JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Эта рукопись демонстрирует истощение экспрессии генов в средняя таракан через пероральный прием двуцепочечные РНК, инкапсулированные в липосомах.

Аннотация

РНК-интерференции (RNAi) широко применяется для расчехлять биологические функции многочисленных генов и было предусмотрено как управления эксплуатации инструмент вредителей путем нарушения экспрессии важно генов. Хотя различные методы, такие как инъекции, кормления и замачивания, были зарегистрированы для успешной доставки двуцепочечной РНК (dsRNA), эффективность RNAi путем перорального двуцепочечной ДНК сильно варьируется среди различных групп насекомых. Таракан, германский Blattella, очень чувствительна к инъекции двуцепочечной ДНК, как показано во многих исследованиях, опубликованных ранее. Настоящее исследование описывает метод продемонстрировать, что малым интерферирующим РНК, инкапсулированный с липосомами перевозчиков достаточно, чтобы замедлить деградацию двуцепочечной ДНК, средняя сок. Примечательно непрерывное питание двуцепочечной ДНК, инкапсулированные в липосомах значительно уменьшает выражение тубулина в средняя и привело к смерти тараканов. В заключение разработки и использования lipoplexes двуцепочечной ДНК, которые защищают dsRNA против nucleases, может быть практического использования РНК-интерференции для насекомых-вредителей управления в будущем.

Введение

RNAi продемонстрировал как эффективный метод для экспрессии генов нокдаун через механизм post-transcriptional глушителей пути, вызванные молекулы двуцепочечной ДНК многих эукариот1. В последнее десятилетие исследования RNAi стал полезным инструментом для изучения функций генов от разработки поведение истощения экспрессию конкретных генов через инъекции и/или кормления двуцепочечной ДНК в различные Таксоны насекомых2,3. Ввиду специфики и надежности разрушающих эффекта применение РНК-интерференции в настоящее время рассматривается как потенциальной стратегии для вредителей контроля управления4,5. Однако эффективность RNAi варьируется между видов насекомых, в зависимости от различных генов мишенью и методы доставки. Растущее количество доказательств свидетельствует о том, что нестабильность малым интерферирующим РНК, которая разлагается рибонуклеаз, является решающим фактором в ограниченной эффективности RNAi5,6. К примеру низкая чувствительность RNAi в Мандука sexta объясняется тот факт, что малым интерферирующим РНК, смешанного с гемолимфа быстро деградировавших в течение 1 часа7. Аналогичным образом наличие щелочной nucleases в средняя, которые эффективно снизить попадает малым интерферирующим РНК, сильно коррелирует с низкой эффективностью RNAi в различных насекомых заказы8,9,10.

Устные доставка двуцепочечной ДНК особенно интересен для применения RNAi в стратегию контроля вредителей, но задержать деградации двуцепочечной ДНК, nucleases в средняя не еще не разработан метод, который будет иметь потенциал для обеспечения эффективного RNAi через питание. Однако кормление большое количество двуцепочечной ДНК, например 50 мкг в Тутовый шелкопряд, или постоянно кормления на 8 дней (8 мкг двуцепочечной ДНК в общей сложности) в видов саранчи поступили зависания РНК-интерференции для перорального двуцепочечной ДНК. Таракан, Blattella germinica, очень чувствительна к RNAi путем инъекций dsRNA11,12,13,14, но не реагировать двуцепочечной ДНК через питание. Недавно, Линь и др. (2017) продемонстрировали двуцепочечной ДНК инкапсулированный с липосомами перевозчиков приводит к успешной RNAi в нокдаун экспрессии генов α-тубулина в средняя и вызвать значительные смертности таракан15. Как деградация двуцепочечной ДНК в средняя является ограничивающим фактором для устного интерференции, липосомы перевозчиков служат транспортное средство для защиты от деградации, которая легко применима в других насекомых, с сильным нуклеиназы мероприятий в кишечнике двуцепочечной ДНК. Записки, причина для выбора конкретного трансфекции реагента (см. Таблицу материалы) мы использовали как липосом перевозчик в текущий протокол является, что она была протестирована на насекомых клеток линии трансфекции с менее токсичности, согласно инструкциями производителя. По словам сравнение различных липосом трансфекции систем в Гарави et al. (2013) 16, эффективность transfecting малые интерферирующие РНК (siRNA) составляет примерно то же самое между этой и других коммерчески доступных систем, которые были использованы для систем доставки двуцепочечной ДНК в других насекомых17,18 . Кроме того наш метод кормления достаточно внимательны обеспечить правильное количество dsRNA заглатывается каждой таракана, и что результаты являются надежными и подтверждено. Таким образом настоящий протокол и результаты показывают, что использование lipoplexes двуцепочечной ДНК улучшает стабильность двуцепочечной ДНК и открывает дверь к разработке стратегии устные доставки РНК-интерференции, который является перспективный подход для борьбы с вредителями в будущем.

протокол

1. Синтез и подготовка двуцепочечной ДНК

  1. Определите сайты целевой двуцепочечной ДНК в 3' непереведенные регионе генов-мишеней. DsTub используется для ориентации α-тубулина (ванна) гена (GenBank присоединения число: KX228233), и dsEGFP как отрицательный dsRNA управления разработан из последовательности зеленый флуоресцирование белками (EGFP; GenBank присоединения число: LC311024).
  2. Выполнение стандартных амплификации PCR для синтеза dsRNA шаблоны с ген специфические праймеры, содержащий последовательность промоутер T7 (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'). Условия PCR амплификация и грунтовка сведения, используемые являются те сообщили, Линь и др. (2017) 12 (см. Таблицу материалы).
  3. Приступить к подготовке двуцепочечной ДНК с помощью транскрипции T7 Kit (см. Таблицу материалы), следуя инструкциям производителя.
    Примечание: Приносить высокое количество двуцепочечной ДНК, смешивать две реакции в одной трубе (в целом 40 мкл), и инкубировать и при 37 ° C на ночь.
  4. 2 мкл DNase (см. Таблицу материалы) в двуцепочечной ДНК образцов для 15 минут при 37 ° C дайджест ДНК шаблоны.
  5. Добавить 200 мкл Реагента извлечения (см. Таблицу материалы) и 40 мкл хлороформ, затем вихря.
  6. Центрифуга для 10 мин на 13 000 x g при 4 ° C, а затем собирать супернатант (150 мкл) в новые пробки microcentrifuge.
  7. Осадок двуцепочечной ДНК путем добавления 150 мкл изопропиловый спирт и инкубации 15 мин на льду.
  8. Центрифуга для 15 мин на 13 000 x g при 4 ° C, а затем удалить супернатант.
  9. 200 мкл 70% этанола мыть dsRNA окатышей. Центрифуги для 10 мин на 13 000 x g при 4 ° C.
  10. Удаление этанола и повторите шаги мыть этанола.
  11. Удалите этанола и сухой dsRNA Пелле, вакуумные концентраторы центробежные 3 мин, затем Ресуспензируйте двуцепочечной ДНК с РНКазы свободной воды.
  12. Определить количество очищенной двуцепочечной ДНК с помощью микро объем Спектрофотометр UV-Vis (см. Таблицу материалы) согласно инструкциям изготовителя и приспособиться к желаемой концентрации (например, 0,25 мкг/мкл для подготовки lipoplexes двуцепочечной ДНК).
  13. Храните образцы двуцепочечной ДНК при-20 ° C до 3 месяцев.

2. Подготовка двуцепочечной ДНК Lipoplexes

  1. Разбавить 4 мкл Реагента трансфекции (см. Таблицу материалы), добавив 4 мкл 5% раствора глюкозы. Разбавьте 4 мкл двуцепочечной ДНК (1 мкг) путем добавления 4 мкл 5% раствора глюкозы.
  2. Добавьте решение реагент разреженных липосом сразу в разреженных dsRNA решение все сразу. Вихревой кратко, чтобы смешивать их, а затем Инкубируйте 15 мин при температуре 25 ° C.
    Примечание: Не следует смешивать решения в обратном порядке.
  3. Lipoplexes двуцепочечной готовы к использованию. Использовать в течение 1 часа подготовки и выбросьте после 1 час.
    Примечание: Согласно инструкциям производителя lipoplexes должны использоваться как можно скорее.

3. сбор внеклеточные ферменты от гемолимфа и средняя сок

  1. Насекомых физиологическим буфера (10 x акций)
    1. Смешать 900 мл двойной дистиллированной воды с 109,3 г NaCl, 15,7 г KCl, 6,3 g CaCl2и 8.3 g MgCl2·6H2O.
    2. Отрегулируйте пэ-аш до 6,8 и заполнить до 1000 мл.
  2. Гемолимфа коллекция
    1. Анестезировать тараканов на льду, до тех пор, пока они не двигаться на 3 мин.
    2. Держите таракан с двух пальцев (большим и указательным пальцем) и поверните вентральной стороне таракана.
    3. Используйте рассечения ножницами отрезать кончик coxa заднюю ногу.
      Примечание: Вырежьте подключенных пересечение между coxa и вертела. Иссечение с другой частью coxa был менее эффективным для сбора гемолимфа.
    4. Сожмите живота мягко с средним пальцем и собирать гемолимфа, кровотечение из разрез с микропипеткой 10 мкл.
    5. Бильярд гемолимфа от нескольких тараканов (5 человек) в пробки microcentrifuge.
      Примечание: Держите microcentrifuge трубы на льду для предотвращения melanization. Средний объем гемолимфа, полученные из мужской таракан-2-3 мкл.
    6. Закрутка вниз гемолимфа кратко с настольная центрифуга для 10 s.
    7. Перевести желаемый объем гемолимфа (т.е., 10 мкл) и смешайте его с 50 мкл 1 x насекомых физиологическим буфера.
    8. Центрифуги для 10 мин на 1000 x g при 4 ° C на спину вниз hemocytes. Передача супернатант в чистой microcentrifuge трубку.
    9. Количественного определения концентрации общего белка, используя Спектрофотометр UV-Vis микро Тома путем измерения A28015.
    10. Настройте каждый образец, чтобы иметь такой же концентрации белка (6 мг/мкл общего белка).
  3. Средняя сок коллекции
    1. Анестезировать тараканов на льду. Починить тараканов вентральной стороне на пластину диссекции с холодной 1 x насекомых физиологическим буфера с помощью насекомых булавки.
    2. Вскрыть живот с тонкой пинцетом. Удалите весь кишечник (включая фронт, в середине и задняя кишка) свежие блюдо с 1 x насекомых физиологическим буфера.
    3. Удаление передней и задней кишки и быстро передавать microcentrifuge трубки, содержащей 100 мкл насекомых буфер солевой средняя.
    4. Бассейн midguts из шести тараканов в же трубки и вихрь для 10 s.
    5. Центрифуги для 10 мин на 1000 x g при 4 ° C до спин вниз по hemocytes и кишечнике тканей. Передача супернатант в чистой microcentrifuge трубку.
    6. Количественного определения концентрации общего белка, используя Спектрофотометр UV-Vis микро Тома путем измерения A28015.
    7. Настройте каждый образец, чтобы иметь такой же концентрации белка (6 мг/мкл общего белка).

4. dsRNA деградации Assay

  1. Свеже Подготовьте 4 мкл голый двуцепочечной ДНК или РНК lipoplexes (1 мкг).
  2. Смешайте сок dsRNA ферментов решения с 10 мкл насекомых физиологическим буфера (контроль), извлеченные из гемолимфа, или средняя.
  3. 2 мкл EGTA (20 мм) или РНКазы свободной воды, чтобы отделить образцы как элементы управления для ингибирования фермента деятельности.
  4. Инкубировать 1 час или больше времени (6, 12 или 24 часа) при 25 ° C.
  5. Добавьте 200 мкл Реагента добычи и 40 мкл хлороформ, затем вихря.
  6. Центрифуга для 10 мин на 13 000 x g при 4 ° C, а затем собирать супернатант (150 мкл) в новые пробки microcentrifuge.
  7. Осадок двуцепочечной ДНК путем добавления 150 мкл изопропиловый спирт и инкубации 15 мин на льду.
  8. Центрифуга для 15 мин на 13 000 x g при 4 ° C, а затем удалить супернатант.
  9. 200 мкл 70% этанола мыть dsRNA окатышей. Центрифуги для 10 мин на 13 000 x g при 4 ° C.
  10. Удаление этанола и повторите шаги мыть этанола.
  11. Удаление этанола и сухой dsRNA Пелле, вакуумные концентраторы центробежные для 3 мин Ресуспензируйте двуцепочечной ДНК с 10 мкл РНКазы свободной воды.
  12. Проверка целостности обработанных двуцепочечной ДНК через гель-электрофорез геля агарозы 1,5%.

5. оральном двуцепочечной ДНК

  1. Сохранить тараканов на ad libitum диете сухой пищи (собака Чоу). Лишить водоснабжения от тараканов за один день до dsRNA заглатывания экспериментов.
  2. Держите таракан, захватывая ее крылья с гибким щипцами (рис. 1, Шаг 5).
    Примечание: Не захватить части тела тараканов.
  3. Подготовьте lipoplexes двуцепочечной ДНК, а также голые двуцепочечной ДНК, для кормления, как описано в разделе 2.
    Примечание: Lipoplexes двуцепочечной ДНК должен быть подготовлен свежезаваренным перед кормлением.
  4. Канал 4 мкл lipoplexes двуцепочечной ДНК или голый двуцепочечной ДНК (250 нг) с микропипеткой.
  5. Медленно накапайте капли раствора dsRNA близко к ротовые тараканы и пусть тараканов глотать капли полностью.
  6. Выполнение заглатывания экспериментов дважды в день (1 ч после огни на и 1 ч до выключенным) 8 дней или 16 дней непрерывно.
    Примечание: Все тараканов приобрела воду только через ручной подачей с двуцепочечной решения или управления реагенты (например, нуклеиназы свободной воды, раствор глюкозы и липосомами реагент) во время приема экспериментов.
  7. После 16 дней приема dsRNA экспериментов предоставлять тараканов бутылки воды.

6. оценить нокдаун

  1. В выбранное время очков (2, 9 и 17 дней после dsRNA заглатывания пробирного), собирать лечение dsEGFP и dsTub насекомых и вскрыть выбранной ткани (например, средняя).
  2. Выполните количественную ПЦР в реальном времени (qRT ПЦР). Условия qRT-PCR амплификация и грунтовка информацию как сообщает Линь и др. (2017) 12.
  3. Оценки управления и малым интерферирующим РНК лечение насекомых ежедневно, чтобы проверить смертности и удалить тараканов, которые больше не перемещаются.

Результаты

Упрощенная схема протокола для перорального dsRNA представлена в Рисунок 1, где указаны ключевые шаги для подготовки lipoplexes двуцепочечной ДНК.

Для того, чтобы исследовать защиты перевозчиками липосом после деградации дву?...

Обсуждение

Этот протокол представляет метод для эффективного RNAi путем перорального двуцепочечной ДНК lipoplexes, связанных с защитой против рибонуклеазы переваривания в соке средняя таракан. Как показано в других исследованиях в различных видов насекомых, бедных RNAi эффект путем перорального dsRNA гла?...

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Это исследование было поддержано грантов из Тайваня (Министерство науки и технологии, наиболее 100-2923-B-002-002-MY3 и 106-2313-B-002-011-MY3 H.J.L.), Чешская Республика (Грант агентство Южно-чешский университет, GAJU Y.H.L предоставить 065/2017/P) и Испанию ( Испанского министерства экономики и конкурентоспособности, предоставляет CGL2012-36251 и CGL2015-64727-P X.B. и каталонского правительства, грант 2014 SGR 619 до X.B.); Он также получил финансовую поддержку от Европейского фонда для экономического и регионального развития (ФЕДЕР фонды для X.B.).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
GenJe Plus DNA in vitro Transfection reagentSignaGenSL100499for lipoplexes preparation
Blend Taq plusTOYOBO BTQ-201for PCR
Fast SYBR Green Master MixABI 4385612for qPCR
FirstChoice RLM-RACE KitInvitrogenAM1700for 3' UTR identification 
MEGAscript T7 Transcription KitInvitrogenAMB13345for dsRNA synthesis
TURBO DNaseInvitrogenAM2239remove DNA template from dsRNA
TRIzolInvitrogen15596018for dsRNA or total RNA extraction
RQ1 RNase-Free DnasePromegaM6101remove DNA template from total RNA 
chloroform Sigma-AldrichC2432for dsRNA or total RNA extraction
2-PropanolSigma-AldrichI9516for dsRNA or total RNA extraction
ethanolSigma-Aldrich24102for dsRNA or total RNA extraction
Diethyl pyrocarbonate, DEPCSigma-AldrichD5758for RNase free water preparation
glucose solutionSigma-AldrichG3285for lipoplexes preparation
Sodium chloride, NaClSigma-AldrichS7653insect saline buffer formula
Potassium chloride, KClSigma-AldrichP9333insect saline buffer formula
Calcium chloride, CaCl2Sigma-AldrichC1016insect saline buffer formula
Magnesium chloride hexahydrate, MgCl2.6H2OSigma-AldrichM2670insect saline buffer formula
EGTA Sigma-AldrichE3889enzyme inhibitor 
dissecting scissorF.S.T.cockroach dissection
fine tweezersF.S.T.cockroach dissection
flexible tweezerF.S.T.cockroach holding 
pipetmanRAININP10sample preparation
microcentrifuge tubeAxygenMCT175C, PCR02Csample preparation
pipette tip Axygensample preparation
vortexterDigisystemvm1000sample preparation
Minispin centrifugeThe Gruffin GroupGMC 206for liquid spin down 
CentrifugeALCPK121Rsample preparation
pH meter JENCO6071for pH adjust
micro-volume spectrophotometerQuawellQ3000nucleic acid quantitative
PCR Thermal cyclerABI 2720for template PCR or  dsRNA synthesis incubation 
quantitative real-time PCRABI StepOne plusgene expression quantitative
Centrifugal Vacuum Concentratorseppendorf5301for dsRNA or total RNA extraction
Multipette eppendorfxstreamfor real-time PCR sample loading 
Agarose Iamresco0710for nucleic acid electrophoresis
tub gene specfifc forward preimertri-I biotechGGG ACA AGC CGG AGT GCA GA
tub gene specfifc reverse preimertri-I biotechTCC TGC TCC TGT CTC GCT GA
dsTub template forward primertri-I biotechTAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAA GCC GGA GTG CAG 
dsTub template reverse primertri-I biotechTAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT CCT GCT CCT GTC TCG CTG 
dsEGFP template forward preimertri-I biotechTAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT ATG GTG AGC AAG GGC GAG GAG
dsEGFP template reverse preimertri-I biotechTAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT GGC GGA TCT TGA AGT TCA CC
tub qPCR forward primertri-I biotechGGA CCG CAT CAG GAA ACT GGC
tub qPCR reverse preimertri-I biotechCCA CAG ACA GCC TCT CCA TGA GC
ef1 qPCR forward primertri-I biotechCGC TTG AGG AAA TCA AGA AGG A
ef1 qPCRreverse preimertri-I biotechCCT GCA GAG GAA GAC GAA G

Ссылки

  1. Hammond, S. M. Dicing and slicing: The core machinery of the RNA interference pathway. FEBS Lett. 579, 5822-5829 (2005).
  2. Bellés, X. Beyond drosophila: RNAi in vivo and functional genomics in insects. Annu. Rev. Entomol. 55, 111-128 (2010).
  3. Wynant, N., Santos, D., Vanden Broeck, J., Jeon, K. W. Chapter Five - Biological Mechanisms Determining the Success of RNA Interference in Insects. International Review of Cell and Molecular Biology. 312, 139-167 (2014).
  4. San Miguel, K., Scott, J. G. The next generation of insecticides: dsRNA is stable as a foliar-applied insecticide. Pest Manag. Sci. 72, 801-809 (2016).
  5. Scott, J. G., et al. Towards the elements of successful insect RNAi. J. Insect Physiol. 59, 1212-1221 (2013).
  6. Joga, M. R., Zotti, M. J., Smagghe, G., Christiaens, O. RNAi efficiency, systemic properties, and novel delivery methods for pest insect control: What we know so far. Front. Physiol. 7, (2016).
  7. Garbutt, J. S., Bellés, X., Richards, E. H., Reynolds, S. E. Persistence of double-stranded RNA in insect hemolymph as a potential determiner of RNA interference success: Evidence from Manduca sexta and Blattella germanica. J. Insect Physiol. 59, 171-178 (2013).
  8. Arimatsu, Y., Kotani, E., Sugimura, Y., Furusawa, T. Molecular characterization of a cDNA encoding extracellular dsRNase and its expression in the silkworm, Bombyx mori. Insect Biochem. Mol. Biol. 37, 176-183 (2007).
  9. Wang, K., et al. Variation in RNAi efficacy among insect species is attributable to dsRNA degradation in vivo. Insect Biochem. Mol. Biol. 77, 1-9 (2016).
  10. Wynant, N., et al. Identification, functional characterization and phylogenetic analysis of double stranded RNA degrading enzymes present in the gut of the desert locust, Schistocerca gregaria. Insect Biochem. Mol. Biol. 46, 1-8 (2014).
  11. Huang, J. -. H., Belles, X., Lee, H. -. J. Functional characterization of hypertrehalosemic hormone receptor in relation to hemolymph trehalose and to oxidative stress in the cockroach Blattella germanica. Exp. Endocrinol. 2, 114 (2012).
  12. Lin, Y. -. H., Lee, C. -. M., Huang, J. -. H., Lee, H. -. J. Circadian regulation of permethrin susceptibility by glutathione S-transferase (BgGSTD1) in the German cockroach (Blattella germanica). J. Insect Physiol. 65, 45-50 (2014).
  13. Lozano, J., Kayukawa, T., Shinoda, T., Belles, X. A role for taiman in insect metamorphosis. PLOS Genet. 10, 1004769 (2014).
  14. Lozano, J., Montañez, R., Belles, X. MiR-2 family regulates insect metamorphosis by controlling the juvenile hormone signaling pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. 112, 3740-3745 (2015).
  15. Lin, Y. -. H., Huang, J. -. H., Liu, Y., Belles, X., Lee, H. -. J. Oral delivery of dsRNA lipoplexes to German cockroach protects dsRNA from degradation and induces RNAi response. Pest Manag. Sci. 73, 960-966 (2017).
  16. Gharavi, J., et al. Chiral cationic polyamines for chiral microcapsules and siRNA delivery. Bioorg. Med. Chem. Lett. 23, 5919-5922 (2013).
  17. Whyard, S., Singh, A. D., Wong, S. Ingested double-stranded RNAs can act as species-specific insecticides. Insect Biochem. Mol. Biol. 39, 824-832 (2009).
  18. Luo, Y., et al. Differential responses of migratory locusts to systemic RNA interference via double-stranded RNA injection and feeding. Insect Mol. Biol. 22, 574-583 (2013).
  19. Liu, J., Smagghe, G., Swevers, L. Transcriptional response of BmToll9-1 and RNAi machinery genes to exogenous dsRNA in the midgut of Bombyx mori. J. Insect Physiol. 59, 646-654 (2013).
  20. Airs, P. M., Bartholomay, L. C. RNA interference for mosquito and mosquito-borne disease control. Insects. 8, 4 (2017).
  21. Taning, C. N. T., et al. Oral RNAi to control Drosophila suzukii: Laboratory testing against larval and adult stages. J. Pest Sci. 89, 803-814 (2016).
  22. Wu, S. Y., McMillan, N. A. J. Lipidic systems for in vivo siRNA delivery. AAPS J. 11, 639-652 (2009).
  23. Tam, Y. Y. C., Chen, S., Cullis, P. R. Advances in lipid nanoparticles for siRNA delivery. Pharmaceutics. 5, 498-507 (2013).
  24. Xia, Y., Tian, J., Chen, X. Effect of surface properties on liposomal siRNA delivery. Biomaterials. 79, 56-68 (2016).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

135Blattella

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены