ТРИФОСФАТЫ опосредованной реорганизация структуры хроматина цикла

Резюме

Хроматин цикла играет значительную роль в регуляции генов; Однако были не технологических достижений, которые позволяют для селективного и обратимые изменения хроматина петель. Здесь мы описываем мощную систему для повторной организации хроматина цикла с помощью ТРИФОСФАТЫ dCas9 (CLOuD9), продемонстрировал избирательно и обратимо модуляции экспрессии генов в целевых локусов.

Аннотация

Недавние исследования показали, ясно, что на большие расстояния, трехмерные хроматина, цикл взаимодействия играть значительную роль в регуляции экспрессии генов, но ли цикл отвечает за или в результате изменения в экспрессии генов равно неизвестно. До недавнего времени, как хроматина цикл влияет на регулирование активности генов и клеточную функцию был довольно неоднозначной, и ограничения в существующие методы для манипулирования эти структуры не позволяют углубленное изучение этих взаимодействий. Чтобы устранить эту неопределенность, мы инженерии метод для селективного и обратимым хроматина цикл повторной организации с помощью ТРИФОСФАТЫ dCas9 (CLOuD9). Динамизм CLOuD9 системы была продемонстрирована успешной локализации CLOuD9 конструкций целевой геномной локусов для модуляции местных хроматина конформации. Важно отметить, что подтверждено также возможность обратить вспять индуцированных контакт и восстановления конформации эндогенного хроматина. Модуляции экспрессии генов с помощью этого метода устанавливает способности регулировать экспрессию клеточных генов и подчеркивает огромный потенциал для применения этой технологии в создании стабильной de novo хроматина петли, которые существенно влияют на ген выражение в контексте рака и развития.

Введение

Отношения между хроматина, складывающиеся в ядре и конкретные организации генома собрала значительный интерес в последние годы, как было показано, быть тесно связан с ген выражение^1,2. Хотя точные отношения между генной активности и модуляции структуры хроматина остается неясным, было предположить, что взаимодействия между хромосомной контактов в результате динамический трехмерный хроматина Организации служат Джин регуляционная функция³. Действительно такой эффект хорошо продемонстрирована на Локус гена глобина человека, где локус контроля региона (LCR) регулирует активность генов Глобин развивающих определенным образом, создавая петлю хроматина между двумя регионами⁴. Однако в этом и других регионах, он мутноват ли цикл хроматина причиной или следствием изменения в экспрессии генов.

До сих пор остаются нерешенными проблемы в изучении этого явления. Например другие попытки заставить хроматина петли участие изменения в линейной последовательности ДНК или сложных процедур, требующих обилие фоновых знаний по конкретным элементам, которые облегчают цикл^5,,^{6, 7,8}. Кроме того в то время как предыдущие работы предположил, что хроматина петли диск экспрессии генов в контексте конкретных и ограниченных^7,8, уровень, на котором хроматина цикл влияет на транскрипции глобально является неопределенным. Хотя постоянно в последние годы вырос интерес в воздействии долгосрочных циклов на экспрессию генов, сохраняются нерешенные вопросы о создании и сохранении хроматина контактов для изменения активности гена.

Технологии, которые мы инженерии использует нуклеиназы кластерных регулярно interspaced короткие палиндром повторяется (ТРИФОСФАТЫ) - ТРИФОСФАТЫ - связанные протеина 9 (dCas9), для широко применимым таргетинга любой геномной локусов⁹. Эта технология исключает сложные вопросы, связанные с внесением изменений в линейной последовательности ДНК и доступен без существенных предварительных знаний о конкретных циклов компонентов. Прежде всего этот инструмент является универсальным и широко применимые к петли хроматина, признается в области развития, а также различных заболеваний, таких как рак. Доказывается, что власть CLOuD9 обратимого изменения структуры петли для эффективно модуляции экспрессии генов.

протокол

1. gRNA дизайн

1. Выберите стандартный gRNA дизайн инструмент для разработки руководство РНК¹⁰. Использование дополнительных пар ранее разработанной конструкции CLOuD9⁹ (то есть, по крайней мере 1 S. aureus (CSA) и 1 S. pyogenes (CSP) построить) для каждого эксперимента.
   1. В пределах выбранной онлайн дизайн инструмента, используйте Protospacer прилегающие мотив (PAM) последовательность «Нг» Руководство длиной 20 bp для CSP и PAM последовательности «NNGRRT» с руководством длиной 21 для CSA.
   2. Выбрать руководства, основанные на специфике Оценка и руководства на обеих стренгах максимизировать шансы получения рабочей руководство по проектированию.
   3. Заказать 2 олигонуклеотиды за руководство от производителя oligo: для вперед oligo, добавить «caccg» до 5' конца руководство последовательности и для обратного oligo, добавить «aaac» до «c» к концу 3' и ' конец 5 перед заказом.
2. Первоначально дизайн оформления 3-5 для каждого региона интерес, распространение над 250-1000 bp региона. Оценить gRNA ориентации эффективность следующим образом:
   1. Клон определены оформления в активной Cas9 плазмиду (см. шаг 3) и временно transfect в 293T клетки (см. шаг 4)¹¹.
   2. Рост клеток для 2-3 d в Дульбекко изменение Eagle среднего (DMEM) с 10% плода бычьим сывороточным (ФБС) и 1% пенициллин стрептомицином (ручка стрептококк), а затем урожай и извлечь геномной ДНК¹².
   3. Усилить целевых регионах полимеразной цепной реакции (ПЦР). Запуск продуктов на 1,5% агарозном геле и очистить соответствующие полосы.
   4. Выполните пробирного эндонуклеазы T7, как описано в Гущин, и др. протокол^13,14.
      Примечание: Эффективного руководства являются те решимости сократить ДНК на целевом сайте.

2. клеточная культура

1. Сохранить клетки в здоровой и активно деления государства.
   1. Для K562s, культура в Розуэлле парк Мемориальный институт (RPMI) 1640 СМИ с FBS и 1% перо стрептококк 10%.
      1. Растут K562s в колбе скошенный шеи² 25 см для обслуживания и отрегулировать плотность клеток до 400 000 клеток / мл каждый день.
      2. После K562s были преобразованы с CLOuD9 конструкции, добавить 2 мкг/мл puromycin и 100 мкг/мл hygromycin для обслуживания средств массовой информации.
   2. Для 293Ts, культура в Дульбекко изменение Eagle среднего (DMEM) с FBS и 1% перо стрептококк 10%.
      1. Растут 293Ts в 10 см² пластины и разделить когда вырожденная.

3. плазмида подготовка и gRNA вставки¹⁵

Примечание: Плазмида карты доступны в приложении и праймеры, используемых в экспериментах пример доступны в дополнительной таблице 1.

1. Смешайте 5 мкг лентивирусные ТРИФОСФАТЫ плазмида с 3 мкл BsmBI, 3 мкл щелочной фосфатазы, 6 мкл 10 x буфер и 0,6 мкл свежеприготовленные 100 мм DTT. Довести объем до 60 мкл с ddH₂O и инкубировать при 37 ° C за 30 минут, чтобы переварить и dephosphorylate плазмиды.
2. Гель Очистить переваривается плазмида и элюировать ddH₂O.
3. Смешайте 1 мкл каждого из парных гидов на 100 мкм с 1 мкл 10 x буфер лигирование T4, 6,5 мкл ddH₂O и 0,5 мкл T4 ПНК, чтобы достичь 10 мкл общий объем. Инкубировать при 37 ° C в течение 30 мин, затем 95 ° C за 5 мин, затем наращиваться до 25 C ° на 5 ° C/мин.
   Примечание: Это будет отжига пара направляющих.
4. Разбавьте 1: 200 отожженная направляющие (от шага 3.3) в ddH₂O.
5. Смешайте 1 мкл переваривается плазмида с шагом 3.2 с 0.5 мкл разбавленного перевязаны гидов из шага 3.4, 2,5 мкл 2 x буфер, 1 мкл ddH₂O и 0,5 мкл лигаза, чтобы сделать 5.5 мкл общая реакция. Инкубируйте это при комнатной температуре за 10 мин до перевязать направляющие плазмида BsmBI переваривается.
6. Превратить недавно перевязаны плазмида с шагом 3.5 в Stbl3 бактерий и усилить с помощью любого метода подготовки плазмиды.

4. Лентивирусы производство

1. Всего 750 000 293T клеток на хорошо для шести ну пластины с помощью Горяева и семян их в среде DMEM с FBS и 1% перо стрептококк 10%. Использование одной скважиной для каждой конструкции.
2. 24 ч после посева, изменить СМИ на свежие DMEM антибиотик свободный с 10% FBS.
3. В одной из труб разбавляют 11 мкл Реагента липидных трансфекции с 150 мкл OptiMEM среды, в реакции¹¹.
4. В отдельном трубку развести 2 мкг CLOuD9 лентивирусные вектор плазмиды от шаг 3,6, 0,35 мкг pMDLg/pRRE, 1 мкг pRSV-Rev и 0,65 мкг pMD2.G с 150 мкл OptiMEM среды, в реакции¹¹.
5. Для каждой реакции добавьте смеси разреженных лентивирусные плазмида разреженных липидных трансфекции реагента в соотношении 1:1 и проинкубируйте 5 мин¹¹.
6. Добавьте весь объем каждого смешанных комплекс из шага 4.5 в соответствующих скважины антибиотик бесплатная 293T клеток из шага 4.2.
7. 48 ч позже, собирать вирусный производства СМИ, дозирование в свежий трубки и спин вниз на 300 g x 5 мин. После центрифугирования переместите супернатант свежие трубки для удаления остатков клеток мусора.
8. Сразу использовать вирусный производства СМИ для трансдукции клеток-мишеней или заморозить при температуре-80 ° C для использования в будущем.

5. человека трансдукции клеток

1. Добавьте 250 мкл каждого вирусный конструкции интерес (состоит из взаимодополняющих CLOuD9 плазмид) 15 мл конические трубка, содержащая 80000 клетки для CLOuD9 приложения.
2. Довести общий объем средств массовой информации в каждом коническая 1 мл с антибиотиками свободных СМИ и добавить Полибрен в конечной концентрации 1-8 мкг/мл (максимальная концентрация Полибрен допускается использовать тип ячейки нужно будет определить экспериментально).
3. Спиновые клетки на 800 x г за 30 мин при комнатной температуре, затем Ресуспензируйте, закупорить без удаления вирусный супернатант. Перемещение всей ячейки подвеска к пластине культуры клеток.
4. 24 ч после трансдукции, клетки спин вниз на 300 g x 5 мин при комнатной температуре.
5. Аспирационная вирусный супернатант и Ресуспензируйте клетки в регулярные клетки культуры средств массовой информации.
6. На следующий день добавьте puromycin (1 мкг/мл для 293T клеток) и hygromycin (25 мкг/мл для 293T клеток) клеток питательной среды для выбора вдвойне transduced клеток. Экспериментально определите соответствующие концентрации puromycin и hygromycin для заданной ячейки типа до начала экспериментов.
7. Держите клетки в средствах массовой информации выбор для по крайней мере 3 d перед любой течению эксперименты и поддерживать в выбор носителя для продолжительности всех экспериментов.

6. ячейки димеризации и промывают

1. Добавьте 1 мм абсцизовой кислоты (АБА) или эквивалентный объем диметилсульфоксида (ДМСО) для элементов управления в культуре клеток к dimerize CLOuD9 выбран и преобразованы клетки. Использование ABA в течение 6 месяцев с даты получения, держать холодной и защитить его от света на протяжении использования. 2 мм ABA может использоваться при необходимости.
   1. Изменения средства массовой информации ежедневно предоставлять свежие Аба (или ДМСО для элементов управления) на время экспериментов.
      Примечание: Нет ограничений на длину димеризации еще не наблюдалось.
2. Обратный димеризации путем удаления СМИ содержащие Аба и мытья клетки с достаточно фосфат буфер солевой (PBS) для покрытия поверхности пластины, дважды. После этого культуры клеток в АБА свободных СМИ поддерживать ООН димерной состояние.

7. иммунопреципитации и Co-immunoprecipitations

Примечание: Сделать все буферы свежие и сразу перед использованием.

1. После завершения экспериментов димеризации собирать и спин вниз клетки, а затем удалить супернатант.
2. Crosslink и замораживания вниз клетки
   1. Сделать свежий запас 1% формальдегида в PBS при комнатной температуре с использованием свежих материалов. Для каждого 2 миллионов клеток нежно ресуспензируйте с 1 мл 1% формальдегида при комнатной температуре ровно 10 мин, при вращении.
      Примечание: Используйте минимальный объем 10 мл для сшивки менее чем 10 миллионов клеток.
   2. Утолите сшивки с добавлением Глицин в конечной концентрации 0,125 м, следуют инкубации за 5 мин при комнатной температуре, при вращении.
   3. Спин вниз клетки и вымыть 1-2 x с ледяной PBS. Гранулы ячейки может быть оснастки заморожены в жидком азоте и хранятся при температуре-80 ° C или использованы немедленно.
      Примечание: Жара изменит формальдегида сшивки. Если бросился, клетки могут храниться непосредственно в-80 ° C, без замораживания оснастки.
3. Подготовить Конъюгат антител/бисера
   Примечание: Оптимизация условий для выбранной антитела (т.е., тестирование различных лизис буферы для лизиса клеток и выполнении IP) могут быть стоит. Два общих буферов, буфера lysis Фарнхам и буфер RIPA изменения, может иметь существенное влияние на эффективность IP и sonication эффективность. Все композиции буфера можно найти в Таблице материалов. Кроме того, имейте в виду, что хроматина sonication может занять несколько часов.
   1. Ресуспензируйте бусы, vortexing кратко в зависимости от выбранной антитела.
   2. Передать соответствующее количество шариков для эксперимента 1,5 мл. Как отправной точки используйте 20 мкл бусы для каждого 1 мкг антител. Не добавляйте антитела.
      Примечание: Используйте 10 мкг антитела с 200 мкл бусы для 1 мг общего lysate как отправной точки, если известно, что антитела более или менее эффективно, чем это будет означать. Для низких изобилие белков этот коэффициент может потребоваться скорректировать.
   3. При использовании буфера lysis Farnham, мыть 3 x в IP буфером для разбавления проб. При использовании буфера lysis RIPA, мыть 3 x RIPA литического буфера.
   4. Ресуспензируйте бусины в окончательный объем же буфера от шага 7.3.3 (IP разрежения или Буфер RIPA) которые > 1 x и < 5 x первоначального объема. т.е. Для 100 мкл первоначальный шарик тома используйте между 100 и 500 мкл окончательный ресуспендирования тома.
   5. Добавьте антитела промывают бусины теперь в соответствующей концентрации. Для хорошей га или флаг антитела к IP CLOuD9 конструкции, используйте антител 1:50 (мкг белка: мкг белка lysate) и инкубировать между 8 + h и на ночь при 4 ° C, при вращении. Кроме того проинкубируйте 2-4 ч при комнатной температуре.
   6. Удалить супернатант из бисера и отбросить.
   7. Мыть бисер 3 x с буфером мыть.
   8. Ресуспензируйте в минимальный объем буфера для ночи инкубации с антителом (IP разрежения или Буфер RIPA). Держите холодной до тех пор, пока в сочетании с белком лизатных.
4. Sonicate Chromatin
   1. Первый Лизируйте клетки с добавлением отек буфера ячейка окатышей на льду за 10 мин, стряхивая клетки каждые несколько минут для предотвращения урегулирования.
      Примечание: Как правило, 500 мкл отек буфер добавляется 25 миллионов клеток и масштабируется от там, но делать не использовать меньше, чем 500 мкл буфера для < 25 миллионов клеток.
   2. Dounce вручную по часовой стрелке и против часовой стрелки, 13 x каждый.
   3. Ядер спин вниз на 4 ° C за 5 мин на 1500 x g. аспирационная супернатант полностью и повторить, чтобы удалить оставшиеся супернатанта, затем взвесить Пелле клеток в мг.
   4. Добавить ингибитор протеазы буфера lysis ядер (Фарнхем буфер или RIPA буфера, выше, выбрать один).
   5. Добавить 10 x размер буфера lysis ядер для гранулированных ядер для Ресуспензируйте (например, добавить 1 мл буфера lysis ядер в Пелле 0,100 g). Кратко вихря и лизируют для 10 мин на льду.
      Примечание: Имейте в виду размер sonication трубки. Идеальный объем является часто < 1 мл, поэтому образцов может потребоваться разделить Если гранулы очень велики.
      1. Для IP-Co sonicate ядер кратко чтобы солюбилизировать последнего материала и утолить SDS до уровня, который позволяет иммунопреципитации с 2-3 тома буфера для разведения, а затем переходите к шагу 7.4.6. Для очень чувствительных антител добавьте больше буфером для разбавления проб для дальнейшего снижения концентрации SDS.
         Примечание: Остановить sonication когда lysate очищает; она будет меняться от непрозрачный/полупрозрачный белый полностью прозрачным. Храните образцы так холодно, как можно и не более sonicate.
      2. Для чипа тщательно sonicate ДНК для получения фрагментов ДНК bp 150-1000, а затем переходите к шагу 7.4.6.
   6. Спиновые нерастворимый материал на максимальной скорости на 10 мин при 4 ° C.
   7. Передавать растворимых материал свежий трубки.
   8. Для Co-IP измерять концентрацию белка и приступить к выпадающих на шаге 7.5.
   9. Для чипа, удалите 10 мкл Алиготе из очищено lysate и добавить 40 мкл IP Элюирующий буфер и 6 мкл 5 М NaCl, для в общей сложности 56ul. Варить 15 мин при температуре 95 ° C, 5-10 мкл 3 M NaOAc рН 5 и очистить вверх по столбцу очистки ПЦР. Измерение концентрации ДНК путем измерения оптической плотности на 260 Нм и стандартизировать в образцы. Затем переходите к выпадающих на шаге 7.5.
      Примечание: Загородный lysate можно привязать замороженные при температуре-80 ° C и используется в более позднее время, но наилучшие результаты получаются от lysate свежие. Если заморозки, не замораживания/оттаивания lysate более чем один раз.
5. В раскрывающемся
   1. Передать соответствующее количество белка lysate свежие трубки. При использовании буфера lysis Farnham, развести в 2.1 тома IP буфером для разбавления проб (см. выше).
   2. Отложите 100 мкл супернатант для элемента управления вводом и хранить при 4 ° C до следующего дня.
   3. Добавьте шарик/антителами конъюгата из шага 7.3.8 образцы сейчас.
   4. Повернуть образцы на 4 ° C на ночь и убедитесь, что имеется достаточный объем для жидких движения в 1,5 мл пробирок.
6. Вымойте и элюировать
   1. После ночи вращение сохраните супернатанта как рекомендательный дроби. Затем вымойте бисер 3-5 x в IP буфером для разбавления проб.
   2. Подготовьте IP Элюирующий буфер при комнатной температуре, без ингибиторов.
   3. Элюировать комплексы с 50 мкл Элюирующий буфер потряс на вихрь на 67 ° C для элюции передачи 15 мин к новой трубки и повторите с другой 50 мкл. объединить их как для всего элюции 100 мкл.
      Примечание: Если есть слишком много фон от этой процедуры элюции, тепла может быть сокращены или устранены во время инкубации и тряски. Это обычно уменьшает доходность целевого белка, но существенно снизить фон.
7. Обратный сшивки при нагревании на 67 ° C > 4 h.
   Примечание: Это не является строго необходимым для совместного IPs, но может быть полезным.
   1. Для Co-IP обеспечить полное димеризации между объектом интереса, запустите элюаты геля SDS-page и зонд с антителами против HA тега или флаг тега, как указывается, все в 1:1000. Затем перейдите к шагу 8.
   2. Для чип ПЦР для обеспечения правильной локализации и ориентации каждого компонента ТРИФОСФАТЫ dCas9, чистый продукт элюции на столбце и элюировать в 10 мкл. выполнять в реальном времени количественные полимеразной цепной реакции (ПЦР) очищенная ДНК. Грунты, используемых в представленных данных доступны в дополнительной таблице 1. Затем перейдите к шагу 8.

8. РНК добыча и количественного PCR

1. Расследовать CLOuD9-индуцированные изменения в экспрессии генов, во-первых, изолировать и очистить всего РНК от управления ячейки окатышей и гранулы димерной клеток.
2. Сделать из очищенного РНК комплементарной ДНК — (cDNA кДНК) обратной транскрипции¹⁷ и выполнять анализ ПЦР. Праймеры доступны в дополнительной таблице 1.

9. хромосомы конформации Assay захвата

1. Чтобы наблюдать изменения частоты контактов геномной локусов, вызванных CLOuD9, выполнять хромосома конформации захвата (3C) assays⁸.
2. Количественно 3C продуктов перешнуровки в двух сетах дубликаты для каждой из трех биологических реплицирует по количественной ПЦР в реальном времени. Нормализовать образцы на 3C сигналы от locus тубулина. Праймеры доступны в дополнительной таблице 1.

Результаты

CLOuD9 индуцирует реверсивные β-глобина промоутер LCR зацикливания. Надлежащее использование системы CLOuD9 индуцирует реверсивные контакт взаимодополняющих CSA и CSP CLOuD9 конструкций путем добавления или удаления ABA СМИ культуры клеток (рис. 1a). Соответствующие геномной регионов с использованием стандартного оформления ТРИФОСФАТЫ локализованы CSA и CSP конструкции (рис. 1b). С учетом обширной документации Локус глобина человека, а также частые хромосомных складывания и перегруппировки, что там происходит во время разработки этот регион был выбран продемонстрировать полезность CLOuD9 системы. Кроме того линия клетки K562 был выбран потому что он показал выразить неизменно высокий уровень плода γ-глобина гена, в отличие от гена β-глобина, которая обычно выражается в здоровых взрослых эритроидных клеток линии. С помощью клетках K562, CLOuD9 возможность изменения экспрессии генов может быть проверен пытается восстановить выражение гена β-глобина в этой линии клеток.

До зачисления димеризации, хроматина, иммунопреципитация Количественная ПЦР (чип ПЦР) был использован для обеспечения точной локализации и ориентации каждого компонента CLOuD9 (Дополнительные рис. 1). Кроме того co иммунопреципитация (Co-IP) и без ABA проверены CSA и CSP димеризации присутствии лиганд, а также обратимости в отсутствие лиганда (Рисунок 1 c и 2 дополнительных). 24 часа после добавления АБА, больший контакт между локальной непрерывной репликации и β-глобина появился как измеряется хромосома конформации захвата (3C) в клетках с обеих частей димеризации, но не элементы управления, содержащие только две CSA или CSP конструкции, таким образом проверка Специфика chromatin изменения для определенных сайтов (Рисунок 1 c и дополнительных фигур 3,4). Создание взаимодействия LCR-β-глобина не полностью устранить эндогенного LCR-глобина контакт, но вместо этого добавляется оригинального контакта, как сообщалось ранее,⁸. Увеличение контактов β-глобина/LCR наблюдались до 72 ч димеризации, независимо от того, точный региона в рамках целевой локальной непрерывной репликации и β-глобина промоутер региона (дополнительные цифры 5,6). Наконец после удаления АБА, который показал полное обновление эндогенного конформации (рис. 1 d и дополнительные цифры 3-6) с 3C было подтверждено реверсивность системы.

Мы считали, что показано в клетках K562 успех может быть результатом Глобин Локус местоположения в районе euchromatin (рис. 1 d), так что второй линии клетки была использована для изучения этой идеи. CLOuD9 системы был применен к ячейкам 293T ГЭС в регионах, которые являются гетерохроматиновые и не выразить Глобин генов (Рисунок 1e). Результат был похож на то, что было отмечено в K562s; более β-глобина LCR ассоциации были измерены по 3C после 24 ч с ABA (Рисунок 1e и дополнительного рис. 3), предоставления доказательств для CLOuD9 надежные способность функционировать в различных средах сотовой, несмотря на первоначальное состояние хроматина или подтверждение.

Дополнительные локусов были протестированы для обеспечения широкой применимости CLOuD9, включая промоутер Oct4 и дистальной 5' усилитель в 293T клетки. Ранее был не обнаружено Oct4 выражение в этой линии клетки и далее, эндогенного контакты не описано. Доказательства Oct4 выражения в эмбриональных стволовых клеток, в результате контакта с дистальной 5' enhancer мотивированы этот эксперимент, и на β-глобина Локус¹⁸был замечен тот же результат. Контакт между Oct4 дистальной enhancer и промоутер была выявлена в клетки CLOuD9 включен, но не для управления ячейки (Рисунок 1f). Кроме того было отмечено, что промоутер Oct4 и дистальной 5' усилитель взаимодействия также побудило 3' усилитель связаться Oct4 промоутер. Данное событие соответствует доказательства того, что усилитель 3' взаимодействует с Oct4 промоутера/5 ' дистальной усилитель сложные течение эндогенных генов активации¹⁰.

CLOuD9 индуцирует контексте конкретных изменений в генных локусов. После подтверждения, что CLOuD9 система действительно заставить хромосомных контактов в генных локусов, мы стремились рассмотреть петли воздействие на экспрессию генов. Он документально подтверждено, что транскрипция для Глобин и Oct4 генов зависит от контактов между локальной непрерывной репликации и Глобин генных локусов и дистальной 5' усилитель и Oct4 промоутер, соответственно^1,11. Таким образом мы предположили, что использование CLOuD9, системы привода хроматина цикла образования в каждом из этих регионов приведет к убедительным экспрессии генов.

В обоих локусов, RT-ПЦР продемонстрировал, что Аба индуцированной хроматина петли рост поехали Oct4 выражение в 293T клетки и β-глобина выражение в клетках K562, хотя и не в 293Ts (рис. 2a). Хотя добавление ABA в ячейку культуры как 24 h увеличение β-глобина выражение существенно, выражение продолжал увеличиваться постепенно до 72 часов и был обратимые после вымывания Аба (Рисунок 2a). Все K562 клетки за исключением элементов управления следует этой тенденции, независимо от того, где димеризации компоненты были расположены в регионах локальной непрерывной репликации и β-глобина промоутер (Рисунок 2a и дополнительных фигур 7,8). В поддержку этих выводов чип ПЦР РНК Pol-II в локусе β-глобина в K562s и 293Ts и H3K4me3 переписывался с наблюдаемых изменений в транскрипции (рис. 2 c-f).

CLOuD9 устанавливает стабильные хроматина петли. Хотя краткосрочные индукционной петли с CLOuD9 четко следуют ожиданий, ли долгосрочные индукции зацикливания дифференциального воздействия оставалось соблюдаться. Расследовать это, клетки были культивированный присутствии ABA на 10 дней. В то время как K562s и 293Ts выставлены увеличение частоты контактов между Локус β-Глобин и локальной непрерывной репликации относительно управления (Рисунок 3А, b и дополнительных фигур 9,10), изменения в выражении β-глобина еще только наблюдались в клетках K562 (рис. 3 c). Интересно, однако, было отмечено, что долгосрочные димеризации в K562s, где транскрипция была сильно upregulated, был не больше реверсивные (Рисунок 3А и дополнительные цифры 9-11). Однако в 293Ts, где после долгосрочного димеризации было отмечено без изменений в транскрипции, индуцированные изменения в хроматина контакты оставались реверсивные (Рисунок 3b и дополнительный рисунок 9).

В целом только небольшое снижение экспрессии генов наблюдалось после 10 дней ABA удаления, который по-прежнему значительно выше, чем уровни выражения гена до димеризации (рис. 3 c). В соответствии с этим K562 клетки, но не 293T клетки, показал устойчивый изменения в H3K4me3 и РНК Pol-II в локусе β-глобина, чип ПЦР, по сравнению с элементов управления, даже после 10 дней ABA удаления (рис. 3d-f). Таким образом наши результаты показывают, что стабильность хроматина цикла подразумевает более устойчивого ген выражение.

Рисунок 1: CLOuD9 индуцирует реверсивные β-глобина промоутер LCR циклов. () Кроме того абсцизовой кислоты (ABA, зеленый) приносит два взаимодополняющих CLOuD9 конструкции (CLOuD9 S. pyogenes (CSP), CLOuD9 S. aureus (CSA), красный и синий, соответственно) в близости, Ремоделирование Структура хроматина. Удаление ABA восстанавливает конформации эндогенного хроматина. (b) CLOuD9 конструкции сочетаются ТРИФОСФАТЫ dCas9 технологии от S. aureus и S. pyogenes с обратимо dimerizeable домены PYL1 и ABI1. (c) сроки CLOuD9 димеризации экспериментов. (d) 3 C пробирного измерения частоты β-глобина Локус общесистемной сшивки в клетках K562 после 24 ч лечения с ABA (красный) и последующее вымывание (синий) показаны обратимости индуцированной β-глобина/LCR контактов (выделена серым цветом). Оранжевые стрелки указывают конкретные CLOuD9 построить целевых регионов. EcoRI фрагмент, содержащий Гиперчувствительность сайты 1-4 из локальной непрерывной репликации (черная полоса) был использован как якорь региона. Были оценены его частота сшивки с других указанных фрагментов EcoRI (имена на вершине графа). Β-глобина человека генов и LCR Гиперчувствительность сайты изображены на нижней части графика с координатами хромосомные положения. Данные из чип seq H3K4me3 и H3K9me3 продемонстрировать, что этот регион является эухроматиновых в K562s. (e) аналогичные обратимые изменения в структуре хроматина видны в клетках ГЭС 293T, несмотря на доказательства из данных H3K4me3 и H3K9me3 чип seq, Глобин регион гетерохроматиновые в этого типа ячейки. (f) 3 C пробирного измерения частоты Oct4 Локус общесистемной сшивки в 293T клетки после 72 ч лечения с ABA (красный) показаны индуцированной Oct4/дистальной усилитель контактов (выделена серым цветом). Оранжевые стрелки указывают конкретные CLOuD9 построить целевых регионов. Мбои фрагмент, содержащий Oct4 промоутер (черная полоса) был использован как якорь региона. Были оценены его частота сшивки с других указанных фрагментов Мбои (имена на вершине графа). На нижней части графика с координатами хромосомные положения изображены человека Oct4 регионы. Все 3C результаты были получены из по меньшей мере три независимых экспериментов. 3C значения были нормализованы в тубулина. Для β-глобина частоты взаимодействия между фрагмента якорь и фрагмент, охватывающих фрагмента β/HS были равным нулю. Для Oct4 частоты взаимодействия между фрагмента якорь и фрагмент отрицательный контроль за пределами региона взаимодействующих Oct4 были равным нулю. Планки погрешностей указывают с.д. n = 3. Этот рисунок был изменен Рисунок 1 Морган, Stefanie л, et al. ⁹. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2: CLOuD9 индуцирует контексте конкретные изменения в состоянии ген выражение и хроматина. () CLOuD9-индуцированной хроматина, зацикливание в локусе β-глобина приводит к обратимым индукции β-глобина выражение в K562s но не 293Ts. значение, учитывая относительно управления рассматриваются клеток. Два-Стьюдента t-тесты * P < 0,05, t = 3.418, df = 5; P < 0,0001, t = 10,42 df = 5; н.с. незначимая. Планки погрешностей указывают с.д. n = 3. (b) индукции Oct4 выражение было отмечено в 293Ts после CLOuD9-индуцированной зацикливания в же локусе. Значение дается относительно управления рассматриваются клеток. Два-Стьюдента t-тесты * P < 0,05, t = 4.562, df = 2. Планки погрешностей указывают с.д. (c) схема чип ПЦР грунтовка мест вдоль тела гена β-глобина. (d, e) Чип ПЦР демонстрирует обратимые изменения в H3K4me3 в β-глобина локусе K562s но не 293Ts после CLOuD9-индуцированной циклов. Два-Стьюдента t-тесты * P < 0,05, ** P < 0,001, *** P < 0,0001. Планки погрешностей указывают с.д. (f) CLOuD9, опосредованная изменения в β-глобина транскрипции в K562s соответствуют с увеличением РНК Pol-II размещение во всей полноте тела гена β-глобина. Два-Стьюдента t-тесты * P < 0,05, ** P < 0,001, *** P < 0,0001. Планки погрешностей указывают с.д. Этот рисунок был изменен Рисунок 2 Морган, Stefanie л, и др. ⁹. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3: CLOuD9 устанавливает стабильные хроматина циклы, которые поддерживать надежные ген выражение, следующее за долгосрочные димеризации. (а, б) 3 C пробирного показывает, что в K562s но не 293Ts, циклы CLOuD9-индуцированной хроматина необратимый после 10 дней лечения АБА, даже когда ABA удаляется до 10 дополнительных дней. Все 3C результаты были получены из по меньшей мере три независимых экспериментов. 3C значения были нормализованы в тубулин, и частоты взаимодействия между фрагмента якорь и фрагмент, охватывающих фрагмента β/HS были равным нулю. Планки погрешностей указывают с.д. n = 3. (c) цикла стабилизации в K562s приводит к стойким выражение β-глобина, даже после 10 дней ABA размыва. Никаких изменений в выражении β-глобина наблюдаются в 293Ts. значение, учитывая относительно управления рассматриваются клеток. Два-Стьюдента t-тесты *** P < 0,0001, t = 5.963, df = 5; н.с. увеличение незначительным (d) чип ПЦР показаны в H3K4me3 знаки над β-глобина локус в ответ на CLOuD9-индуцированной циклы поддерживаются после 10 дней лигандом размыва в K562s. два Стьюдента t-тесты * P < 0,05, ** P < 0,001, *** P < 0,0001. (e) без существенных изменений в H3K4me3 сигналов следующих долгосрочных димеризации были замечены на чип ПЦР в 293Ts. (f) вместимость увеличилась РНК Pol-II локуса β-глобина, после долгосрочного цикла индукции была сохранена в K562s После 10 дней лигандом размыва. Два-Стьюдента t-тесты * P < 0,05, ** P < 0,001, *** P < 0,0001. Все планки погрешностей указывают с.д. Этот рисунок был изменен Рисунок 3 Морган, Stefanie л, и др. ⁹. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Дополнительный рисунок 1: CLOuD9 конструкции локализовать в их регионах направлены. Иммунопреципитации Chromatin и количественного PCR CLOuD9 конструкции демонстрируют правильный локализации для их предполагаемого локусов генома. Эта цифра была изменена от дополнительного рисунок 1 Морган, Stefanie л, и др. ⁹. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот показатель.

Дополнительный рисунок 2: CLOuD9 конструкции обратимо связывать в ответ на лечение АБА. Co-immunoprecipitations, демонстрируя ассоциации dCas9 белков, следующих 72 h ABA лечения вспять следующие последующие 72 h лигандом размыва. Эта цифра была изменена от дополнительного рисунок 2 Морган, Stefanie л, и др. ⁹. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот показатель.

Дополнительная цифра 3: контроль лечения побуждает никаких изменений в контактах хроматина. Лечение с ДМСО, агент управления для 24 часов вызывает никаких изменений в конформации эндогенного хроматина, 3C либо клетках K562 или ГЭС 293Ts. 3C значения были нормализованы тубулин, и частоты взаимодействия между фрагмента якорь и фрагмент охватывающих фрагмента β/СС были равным нулю. Планки погрешностей указывают SD. n = 3. Эта цифра была изменена от дополнительного рисунок 3 Морган, Stefanie л, и др. ⁹. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот показатель.

Дополнительный рисунок 4: контроль CLOuD9 преобразованы клетки показывают без изменений в циклических хроматина. Руководство двух CLOuD9 конструкции либо LCR или β-глобина промоутер вызывает никаких существенных изменений в структуре хроматина, 3C, после лечения ABA относительно контроля лечения. 3C значения были нормализованы в тубулин, и частоты взаимодействия между фрагмента якорь и фрагмент, охватывающих фрагмента β/HS были равным нулю. Планки погрешностей указывают SD. n = 3. Эта цифра была изменена от дополнительного рисунок 4 Морган, Stefanie л, и др. ⁹. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот показатель.

Дополнительная цифра 5: CLOuD9 хроматина цикл остается обратимые после 72 часов димеризации. 3C пробирного в K562s демонстрирует обратимости CLOuD9 индуцированной β-глобина/LCR контактов после 72 часов лечения АБА. 3C значения были нормализованы в тубулин, и частоты взаимодействия между фрагмента якорь и фрагмент, охватывающих фрагмента β/HS были равным нулю. Планки погрешностей указывают SD. n = 3. Эта цифра была изменена с дополнительная цифра 5 Морган, Stefanie л, и др. ⁹. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот показатель.

Дополнительный рисунок 6: CLOuD9, индуцированная β-глобина/LCR циклы не влияет Глобин целевого сайта. Направляя CSA и CSP создает альтернативные регионы LCR или β-глобина промоутер результаты аналогичных обратимые изменения в индукционной петли, 3C после 72 часов лечения АБА. 3C значения были нормализованы в тубулин, и частоты взаимодействия между фрагмента якорь и фрагмент, охватывающих фрагмента β/HS были равным нулю. Планки погрешностей указывают SD. n = 3. Эта цифра была изменена с дополнительной 6 цифра в Морган, Стефани л., и др. ⁹. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот показатель.

Дополнительная цифра 7: CLOuD9, индуцированные изменения в экспрессии генов выдержаны независимо от целевого сайта Глобин. Направляя CSA и CSP создает альтернативные регионы β-глобина промоутер и локальной непрерывной репликации не оказывает влияния на всасывание экспрессии генов, после 72 ч димеризации. Однако хотя некоторые влияет на прочность экспрессии генов, которые следующие димеризации долгосрочный (10 дней) было отмечено, высокий уровень β-глобина относительно управления лечение клетки были устойчивый следующие последующие лигандом размыва для 10 дополнительных дней. Значение дается относительно управления рассматриваются клеток. p < 0,001, t = 10.25, df = 5; p < 0,0001, слева в правый t = 8.697, df = 6, t = 40.31, df = 7; н.с. незначимая. Все планки погрешностей указывают SD. Эта цифра была изменена с дополнительной рисунок 7 Морган, Stefanie л, и др. ⁹. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот показатель.

Дополнительная цифра 8: контроль CLOuD9 преобразованы клетки показывают без изменений в выражении β-глобина. Руководство двух CLOuD9 конструкции либо LCR или β-глобина промоутер побуждает никаких существенных изменений в выражении β-глобина, после лечения ABA относительно контроля лечения. Значение дается относительно управления рассматриваются клеток. н.с. незначимая. Эта цифра была изменена с дополнительной рисунок 8 Морган, Stefanie л, и др. ⁹. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот показатель.

Дополнительный рисунок 9: долгосрочный контроль лечения побуждает никаких изменений в контактах хроматина. Для 10 дней лечения с ДМСО, агент управления, вызывает никаких изменений в конформации эндогенного хроматина, 3C либо клетках K562 или ГЭС 293Ts. 3C значения были нормализованы тубулин, и частоты взаимодействия между фрагмента якорь и фрагмент охватывающих фрагмента β/СС были равным нулю. Планки погрешностей указывают SD. n = 3. Эта цифра была изменена с дополнительной рисунок 9 Морган, Stefanie л, и др. ⁹. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот показатель.

Дополнительный рисунок 10: Долгосрочный CLOuD9 индуцированных β-глобина/LCR циклы не влияет Глобин целевого сайта. Направляя CSA и CSP создает альтернативные регионы LCR или β-глобина промоутер результаты в Аналогичным образом устойчивым петли индукции как продемонстрировано 3C после 10 дней лечения Аба и 10 дней последующих лигандом размыва. 3C значения были нормализованы в тубулин, и частоты взаимодействия между фрагмента якорь и фрагмент, охватывающих фрагмента β/HS были равным нулю. Планки погрешностей указывают SD. n = 3. Эта цифра была изменена с дополнительной рисунок 10 Морган, Stefanie л, и др. ⁹. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот показатель.

Дополнительный рисунок 11: CLOuD9 конструкции необратимо связать в ответ на длительное лечение АБА. Co-immunoprecipitations демонстрации необратимым ассоциации CSA и CSP dCas9 белков, после 10 дней лечения Аба и 10 последующих дней лигандом размыва. Этот рисунок был изменен с дополнительной рисунок 11 Морган, Stefanie л, и др. ⁹. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот показатель.

Дополнительная таблица 1: перечень грунтовка последовательностей для оформления, qRT-PCR, 3C и чип ПЦР. Эта таблица была изменена от дополнительной таблице 1 Морган, Stefanie л, и др. ⁹. пожалуйста, нажмите здесь чтобы скачать эту таблицу

Обсуждение

The Most критические шаги в CLOuD9 хроматина циклических являются: 1) проектирование или с использованием правильного оформления, 2) изменение средств массовой информации ежедневно на преобразованы CLOuD9 клетки, включая ABA или ДМСО, 3) поддержание свежесть Аба и 4) выполнения точной и тщательной оценки Хроматин конформации.

Пределы CLOuD9 главным образом проживают в способность разработать руководства к целевой области выбора. Руководство РНК выполняют важную задачу по локализации dCas9 компоненты в целевых регионах ДНК, чтобы быть димерной и эффективность руководства основаны на их конкретной целевой сайт. Без надлежащего gRNA компонентов CLOuD9, система не сможет сформировать обратимо индуцированной петли. Таким образом путем разработки нескольких руководств для каждого региона интерес и распространение руководства над регионом 250-1000 bp, по крайней мере один успешный гид будет обеспечиваться. Руководство Расположение также является неотъемлемой частью точные результаты. Важно избежать направляющие расположены в сайтов связывания фактор транскрипции или других критических регионов для предотвращения фон эффекты, такие как вверх или вниз регуляции транскрипции. Кроме того точное местоположение CLOuD9 конструкции слегка может повлиять транскрипции гена целевого объекта. Это подчеркивает важность тестирования нескольких пар руководств для каждого целевого региона, для выявления наиболее надежный пару для экспериментальных целей. Кроме того в каждой паре целевых регионах, CSA конструкции должны быть ориентированы с оформления для S. aureus, и CSP конструкции должны быть ориентированы с оформления для S. pyogenes для ориентации специфичности.

Чтобы обеспечить точные результаты и правильный димеризации, важно также поддерживать свежесть клеточной среды после трансдукции CLOuD9 конструкций. Ежедневно средства массовой информации изменения и добавлением свежей dimerizer (или управления) гарантирует, что дополнительные конструкции останется в близости и сохранить измененные хроматина конформации. Кроме того важно гарантировать ABA свежие и хранился надлежащим образом по данным производителя протокол (открыт в течение 6 месяцев, холодный, хранится защищенный от света) для получения достоверных результатов.

В частности ABA dimerizer для CLOuD9 был использован с ABI и пыль димеризации белков, вместо того, чтобы более широко использовать FRB и FKBP системы. Необходимость rapalog для FRB/FKBP системы будет ограниченную применимость CLOuD9, из-за токсичности для раковых клеток. Альтернативные системы ABI/PYL обойти это ограничение, эффективно позволяя CLOuD9 быть более широко усваиваемый.

Коллективно мы разработали CLOuD9, уникальные и надежные технологии, которая может принудительно но обратимо создать контакты между дальней цели геномной локусов. Через склонение хроматина петли, мы также продемонстрировать, что CLOuD9 могут быть использованы для изменения экспрессии генов в соответствующем контексте сотовой. Адаптируемость технология позволяет неограниченное исследование взаимодействия между любые два геномной локусов, без необходимости предварительного знания циклов регионов или зацикливание механизмов. Кроме того CLOuD9 уникальный продемонстрировали обратимости позволяет дальнейшее изучение механизмов циклы заболеваний и развития. Хотя было четко продемонстрировали на цель эффекты хроматина циклов, есть еще быть данных, предлагая понимание эффекты пробить циклов и последующее воздействие на петлях на целевой.

Наши данные показывает только несколько приложений для этого инструмента, но подразумевает крупные идею что хроматина соглашение свидетельствует о экспрессии генов. Наша технология может использоваться для изучения и раскрыть нюансы структуры хроматина в регуляции генов, тем самым улучшение общего понимания роли хроматина, складывающиеся в транскрипции генов. Лучше понять тонкости транскрипционный анализ динамики может возглавить процесс исследования и лечения рака, наследственных заболеваний и врожденных расстройств, в котором собственный хроматина Ассамблея несомненно изменяет выражение гена в^{20, 21,,22}-²³. Последующие работы, используя технологию CLOuD9 будет освещать дальнейшие сведения о расположении и динамика доменов хроматина и как они управляют, складные для поддержания стабильной ген выражение как развития, так и болезни.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640  media	Life Technologies	11875-119	For K562 cell culture
DMEM media	Life Technologies	11995-065	1X, for 293T cell culture
lentiCRISPR v2	Addgene plasmid	#52961	For CLOuD9 plasmid development
pRSV-Rev	Addgene plasmid	#12253	For lentivirus production
pMD2.G	Addgene plasmid	#12259	For lentivirus production
pMDLg/pRRE	Addgene plasmid	#12251	For lentivirus production
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher Scientific	11668-019	For lentivirus production
anti-HA antibody	Cell Signaling	3724	For immunoprecipitation
anti-Flag antibody	Sigma	F1804	For immunoprecipitation
DNeasy Blood and Tissue Kit	Qiagen	69504	For DNA extraction
TRIzol	Life Technologies	15596-018	For RNA extraction
RNeasy Kit	Qiagen	74106	For RNA extraction
Superscript VILO	Life Technologies	11754-050	For cDNA
SYBR Green I MasterMix	Roche	4707516001	For qPCR analysis
Light Cycler 480II	Roche		For qPCR analysis
anti-H3K4me3 antibody	AbCam	ab8580	For ChIP-qPCR
anti-RNA Pol-II antibody	Active Motif	61083	For ChIP-qPCR
EDTA free protease inhibitor	Roche	11873580001	For protein extraction
4-12% Tris Glycine gel	Biorad		Any size, For western blot
anti-Rabbit HRP antibody	Santa Cruz	sc-2030	For western blot
anti-mouse HRP antibody	Cell Signaling	7076S	For western blot
K562 and H3K293 ChIP-Seq data	Encode	ENCSR000AKU	For ChIP-seq analysis
K562 and H3K293 ChIP-Seq data	Encode	ENCSR000APE	For ChIP-seq analysis
K562 and H3K293 ChIP-Seq data	Encode	ENCSR000FCJ	For ChIP-seq analysis
K562 and H3K293 ChIP-Seq data	GEO	GSM1479215	For ChIP-seq analysis
Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation	Thermo Fisher Scientific	10001D	For immunoprecipitation
Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation	Thermo Fisher Scientific	10004D	For immunoprecipitation
RNA Clean & Concentrator-5	Zymo Research	R1015	For RNA purification
Pierce 16% Formaldehyde Methanol-free	Thermo Fisher Scientific	28908	For crosslinking
PX458 Plasmid	Addgene	48138	Suggested active Cas9 plasmid for gRNA cloning, but any active Cas9 plasmid will do
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28104	For PCR purification
FastDigest BsmBI	Thermo Fisher Scientific	FD0454	For cloning guide RNAs
FastAP	Thermo Fisher Scientific	EF0651	For cloning guide RNAs
10X FastDigest Buffer	Thermo Fisher Scientific	B64	For cloning guide RNAs
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704	For cloning guide RNAs
10X T4 Ligation Buffer	NEB	B0202S	For cloning guide RNAs
T4 PNK	NEB	M0201S	For cloning guide RNAs
2X Quick Ligase Buffer	NEB	B2200S	For cloning guide RNAs
Quick Ligase	NEB	M2200S	For cloning guide RNAs
Buffers
Farnham lysis buffer			1% Tris-Cl pH 8.0, 1% SDS, 1% protease inhibitor water solution (non-EDTA), and 1 mM EDTA in water
Modified RIPA buffer			1% NP40/Igepal, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 1 mM EDTA, and 1% protease inhibitor water solution (non-EDTA) in PBS pH 7.8 or 7.4
IP dilution buffer			0.01% SDS, 1.1% Triton-X 100, 1.2 mM EDTA, 16.7 mM Tris-HCl pH 8.0, 167 mM NaCl, 0.1x protease inhibitor
Wash buffer			100 mM Tris pH 9, 100 mM LiCl, 1% NP-40, and 1% sodium deoxycholate
Swelling buffer			0.1 M Tris pH 7.5, 10 mM potassium acetate, 15 mM magnesium acetate, 1% NP-40
Dilution buffer			0.01% SDS, 1.1% Triton X-100, 1.2 mM EDTA, 16.7 mM Tris pH 8 and 167 mM NaCl
IP elution buffer			1% SDS, 10% NaHCO3