые кормили до 5-7 дней.
      Примечание: Это значительно сложнее ампутировать фарингит от червей, которые недавно были накормлены (1-2 дня до ампутации). Кормили животных более чувствительны к азид натрия.
    2. Выберите червей, которые примерно 6 мм в длину. Чтобы оценить размер червя, передача его в чашку Петри с помощью пипетки пластиковые передачи. Место квартира 6 - в линейке или 5 x 5 мм Диаграммная бумага под чашку Петри и измерить длину червь во время обхода.
      Примечание: Черви, меньше, чем 6 мм в длину, более трудно ампутировать.
  5. Подготовка азид натрия
    1. Приготовляют раствор 100 мм путем растворения порошка азид натрия в planaria воде.
      ОСТОРОЖНОСТЬЮ: Азид натрия является токсичным и следует осторожно. Не выбрасывайте азид натрия в канализацию. После использования Соберите его отдельно для удаления опасных отходов.

2. глотки ампутации

  1. Место червей в 35-мм диаметр Петри. Тщательно удалите все Планарии воды из блюдо с помощью пипетки пластиковые передачи.
    Примечание: Максимум 20 6-мм червей могут быть удобно размещены в блюдо этого размера.
  2. Поместите блюдо под микроскопом и настроить масштаб так, что несколько червей можно просмотреть одновременно (например 10 крат). Замените Планарии воды раствором азид натрия 100 мм.
    Примечание: Для 35-мм Петри примерно 5 мл азид натрия является достаточным. Решение должно полностью погрузите planarians. Отрегулируйте громкость решение для больших блюд при необходимости.
  3. Мониторинг животных под микроскопом и воздерживаться от движущихся блюдо за первые 3-4 мин.
  4. Наблюдать за экструзии глотки через микроскоп; глотки торчат из глоточной сумке и полностью (около 1 мм в длину) как показано на рисунке 1B.
    Примечание: Важно, чтобы дождаться окончания глотки расширение полностью, прежде чем продолжить. После глотки возникает от животного, полное расширение занимает примерно 1 мин.
  5. Использование пипетки пластиковые передачи в шприц животных вокруг блюдо. Сосать животных в пипетки и принудительно выпустить их в блюдо пару раз. Если глотки полностью расширяется, этот энергичный закупорить приведет к его отсоединения.
  6. Кроме того понять глотки вертикально вдоль его длины, либо горизонтально вдоль его окружности, используя пару тонкой щипцов (см. Таблицу материалы), как показано на рисунке 1 c. С глотки ущипнул в щипцы Поднимите животное вверх к мениска. Как животное возникает, поверхностное натяжение приведет к глотки для отсоединения от животных.
    Примечание: Этот метод может использоваться для удаления фарингит мелких животных (1-3 мм в длину), где сильный закрученного не является адекватной. Избегайте тыкать или иным образом ранив тело животного.
  7. С помощью пипетки передачи, переместите ампутировали животных в новое блюдо, содержащий свежие planaria воды.
  8. После передачи, промойте ампутировали животных тщательно в planaria воде, полностью обмена воды три раза. Переезд в новое блюдо, содержащие planaria воду с 50µg/мл гентамицина.
    Примечание: Полный буфер обмена во время этих трех моет имеет важное значение для обеспечения удаления азид натрия.
  9. Следующий день, замените воду в блюдо свежей planaria водой, содержащей 50 мкг/мл гентамицина. Повторять каждый день после этого.

3. Оценка глотки удаления после ампутации

  1. Изучите животных под микроскопом (с 10-20 кратном) для определения, является ли тёмное пятно появилось после успешного удаления глотки, как показано на рисунке 2А.
  2. Кроме того, исправить и отбеливателя животных согласно протоколу, описываемого Пирсон и др. 20. животных замочить на ночь в 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) или дневно конъюгированных стрептавидина (1 мг/мл разбавленной 1: 500 в 1 X фосфатный Buffered, содержащие 0,3% Тритон-X). Смонтируйте животных на слайды в 80% glycerol/20% 1 X Buffered фосфатный и изображения под люминесцентные стереомикроскопом (рис. 2B).
    Примечание: Все изображения в этой рукописи были захвачены на флуоресцентные стереомикроскопом с 1.0 X цели.

4. Оценка глотки регенерации путем измерения кормление поведение

  1. Подготовка печени
    1. Перенос необходимое количество печени пасты в microcentrifuge или конической трубки. Спиновые кратко, чтобы удалить пузырьки воздуха. Рассчитайте объем печени, а затем добавьте воды planaria-1/5 его объема и 2% от общего объема в красный пищевой краситель. Например 1000 мкл печени пасты, добавить 200 мкл воды planaria и 24 мкл пищевого красителя.
    2. Использование пластиковых пестик, наконечник пипетки или металлической лопаткой, тщательно перемешивайте, до пищевой краситель распределяется равномерно в печени пасты. Спиновые снова кратко. Паштеты можно хранить при 4 ° C на 24 часа или замороженные в аликвоты на-80 ° C для длительного хранения.
    3. Если тестирование до 25 животных, готовить 25 мкл печени пасты на блюдо (примерно 1 мкл печени пасты на животное).
  2. Кормление животных
    1. Через семь дней после химического ампутации, передать новым Петри животных. Если тестирование 10-15 животных, используйте блюдо 35 мм; более чем 15 животных должны быть проверены в чашке Петри 60-мм. Держите животных в темноте, спокойно, около 1 часа до кормления.
    2. С помощью ножниц, увеличения ширины кончика пипетки Р200 путем обрезки примерно ½ см офф узкий конец. Накапайте 25 мкл красной пастой печени в блюдо.
      Примечание: Подрезка конца делает закупорить вязкой паштеты легче. Чтобы предотвратить плавает на поверхности печени, Сенсорный кончик в нижней части блюда во время отпуска.
    3. Разрешить животных кормить за 30 мин.
    4. Оценка количество животных, которые едят путем размещения животных на белом фоне или их изучения под микроскопом с 10-20 кратным увеличением.
    5. После кормления, удалите печени от блюдо и чистой.

Результаты

Подверженности азид натрия нарушает нормальной моторики planarians, вызывая животных, чтобы растянуть и корчиться. Эти движения силы глотки выйти из вентральной стороне животного, и после примерно в 6 минут в раствор азид натрия, можно увидеть белый кончик глотки (

Обсуждение

Этот протокол описывает метод выборочного уноса глотки с помощью азид натрия. Другие исследования целевых абляции в planarians использовали измененные хирургии для удаления фоторецепторов21 или медикаментозное лечение, чтобы удалять дофаминергические нейроны22. ?...

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить Алехандро Санчес Альварадо, который поддержал первоначальный оптимизации и развития этой техники. Работа в лаборатории Кэролин Adler поддерживается Корнельского университета начальных средств.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2)Fisher ChemicalC79-3Montjuïc salt solution
Magnesium Sulfate Anhydrous (MgSO4)Fisher ChemicalM65-3Montjuïc salt solution
Magnesium Chloride Hexahydrate (MgCl2)Acros/VWR41341-5000Montjuïc salt solution
Potassium Chloride (KCl)Acros Organics/VWR196770010Montjuïc salt solution
Sodium Chloride (NaCl)Acros Organics/VWR207790050Montjuïc salt solution
Sodium Bicarbonate (NaHCO3)Acros Organics/VWR123360010Montjuïc salt solution
Nalgene autoclavable polypropylene copolymer lowboy with spigotThermoFisher Scientific/VWR2324-0015Storing planaria water
Instant Ocean Sea SaltSpectrum BrandsAmazonPlanaria water
Gentamicin SulfateGemini Bio-products400-100PPlanaria water
Razor bladesElectron Microscopy Sciences71970Mincing liver 
Disposable pastry bags-16”, 12 packWiltonAmazonLiver aliquots
5 mL syringesBD/VWR309647Liver aliquots
Petri dishes-35mm/60mmGreiner Bio-One/VWR82050-536/82050-544
Plastic containers (various sizes)ZiplocAmazonHousing planarians in static culture
Sodium AzideSigmaS2002
Transfer pipetteGlobe Scientific138030
Forceps - Dumont Tweezer, Style 5Electron Microscopy Sciences 72700-D (0203-5-PO)
Triton X-100SigmaT8787
DAPI ThermoFisher62247
Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugateThermoFisherS11223
GlycerolFisher BioReagentsBP229-1

Ссылки

  1. Tanaka, E. M., Reddien, P. W. The cellular basis for animal regeneration. Dev. Cell. 21, 172-185 (2011).
  2. Tanaka, E. M. The Molecular and Cellular Choreography of Appendage Regeneration. Cell. 165, 1598-1608 (2016).
  3. Curado, S., Stainier, D. Y. R., Anderson, R. M. Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies. Nat. Protoc. 3, 948-954 (2008).
  4. White, D. T., Mumm, J. S. The nitroreductase system of inducible targeted ablation facilitates cell-specific regenerative studies in zebrafish. Methods. 62, 232-240 (2013).
  5. Smith-Bolton, R. K., Worley, M. I., Kanda, H., Hariharan, I. K. Regenerative growth in Drosophila imaginal discs is regulated by Wingless and Myc. Dev. Cell. 16, 797-809 (2009).
  6. Smith-Bolton, R. Drosophila Imaginal Discs as a Model of Epithelial Wound Repair and Regeneration. Adv. Wound Care. 5, 251-261 (2016).
  7. Newmark, P. A., Sánchez Alvarado, A. Not your father's planarian: a classic model enters the era of functional genomics. Nat. Rev. Genet. 3, 210-219 (2002).
  8. Reddien, P. W., Sánchez Alvarado, A. Fundamentals of planarian regeneration. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 20, 725-757 (2004).
  9. Wagner, D. E., Wang, I. E., Reddien, P. W. Clonogenic neoblasts are pluripotent adult stem cells that underlie planarian regeneration. Science. 332, 811-816 (2011).
  10. Scimone, M. L., Kravarik, K. M., Lapan, S. W., Reddien, P. W. Neoblast specialization in regeneration of the planarian Schmidtea mediterranea. Stem Cell Reports. 3, 339-352 (2014).
  11. van Wolfswinkel, J. C., Wagner, D. E., Reddien, P. W. Single-cell analysis reveals functionally distinct classes within the planarian stem cell compartment. Cell Stem Cell. 15, 326-339 (2014).
  12. Adler, C. E., Seidel, C. W., McKinney, S. A., Sánchez Alvarado, A. Selective amputation of the pharynx identifies a FoxA-dependent regeneration program in planaria. Elife. 3, e02238 (2014).
  13. Adler, C. E., Sánchez Alvarado, A. PHRED-1 is a divergent neurexin-1 homolog that organizes muscle fibers and patterns organs during regeneration. Dev. Biol. 427, 165-175 (2017).
  14. Wong, M. C., Martynovsky, M., Schwarzbauer, J. E. Analysis of cell migration using Caenorhabditis elegans as a model system. Methods Mol. Biol. 769, 233-247 (2011).
  15. Margie, O., Palmer, C., Chin-Sang, I. C elegans chemotaxis assay. J. Vis. Exp. , e50069 (2013).
  16. Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D. T., Bargmann, C. I., Avery, L. Laser microsurgery in Caenorhabditis elegans. Methods Cell Biol. 107, 177 (2012).
  17. Tasaki, J., Uchiyama-Tasaki, C., Rouhana, L. Analysis of Stem Cell Motility In Vivo Based on Immunodetection of Planarian Neoblasts and Tracing of BrdU-Labeled Cells After Partial Irradiation. Methods Mol. Biol. 1365, 323-338 (2016).
  18. Roberts-Galbraith, R. H., Brubacher, J. L., Newmark, P. A. A functional genomics screen in planarians reveals regulators of whole-brain regeneration. Elife. 5, (2016).
  19. Arnold, C. P., et al. Pathogenic shifts in endogenous microbiota impede tissue regeneration via distinct activation of TAK1/MKK/p38. Elife. 5, (2016).
  20. Pearson, B. J., et al. Formaldehyde-based whole-mount in situ hybridization method for planarians. Dev. Dyn. 238, 443-450 (2009).
  21. LoCascio, S. A., Lapan, S. W., Reddien, P. W. Eye Absence Does Not Regulate Planarian Stem Cells during Eye Regeneration. Dev. Cell. 40, 381-391 (2017).
  22. Nishimura, K., et al. Regeneration of dopaminergic neurons after 6-hydroxydopamine-induced lesion in planarian brain. J. Neurochem. 119, 1217-1231 (2011).
  23. Wilson, D. F., Chance, B. Azide inhibition of mitochondrial electron transport. I. The aerobic steady state of succinate oxidation. Biochim. Biophys. Acta. 131, 421-430 (1967).
  24. Duncan, H. M., Mackler, B. Electron Transport Systems of Yeast: III. Preparation and properties of cytochrome oxidase. J. Biol. Chem. 241, 1694-1697 (1966).
  25. Buchan, J. R., Yoon, J. H., Parker, R. Stress-specific composition, assembly and kinetics of stress granules in Saccharomyces cerevisiae. J. Cell Sci. 124, 228-239 (2011).
  26. Cebrià, F. Organization of the nervous system in the model planarian Schmidtea mediterranea: An immunocytochemical study. Neurosci. Res. 61, 375-384 (2008).
  27. Shimoyama, S., Inoue, T., Kashima, M., Agata, K. Multiple Neuropeptide-Coding Genes Involved in Planarian Pharynx Extension. Zoolog. Sci. 33, 311-319 (2016).
  28. Ito, H., Saito, Y., Watanabe, K., Orii, H. Epimorphic regeneration of the distal part of the planarian pharynx. Dev. Genes Evol. 211, 2-9 (2001).
  29. Bueno, D., Espinosa, L., Baguñà, J., Romero, R. Planarian pharynx regeneration in tail fragments monitored with cell-specific monoclonal antibodies. Dev. Genes Evol. 206, 425-434 (1997).
  30. Hyman, L. . The invertebrates: Platyhelminthes and Rhynchocoela, the acoelomate Bilateria. , (1951).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

133Planaria

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены