JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Kromatin döngü gen düzenlemesi içinde önemli bir rol oynar; Ancak, kromatin döngüler seçici ve tersinir değişikliği için izin hiçbir teknolojik gelişmeler olmuştur. Burada biz kromatin döngü yeniden yapılanma için güçlü bir sistemi tarif CRISPR-dCas9 (CLOuD9), seçmeli olarak ve geri dönülebilir olarak gen ekspresyonu, modüle gösterdi kullanarak hedef loci.

Özet

Son çalışmalar açıkça etkileşimleri oyun ama döngü sorumlu olup veya gen ifadesinde değişiklikler sonucu Gen ifadesinin düzenlenmesinde önemli rol hala döngü bu uzun menzilli, üç boyutlu kromatin göstermiştir bilinmeyen. Yakın zamana kadar gen etkinliğini ve hücresel fonksiyon Yönetmeliği etkilemesi kromatin döngü görece belirsiz oldu ve sınırlamalar bu yapıların işlemek için varolan yöntemleri bu etkileşimler derinlemesine incelenmesi engelledi. Bu belirsizlik gidermek için biz bir yöntem seçici ve tersinir kromatin döngü yeniden yapılanma için mühendislik CRISPR-dCas9 (CLOuD9) kullanarak. Dinamizm CLOuD9 sisteminin CLOuD9 yapıları yerel kromatin conformation modüle genomik loci hedeflemek için başarılı yerelleştirme tarafından kanıtlanmıştır. Önemlisi, indüklenen ilgili ters ve endojen kromatin uyum geri yükleme olanağı da doğrulanmıştır. Bu yöntemle Gen ifadesinin modülasyon hücresel gen ekspresyonu düzenleyecek kapasitesi kurar ve istikrarlı de novo belirgin gen etkiler kromatin döngüler oluştururken bu teknolojinin uygulamalar için büyük bir potansiyel altını çiziyor kanser ve geliştirme bağlamlarda ifadesi.

Giriş

Gen ifade1,2ile yakından ilişkili olduğu gösterilmiştir gibi çekirdek ve belirli genom organizasyonu katlama kromatin arasındaki ilişki son yıllarda önemli ilgi topladı vardır. Gen etkinliğini ve modülasyon kromatin yapısının kesin ilişkisi belirsiz durumda olduğu sürece, bu dinamik üç boyutlu kromatin organizasyon sonucunda kromozom kişiler arasındaki etkileşimler hizmet onaylanmadığına karar bir gen düzenleyici fonksiyonu3. Gerçekten de, böyle bir etkisi de nerede odağı kontrol bölgesi (LCR) etkinliği globin genleri ile gelişimsel olarak belirli bir şekilde kromatin döngü arasında iki bölgeden4oluşturarak düzenleyen insan globin gen odağı, kanıtlanmıştır. Ancak, hem bu ve diğer bölgelerde, bu kromatin döngü bir neden ya da Gen ifadesinin içinde değişiklikler sonucu olup olmadığı belli değildir.

Şimdiye kadar bu olay eğitim sorunlar çözümsüz. Örneğin, kromatin döngüler inducing diğer girişimleri doğrusal DNA dizisi veya arka plan bilgisi döngü5,6kolaylaştırmak belirli öğeler üzerinde çok miktarda gerektiren karmaşık prosedürler değiştirme dahil, 7,8. Ayrıca, önceki çalışma o kromatin sürücü gen ekspresyonu belirli ve sınırlı içerik7,döngüler önerdi iken8, hangi kromatin döngü transkripsiyon küresel etkiler düzeyi belirsizdir. Uzun menzilli gen ekspresyonu üzerinde döngü etkisini ilgi sürekli son yıl içinde büyüdü rağmen kurulması ve gen etkinliği değiştirmek için Kromatin kişiler istinat hakkında cevapsız sorular devam etmektedir.

Biz si mühendislik teknolojisi nükleaz eksik kümelenmiş ilişkili düzenli olarak interspaced kısa palindromik yineler (CRISPR) - CRISPR - protein 9 (dCas9), genel olarak uygulanabilir herhangi bir genomik loci9/ hedefleme için izin vermek için kullanır. Bu teknoloji doğrusal DNA dizisi değişiklikler ile ilgili karmaşık sorunları ortadan kaldırır ve belirli döngü bileşenlerinin önemli ön bilgi olmadan erişilemez. En önemlisi, evrensel ve geniş olduğu gibi hastalıklar, kanser gibi çeşitli geliştirme de tanınan kromatin döngüler için geçerli bir araçtır. CLOuD9 gücünü geri dönülebilir olarak etkili bir şekilde gen ekspresyonu modüle döngüler yapısını değiştirerek gösterilmiştir.

Protokol

1. gRNA tasarım

  1. Kılavuzu RNA'ların10tasarlamak için bir standart gRNA tasarım aracını seçin. Daha önce Gelişmiş CLOuD9 yapıları9 tamamlayıcı çiftler kullanın (yani, en az 1 S. aureus (CSA) ve 1 S. pyogenes (CSP) inşa) her deneme için.
    1. Seçilen online tasarım aracı içinde Protospacer bitişik motifi (PAM) sıra "NGG" 20 Kılavuzu uzunluğu ile kullanın bp CSP ve PAM için sıra "NNGRRT" 21 Kılavuzu uzunluğuyla CSA için.
    2. Üzerinde özgüllük dayalı kılavuzları seçin puan ve tasarım çalışan bir rehber alma şansını arttırmak için her iki ipliklerini kılavuzları.
    3. 2 oligonucleotides başına Kılavuzu oligo üreticisinden sipariş: ileri oligo için "caccg" 5' uç için Kılavuzu sırasının ve ters oligo için eklemek, "aaac" 5' ucu ve "c"-3' ucu siparişi vermeden önce ekleyin.
  2. Başlangıçta, 3-5 gRNAs bir 250-1000 bp bölge üzerinde yayılmış ilgi her bölge için tasarım. Aşağıdaki gibi verimliliği hedefleyen gRNA değerlendirmek:
    1. Tanımlanan klon gRNAs etkin bir Cas9 plazmid içine (bkz. Adım 3) ve (bkz: adım 4) 293T hücrelere geçici transfect11.
    2. 2-3 d içinde Dulbecco'nın modifiye kartal Orta (DMEM) ile % 10 fetal Sığır serum (FBS) ve % 1 penisilin-streptomisin (kalem strep), hücrelerin büyümesine sonra hasat ve genomik DNA12ayıklayın.
    3. Hedef bölgeler polimeraz zincir tepkimesi (PCR) tarafından yükseltmek. Ürünler üzerinde % 1.5 özel jel çalıştırın ve uygun bantları arındırmak.
    4. T7 endonükleaz tahlil Guschin içinde açıklandığı gibi gerçekleştirmek ve ark. iletişim kuralı13,14.
      Not: Bu DNA hedef sitede kesmek için belirlenen verimli kılavuzları vardır.

2. hücre kültürü

  1. Bir sağlıklı ve aktif devlet bölen hücreleri korumak.
    1. K562s için kültür Roswell Park Memorial Enstitüsü (RPMI) 1640 medya % 10 FBS ve % 1 kalem strep ile.
      1. K562s bakım için bir 25 cm2 canted boyun şişesi içinde büyümek ve her gün mL başına 400.000 hücre için hücre yoğunluğu ayarlayın.
      2. K562s ile transduced sonra CLOuD9 oluşturur, 2 µg/mL puromisindir ve 100 µg/mL hygromycin bakım ortamına Ekle.
    2. 293Ts için kültür içinde Dulbecco'nın modifiye kartal Orta (DMEM) ile % 10 FBS ve % 1 kalem strep.
      1. 293Ts 10 cm2 tabak içinde büyümek ve konfluent ne zaman bölünmüş.

3. plazmid hazırlık ve gRNA ekleme15

Not: Plazmid haritalar ekte mevcuttur ve örnek deneylerde kullanılan astar ek tablo 1' de kullanılabilir.

  1. BsmBI, alkalen fosfataz, 10 arabellek x 6 µL ve taze hazırlanmış 100 mm DTT 0.6 µL 3 µL 3 µL ile Mix 5 µg lentiviral CRISPR plazmid. GKD2O ile 60 µL toplam hacim getirmek ve sindirmek ve plazmid dephosphorylate 30 dk 37 ° C'de kuluçkaya.
  2. Jel sindirilir plazmid arındırmak ve GKD2' O. elute
  3. 10 x T4 ligasyonu arabellek, GKD2O 6.5 µL ve 0.5 µL 1 µL ile her 100 µM, eşleştirilmiş kılavuzların Mix 1 µL T4 PNK 10 µL toplam hacim ulaşmak için. 30 dk, 5 dk, sonra 95 ° C için 37 ° C'de kuluçkaya sonra 25 ° C 5 ° C/dk aşağı rampa.
    Not: Bu kılavuzları çifti TAV.
  4. Tavlanmış kılavuzları (Kimden adım 3.3) 1: 200 GKD2O. sulandırmak
  5. Mix 1 µL seyreltilmiş ve birleştirilmiş kılavuzları adım 3.4, 2 x arabellek, GKD2O 1 µl ve ligaz, 0.5 µL 5.5 µL toplam reaksiyon yapmak için 2.5 µL 0.5 µL ile adım 3.2 sindirilir plazmid. Bu BsmBI sindirilmiş plazmid kılavuzlara ligate 10 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.
  6. Stbl3 bakteri adım 3.5 yeni ve birleştirilmiş plazmid dönüştürmek ve herhangi bir plazmid hazırlama yöntemi kullanarak yükseltmek.

4. lentivirus üretim

  1. İyi bir altı-kuyu başına sayısı 750.000 293T hücre bir hemasitometre kullanarak plaka ve onları DMEM içinde % 10 FBS ve % 1 kalem ile strep temel olarak belirler. Bir şey için her yapı kullanan.
  2. tohum sonra 24 h % 10 ile taze antibiyotik ücretsiz DMEM için medya değiştirmek FBS.
  3. Bir tüp içinde OptiMEM orta tepki11başına 150 µL ile lipid tabanlı transfection reaktif 11 µL sulandırmak.
  4. Ayrı bir tüp içinde CLOuD9 lentiviral vektör plazmid adım 3.6, pMDLg/pRRE, pRSV-Rev 1 µg ve pMD2.G 0.65 µg OptiMEM orta tepki11başına 150 µL ile 0.35 µg 2 µg sulandırmak.
  5. Her reaksiyon için 1:1 oranında sulandırılmış lipid tabanlı transfection reaktif seyreltilmiş lentiviral plazmid karışımları eklemek ve 5 dk11için kuluçkaya.
  6. Birimin tümü her karışık kompleks adım 4.2 adımından 4.5 293T antibiyotik içermeyen hücreleri ilgili kuyu içine ekleyin.
  7. 48 saat sonra bir taze tüp ve spin aşağı 300 x g 5 min için de pipetting tarafından viral üretim medya toplamak. Santrifüjü sonra süpernatant kalan hücre artıkları kaldırmak için taze bir tüp taşıyın.
  8. Viral üretim ortamı hemen hedef hücreleri iletim için kullanmak veya ileride kullanmak üzere-80 ° C'de dondurmak.

5. lentivirus iletim hücre

  1. Faiz (tamamlayıcı CLOuD9 Plasmid'ler ile oluşan) viral her yapı 250 µL CLOuD9 uygulama için 80.000 hücreleri içeren bir 15 mL konik tüp ekleyin.
  2. Medya hacmi her getirmek ile antibiyotik özgür kitle iletişim araçları, 1 ml konik ve 1-8 µg/mL (kullanılan hücre türüne göre tolere polybrene maksimum konsantrasyon-ecek lüzum deneysel olarak belirlenecek) arasında son bir konsantrasyon polybrene ekleyin.
  3. Hücreleri 800 x g için oda sıcaklığında 30 dk de spin sonra viral süpernatant kaldırmadan pipetting tarafından resuspend. Tüm hücre süspansiyon hücre kültür plaka taşımak.
  4. 24 saat sonrası iletim, spin hücreleri aşağı 300 x g oda sıcaklığında 5 min için de.
  5. Viral süpernatant Aspire edin ve hücreler normal hücre kültür medya resuspend.
  6. Bir sonraki günü için iki kat transduced hücreleri seçmek için hücre kültür orta puromisindir (1 µg/mL 293T hücreler için) ve hygromycin (25 µg/mL 293T hücreler için) ekleyin. Deneysel olarak puromisindir ve hygromycin deneyler başlamadan önce belli bir hücre türü için uygun konsantrasyonlarda belirlemek.
  7. En az 3 d daha önce herhangi bir aşağı akım deneyler için seçim medyada hücreler tutmak ve tüm deneyler süresince seçimi medyada bakımı.

6. hücre Dimerization ve dışarı yıkama

  1. 1 mM Absisik asit (ABA) ekleyebilir veya seçili ve hücreleri transduced dimetil sülfoksit (DMSO) hücre kültürü CLOuD9 dimerize denetimlere için eşdeğer bir ses. ABA giriş tarihi 6 ay içinde kullanın, soğuk tutmak ve ışık kullanımı boyunca onu korumak. 2 mM ABA gerektiğinde yararlı olabilir.
    1. Medya günlük deneyler süresince taze ABA (veya DMSO denetimler için) sağlamak için değiştirin.
      Not: Dimerization uzunluğu sınırlama henüz gözlenmiştir.
  2. Dimerization aracılığıyla iki plaka yüzeyi kapsayacak ABA içeren ve hücreleri yeterli fosfat tamponlu tuz yıkama medya (PBS) kaldırılması ters. Bundan sonra kültür hücreleri ABA-ücretsiz medya un dimerized bir durumu korumak için.

7. Immunoprecipitation ve Co-immunoprecipitations

Not: tüm arabellekleri kullanılmadan önce taze ve hemen alın.

  1. Bitimini takiben dimerization deneyler, toplamak ve hücre aşağı spin sonra süpernatant Aspire edin.
  2. Crosslink ve donma hücreleri aşağı
    1. Taze bir hisse senedi % 1 formaldehit PBS içinde oda sıcaklığında taze malzemeler kullanılarak olun. Her 2 milyon hücre için hafifçe % 1 formaldehit tam olarak 10 dakika, oda sıcaklığında 1 mL ile dönen iken resuspend.
      Not: 10 mL minimum hacmi 10 milyondan az hücreleri çapraz için kullanın.
    2. Crosslinking 0,125 M, kuluçka oda sıcaklığında 5 min için döndürme sırasında ardından son bir konsantrasyon için glisin ilavesi ile gidermek.
    3. Hücreleri aşağı spin ve 1-2 x buz gibi PBS ile yıkayın. Hücre topakları sonra sıvı azot içinde donmuş ve-80 ° C'de depolanan veya hemen kullanılan ek olabilir.
      Not: Isı formaldehit Glossar tersine çevirir. Ek donma olmadan koştu, hücreleri doğrudan-80 ° C'de saklanabilir.
  3. Antikor/boncuk eşlenik hazırlamak
    Not: Seçilen antikor (yani, farklı lizis arabellekleri hücre lizis için test ve IP gerçekleştirme) için en iyi duruma getirme koşulları faydalı olabilir. İki ortak arabellekleri, Farnham lizis tampon ve RIPA modifiye tampon, IP verimlilik ve sonication verimliliği üzerinde önemli bir etkisi olabilir. Tüm arabellek kompozisyon Malzemeler tablobulunabilir. Ayrıca, o kromatin unutmayın sonication tamamlanması birkaç saat sürebilir.
    1. Boncuk vortexing kısa bir süre için seçilen antikor uygun olarak tarafından resuspend.
    2. Boncuk deney için uygun bir miktar bir 1,5 mL tüp aktarın. Bir başlangıç noktası olarak, boncuk 20 µL antikor her 1 µg için kullanın. Antikor henüz eklemeyin.
      Not: antikor bu anlamına gelir daha fazla veya daha az verimli tanımıyorsan 10 µg antikor boncuk 200 µL ile toplam bir başlangıç noktası olarak lysate 1 mg için kullanın. Düşük bereket proteinler için bu oran ayarlanması gerekebilir.
    3. Farnham lizis arabellek kullanıyorsanız, 3 x IP seyreltme arabellekte yıkayın. RIPA lizis arabellek kullanıyorsanız, 3 x RIPA lizis arabellekte yıkayın.
    4. Bu boncuklar adım 7.3.3 aynı arabelleğinden son hacmi (IP seyreltme veya RIPA arabellek) resuspend > 1 x ve < ilk x 5. yani 100 µL ilk boncuk birim için 100 ve 500 µL son resuspension birim arasında kullanın.
    5. Antikor şimdi uygun bir konsantrasyon, soluk boncuk ekleyin. Bir iyi HA veya bayrak antikor için IP CLOuD9 yapıları, antikorlar 1:50 at kullanın (µg protein: µg protein lysate) ve arasında 8 + s ve gecede 4 ° C'de döner süre kuluçkaya. Alternatif olarak, oda sıcaklığında 2-4 h için kuluçkaya.
    6. Boncuk süpernatant kaldırmak ve atın.
    7. Yıkama yıkama arabelleği ile 3 x boncuk.
    8. Antikor (IP seyreltme veya RIPA arabellek) ile gece kuluçka için kullanılan arabellek en az bir hacim içinde resuspend. Protein lysate ile kombine kadar soğuk tutmak.
  4. Kromatin solüsyon içeren temizleyicide
    1. İlk hücre hücre topakları buz 10 min için arabelleğe şişme ek koşullar, fiske yerleşme önlemek için her birkaç dakikada hücreleri.
      Not: Genel olarak, arabellek şişme 500 µL 25 milyon hücrelere eklendi ve oradan ölçekli, ancak değil kullanımı daha az 500 µL için tampon yapmak < 25 milyon hücre.
    2. Dounce el ile hem saat yönünde ve saat yönünün tersine, her x 13.
    3. Sonra aşağı spin çekirdeği 1.500 x g., 5 min için 4 ° C'de süpernatant tamamen Aspire edin ve kalan süpernatant kaldırmak için yineleyin ve sonra hücre Pelet mg tartmak.
    4. Proteaz inhibitörü çekirdeği lizis arabelleğe ekleyin (Farnham arabellek veya RIPA tampon, yukarıda, birini seçin).
    5. Çekirdeklerin lizis arabellek 10 x miktarda pelleted çekirdekler için resuspend ekleyin (örneğin, 1 mL çekirdek lizis arabellek 0,100 g Pelet ekleyin). Kısaca girdap ve buz üzerinde 10 min için koşullar.
      Not: sonication tüp boyutunu göz önünde bulundurun. İdeal birimdir kez < 1 mL örnekleri granül çok büyük eğer bölünmüş olması gerekebilir.
      1. Co-IP için çekirdek kısaca malzeme solubilize ve immunoprecipitation 2-3 birimleri seyreltme arabelleği ile izin veren bir düzeye SDS gidermek için solüsyon içeren temizleyicide sonra 7.4.6 adıma geçin. Çok hassas antikorlar için SDS konsantrasyonu daha da azaltmak için daha fazla seyreltme arabellek ekleyin.
        Not: lysate temizler sonication durdurur; Bunu bir opak/yarı saydam beyaz tamamen saydam olarak değiştirir. Örnekleri kadar soğuk tutmak ve değil üzerinden solüsyon içeren temizleyicide.
      2. Çip, iyice 150-1000 bp DNA parçalarının elde etmek için DNA'sı solüsyon içeren temizleyicide sonra 7.4.6 adıma geçin.
    6. 4 ° C'de 10 dakika için maksimum hızda çözünmez malzeme dışarı spin
    7. Çözünür malzeme için taze bir tüp aktarın.
    8. Co-IP için protein konsantrasyonu ölçmek ve açılan 7.5 adımda devam edin.
    9. Yonga için 10 µL aliquot in çıkarmak lysate temizlenir ve 40 µL IP elüsyon tampon ve 6 µL 5 M eklemek buna NaCl 56ul olmak üzere toplam. 95 ° C'de 15 dakika kaynatın, 3 M NaOAc pH 5, 5-10 µL ekleyin ve bir PCR arıtma sütun temizle. DNA toplama 260 absorbans ölçerek ölçmek nm ve örnekler üzerindeki standartlaştırmak. Daha sonra açılan adım 7.5 için devam.
      Not: Ekstra lysate olabilir ek-80 ° C'de donmuş ve daha sonra kullanılan, ancak en iyi sonucu almak taze lysate elde edilir. Donma, donma/lysate daha çözülme değil bir kez daha.
  5. Açılan
    1. Protein lysate uygun bir miktar taze bir tüp aktarın. Farnham lizis arabellek kullanıyorsanız, IP seyreltme arabellek (üstte) 2.1 cilt olarak sulandırmak.
    2. 100 µL süpernatant giriş denetimi için bir kenara ve 4 ° C'de ertesi güne kadar saklayın.
    3. Boncuk/antikor eşlenik adımından 7.3.8 örnekleri için şimdi ekleyin.
    4. Örnekleri 4 ° C'de gecede döndürün ve yeterli hacim 1,5 mL tüpler içinde sıvı hareketi için olduğundan emin olun.
  6. Yıkama ve Elute
    1. Gecede döndürme sonra süpernatant nonbinding kesir olarak kaydedin. Daha sonra yıkama 3-5 x IP seyreltme arabelleği boncuk.
    2. IP elüsyon arabellek inhibitörleri olmadan oda sıcaklığında hazırlayın.
    3. Bir girdap 15 dk. Transfer elüsyon için yeni bir tüp için 67 ° C'de sarsıldı 50 µL elüsyon arabelleği ile kompleksleri elute ve tekrar başka bir 50 µL. birleştirin ikisini bir toplam 100 µL elüsyon için.
      Not: Bu elüsyon yordamdan gelen çok fazla arka plan ise, ısı azaltılmış olabileceği gibi sallayarak/kuluçka sırasında ortadan kaldırılmıştır. Bu genellikle hedef protein verimini azaltır ancak arka plan önemli ölçüde azaltabilirsiniz.
  7. Isıtma için 67 ° C'de tarafından Glossar ters > 4 h.
    Not: Bu ortak IP için kesinlikle gerekli değil ama yararlı olabilir.
    1. Co-IP için faiz hedefler arasında tam dimerization emin olmak için eluates bir SDS-sayfa jel ve yoklama HA etiketi veya bayrak etiketi, karşı antikor ile tüm 1:1000 belirtildiği şekilde çalıştırın. Adım 8'e geçin.
    2. ChIP-qPCR için doğru yerelleştirme ve her CRISPR dCas9 bileşeni hedefleme emin olmak için bir sütunda elüsyon ürün temiz ve 10 µL. gerçekleştir gerçek zamanlı nicel polimeraz zincir tepkimesi içinde (qPCR) saf DNA elute. Ek tablo 1' de sunulan verilerde kullanılan astar kullanılabilir. Adım 8'e geçin.

8. RNA çıkarma ve kantitatif PCR

  1. Gen ifadesinin CLOuD9 kaynaklı değişiklikleri öğrenmek için ilk olarak, izole ve denetim hücre topakları ve dimerized hücre topakları toplam RNA arındırmak.
  2. Tamamlayıcı DNA (cDNA) Ters transkripsiyon17 tarafından arıtılmış RNA yapmak ve qPCR çözümlemesi. Astar ek tablo 1' de kullanılabilir.

9. kromozom Conformation yakalama tahlil

  1. Değişiklikleri CLOuD9 tarafından indüklenen genomik loci kişiler sıklıkla gözlemlemek, kromozom conformation yakalama (3 C) gerçekleştirmek için8deneyleri.
  2. 3 C ligasyonu ürünler iki yineleme kümesi içinde her biri üç biyolojik çoğaltır nicel gerçek zamanlı PCR tarafından için ölçmek. Örnekleri 3 C sinyalleri tübülin locus normalleştirmek. Astar ek tablo 1' de kullanılabilir.

Sonuçlar

CLOuD9 tersinir β globin organizatörü-LCR döngü indükler. CLOuD9 sisteminin uygun kullanımı tamamlayıcı CSA tersinir temas neden olmaktadır ve CSP CLOuD9 alanlarının eklenmesini ve kaldırılmasını ABA hücre kültür ortamına (Şekil 1a) aracılığıyla oluşturur. CSA ve CSP yapıları (Şekil 1b) standart CRISPR gRNAs kullanarak uygun genomik bölge için yerelleştirilmiştir. İnsan globin locus yanı sıra sık sık kromozom katlama ve orada geliştirme sırasında oluşan düzenlenmesi geniş belgelerine göz önüne alındığında, bu bölge CLOuD9 sistem yardımcı programı göstermek için seçildi. Ayrıca, sürekli olarak yüksek düzeyde genellikle sağlıklı yetişkin erythroid lineage hücrelerde ifade edilir β globin gen aksine fetal γ-globin gen ifade etmek gösterilmiştir çünkü K562 hücre kültürünü seçildi. K562 hücreler kullanarak, CLOuD9 gen ekspresyonu değiştirme becerisini ifade β globin gen Bu hücre satırı geri yüklemek çalışırken tarafından incelenebilir.

Dimerization, immunoprecipitation-kantitatif PCR (ChIP-qPCR) doğru yerelleştirme ve her CLOuD9 bileşeni hedefleme emin olmak için kullanılan kromatin İndüksiyon öncesi (Tamamlayıcı Şekil 1). Ayrıca, co-immunoprecipitation (Co-IP) ve ABA olmadan CSA ve CSP dimerization ligand hem de reversibility (Şekil 1 c ve ek Şekil 2) ligand yokluğunda huzurunda doğrulanmadı. ABA ekledikten sonra 24 h, β globin ve LCR arasında daha fazla temas çıktı olarak her iki dimerization parçaları ile hücrelerde kromozom conformation yakalama (3 C) tarafından ölçülen ama değil sadece iki CSA veya CSP yapıları, böylece doğrulama içeren denetimler özgüllük kromatin değişim için hedeflenen siteleri (1 c rakam ve takıma giren rakamlar 3,4). LCR-β-globin etkileşimi oluşturma tamamen endojen LCR-globin temas ortadan kaldırmadı, ama bunun yerine, özgün kişi, daha önce bildirilen8olarak eklenir. β-globin/LCR kişiler artışlar için en fazla 72 saat (ek rakamlar 5,6) hedeflenen LCR ve β globin organizatörü bölgesi içinde tam bölge ne olursa olsun dimerization tespit edildi. Son olarak, sistem reversibility endojen biçimi (Şekil 1 d ve ek resimler 3-6) tam bir yenilenme gösterdi ABA çıkardıktan sonra 3 C ile doğrulandı.

Düşündüğümüz ikinci bir hücre satır bu fikir keşfetmek için kullanılmıştır bu yüzden K562 hücrelerde gösterilen başarı euchromatin (Şekil 1 d), globin locus konumunu bir bölgede bir sonucu olabilir. CLOuD9 sistem heterochromatic ve globin genleri (Şekil 1e) ifade edemediği bölgelerde HEK 293T hücrelere uygulanmış. Sonuç K562s içinde ne gözlendi benzer; daha fazla β globin LCR ilişkiye ABA (Şekil 1e ve Tamamlayıcı şekil 3), ile 24 saat sonra 3 C tarafından ölçüldü CLOuD9'ın sağlam yetenek-e doğru orijinal kromatin haline rağmen farklı hücresel ortamlarda işlevi için delil sağlama ya da biçimi.

Ek loci Oct4 organizatörü ve 293T hücrelerin içindeki artırıcı distal 5' de dahil olmak üzere geniş uygulanabilirliği CLOuD9, emin olmak için test edildi. Daha önce bu hücre kültürünü yok algılanabilir Oct4 ifade ve ayrıca, endojen temas açıklanan yok olmuştur. Embriyonik kök hücre ile distal 5' artırıcı kişiden sonuçlanan ifadede Oct4 kanıtı bu deneye motive ve aynı sonucu β globin locus18gözlendi. Oct4 arasında iletişim distal artırıcı ve organizatörü tespit CLOuD9 etkin hücre, ama değil kontrol hücreleri (Şekil 1f). Ayrıca, Oct4 organizatörü ve distal 5' artırıcı etkileşim de bir 3' artırıcı Oct4 organizatörü temas istenir gözlendi. Bu olay 3' artırıcı Oct4 organizatörü/5 ile etkileşim kanıt ile tutarlıdır ' distal artırıcı endojen gen harekete geçirmek10sırasında karmaşık.

CLOuD9 indükler bağlam belirli değişiklikler, gen loci. Gen ifadesinin etkisi döngüler incelemek aradığımız CLOuD9 sistem gerçekten gen loci, kromozom kişileri ikna etmek onayladıktan sonra. Transkripsiyon globin ve Oct4 genler için ilgili kişiler arasında ve distal 5' artırıcı ve Oct4 organizatörü, sırasıyla1,11LCR ve globin gen loci arasında şarta dokümante edilmiştir. Böylece, sürücü kromatin döngü oluşumu her bu bölgede sisteme zorlayıcı gen ifadesinde neden olur CLOuD9 kullanarak olan.

Her iki loci RT-qPCR bu indüklenen ABA kromatin döngüler Oct4 ifade 293T hücrelerde ve β globin ifade K562 hücrelerinde artış sürdü değil 293Ts rağmen içinde gösterilen (Şekil 2a). Yine de kültür kadar az 24 s artan β globin ifade için önemli ölçüde, hücre için ABA ifade eklenmesi 72 saate kadar giderek artmaya devam etmiştir ve ABA silinerek geçiş (Şekil 2a) geri döndürülebilir. Denetimleri dışında K562 hücrelerin tümünü dimerization bileşenleri LCR ve β globin organizatörü bölgelerde (Şekil 2a ve takıma giren rakamlar 7,8) bulunduğu olursa olsun bu trend izledi. Bu bulgular destek ChIP-qPCR H3K4me3 ve RNA Pol-II β globin locus K562s ve 293Ts adlı Transkripsiyon (Şekil 2 c-f) gözlenen değişiklikler ile denk.

CLOuD9 kurar istikrarlı kromatin döngüler. Kısa vadeli döngü indüksiyon CLOuD9 ile açıkça beklentileri, takip rağmen döngü uzun vadeli indüksiyon farklı etkileri oldu kaldı dikkat edilmelidir. Bunu araştırmak için hücreleri 10 gün boyunca ABA huzurunda kültürlü. Hem K562s hem de 293Ts β globin odağı ve LCR denetimleri (Şekil 3a, b ve takıma giren rakamlar 9,10) göre arasında artan iletişim frekans sergilenen iken, hala sadece değişiklikler β globin ifade gözlendi K562 hücrelerinde (Şekil 3 c). İlginçtir, ancak, bu uzun süreli gözlenmiştir transkripsiyon neredeydi kuvvetle upregulated, K562s, dimerization yok uzun tersinir (Şekil 3a ve takıma giren rakamlar 9-11) yapıldı. Ancak, nerede transkripsiyon hiçbir değişiklik uzun vadeli dimerization gözlenmiştir, 293Ts değişiklikler tersine çevrilebilir kaldı kromatin kişiler (Şekil 3b ve Tamamlayıcı Şekil 9) indüklenen.

Genel olarak, 10 gün önce dimerization (Şekil 3 c) gen ifade düzeyden anlamlı olarak daha yüksek kaldı ABA kaldırma sonra gen ifadesi yalnızca küçük bir düşüş gözlenmiştir. Bu uygun olarak karşılaştırıldığında K562 hücreler, ancak değil 293T hücreleri, H3K4me3 ve RNA Pol-II β globin locus ChIP-qPCR tarafından sürekli değişiklikler gösterdi denetimlere, ABA kaldırma (şekil 3d-f) 10 gün sonra bile. Böylece, kromatin döngü kararlılığını daha fazla sürdürülebilir gen ekspresyonu anlamına gelir bizim sonuçları gösterir.

figure-results-7667
Resim 1: CLOuD9 tersinir β globin organizatörü-LCR döngü neden olmaktadır. (a) Absisik asit (ABA, yeşil) yanı sıra iki tamamlayıcı CLOuD9 yapıları getiriyor (CLOuD9 S. pyogenes (CSP), CLOuD9 S. aureus (CSA), kırmızı ve mavi, sırasıyla) yakınlık, kromatin yapısı remodeling içine. ABA kaldırılması endojen kromatin uyum geri yükler. (b) CLOuD9 yapıları ile ters dimerizeable PYL1 ve ABI1 etki CRISPR-dCas9 teknolojisi S. aureus ve S. pyogenes birleştirin. (c) zaman çizelgesi CLOuD9 dimerization deneyler. (d) 3 C ABA (kırmızı) ile tedavinin 24 h sonra ölçme β globin locus çapında crosslinking frekansları K562 hücrelerdeki tahlil ve reversibility, gösterilen sonraki silinerek geçiş (mavi) β-globin/LCR kişiler (gri renkle vurgulanır) indüklenen. Turuncu ok uçları belirli CLOuD9 yapı hedef bölgeleri gösterir. Aşırı duyarlılık LCR (siyah bar) 1-4 sitelerin içeren EcoRI parçası çapa bölgesi olarak kullanıldı. Crosslinking frekansını belirtilen diğer EcoRI parçalarıyla (adları grafiğin üst kısmında) değerlendirildi. İnsan β globin genleri ve LCR aşırı duyarlılık siteleri alt kısmındaki grafik kromozom konum koordinatları ile tasvir edilir. ChIP-seq H3K4me3 ve H3K9me3 gelen verileri göstermek bu bölge K562s. (e) benzer euchromatic kromatin yapısı tersinir değişiklikleri rağmen H3K4me3 ve H3K9me3 ChIP-seq veri kanıtlardan HEK 293T hücrelerde görülür Bu globin Bu hücre tipinde heterochromatic bölgesidir. ABA (kırmızı) ile gösterilen tedavinin 72 h Oct4/distal artırıcı kişiler (gri renkle vurgulanır) indüklenen sonra Oct4 locus çapında crosslinking frekansları 293T ölçme (f) 3 C tahlil hücreleri. Turuncu ok uçları belirli CLOuD9 yapı hedef bölgeleri gösterir. Oct4 organizatörü (siyah bar) içeren MboI parçası çapa bölgesi olarak kullanıldı. Crosslinking frekansını belirtilen diğer MboI parçalarıyla (adları grafiğin üst kısmında) değerlendirildi. İnsan Oct4 bölgeleri alt kısmındaki grafik kromozom konum koordinatları ile tasvir edilir. Tüm 3C sonuçları en az üç bağımsız deneylerden elde edilmiştir. 3C değerleri tübülin için normalleştirilmiş. β-globin için etkileşim frekansları arasında bağlantı parçası ve β/HS parçası kapsayan parçası sıfır olarak ayarlanmış. İçin Oct4, etkileşim frekansları arasında bağlantı parçası ve bir negatif kontrol parçası Oct4 etkileşen bölge dışında sıfır olarak ayarlanmış. Hata Çubuklarõn s.d. n = 3. Bu şekil Şekil 1 Morgan, Stefanie L., et al. değiştirildi 9. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

figure-results-10612
Şekil 2: CLOuD9 gen ifade ve kromatin durumda içerik belirli değişiklikler neden olmaktadır. (a) CLOuD9 kaynaklı kromatin β globin odağı döngü β globin ifade K562s ama tedavi kontrol hücreleri göre verilen değil 293Ts. önemi tersinir indüksiyon sonuçlanır. İki kuyruklu öğrenci t-testleri * P < 0,05, t 3.418, df = = 5; P < 0.0001, t 10,42 = df = 5; tutarak önemli olmayan. Hata Çubuklarõn s.d. n = 3. (b) ifade 293Ts takip CLOuD9 kaynaklı gözlendi Oct4 indüksiyon aynı locus döngü. Önemi tedavi kontrol hücreleri göre verilir. İki kuyruklu öğrenci t-testleri * P < 0,05, t 4.562, df = = 2. Hata çubukları s.d. (c) şematik β globin gen vücut boyunca ChIP-qPCR astar yerlerin gösterir. (d, e) ChIP-qPCR β globin locus K562s ama 293Ts içinde vasıl H3K4me3 içinde ters çevrilebilir değişiklikler CLOuD9 kaynaklı döngü takip gösterir. İki kuyruklu öğrenci t-testleri * P < 0,05, ** P < 0,001, *** P < 0,0001. Hata çubukları s.d. (f) β globin gen vücut tamamını karşıdan karşıya RNA Pol-II doluluk artış ile K562s β globin transkripsiyon aracılı değişikliklere karşılık CLOuD9 gösterir. İki kuyruklu öğrenci t-testleri * P < 0,05, ** P < 0,001, *** P < 0,0001. Hata çubukları s.d. belirtmek Bu şekil Şekil 2 Morgan, Stefanie L., arkdeğiştirildi. 9. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

figure-results-12407
Şekil 3: CLOuD9 uzun dönemli dimerization aşağıdaki sağlam gen ekspresyonu sürdürmek istikrarlı kromatin döngüler kurar. (a, b) 3 C tahlil bile ABA en çok 10 izleyen gün boyunca kaldırıldığında K562s ama değil 293Ts CLOuD9 kaynaklı kromatin döngü ABA tedavi, 10 gün sonra geri dönüşü olmayan olur gösterir. Tüm 3C sonuçları en az üç bağımsız deneylerden elde edilmiştir. 3C değerleri tübülin için normalleştirilmiş ve çapa parçası ve β/HS parçası kapsayan parçası arasındaki etkileşim Frekanslar sıfır olarak ayarlayın. Hata Çubuklarõn s.d. n = 3. (c) β-globin, düz ABA silinerek geçiş sadece 10 günlük tabi kalıcı ifadede döngü sabitleme K562s içinde sonuçlanır. Herhangi bir değişiklik β globin ifade tedavi kontrol hücreleri göre verilen 293Ts. önemi gözlenir. İki kuyruklu öğrenci t-testleri *** P < 0.0001, t 5.963, df = = 5; H3K4me3 işaretleri CLOuD9 kaynaklı döngü karşılık beta-globin locus üzerinde tutarak önemli olmayan (d) ChIP-qPCR gösteren artışlar sürekli ligand silinerek geçiş K562s. iki kuyruklu öğrenci t10 gün takip-testleri * P < 0,05, ** P < 0,001, *** P < 0,0001. H3K4me3 hiçbir önemli değişiklik sinyalleri aşağıdaki uzun vadeli dimerization 293Ts. (f) içinde uzun vadeli döngü indüksiyon takip β globin locus arttı RNA Pol-II doluluk ChIP-qPCR tarafından gözlendi (e) K562s içinde devam edildi ligand silinerek geçiş sadece 10 günlük takip. İki kuyruklu öğrenci t-testleri * P < 0,05, ** P < 0,001, *** P < 0,0001. Tüm hata çubukları s.d. belirtmek Bu şekil Şekil 3 Morgan, Stefanie L., arkdeğiştirildi. 9. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Ek Şekil 1: CLOuD9 yapıları yerelleştirmek için onların amaçlanan hedef bölgeleri. Kromatin immunoprecipitation ve kantitatif PCR CLOuD9 yapıları doğru localization-e doğru onların hedeflenen genomik loci göstermektedir. Bu rakam ek resim 1 Morgan, Stefanie L., arkdeğiştirildi. 9. Bu rakam indirmek için buraya tıklayınız.

Ek Şekil 2: geri dönülebilir olarak CLOuD9 yapıları ilişkilendirmek ABA tedaviye yanıt. Co-immunoprecipitations ABA tedavi aşağıdaki 72 h dCas9 proteinler Derneği gösteren aşağıdaki sonraki ligand silerek geç 72 h ters. Bu rakam ek Şekil 2 Morgan, Stefanie L., arkdeğiştirildi. 9. Bu rakam indirmek için buraya tıklayınız.

Ek şekil 3: denetim tedavi kromatin rehberde herhangi bir değişiklik neden olmaktadır. 24 saattir DMSO, bir denetim aracı ile tedavi herhangi bir değişiklik endojen kromatin biçimsel 3 C iki K562 hücrelerdeki tarafından neden olmaktadır veya HEK 293Ts. 3C değerleri tübülin ve etkileşim frekansları arasında bağlantı parçası ve parça için normalleştirilmiş β/HS parçası kapsayan sıfıra ayarla. Hata Çubuklarõn SD n = 3. Bu rakam ek şekil 3 Morgan, Stefanie L., arkdeğiştirildi. 9. Bu rakam indirmek için buraya tıklayınız.

Ek Şekil 4: denetim transduced CLOuD9 hücreleri gösterir hiçbir değişiklik kromatin döngü içinde. İki yönetmenlik CLOuD9 ya LCR oluşturur veya β globin organizatörü kromatin yapısında önemli değişiklik 3 ABA tedavi kontrol tedavi göre aşağıdaki C tarafından neden olmaktadır. 3C değerleri tübülin için normalleştirilmiş ve çapa parçası ve β/HS parçası kapsayan parçası arasındaki etkileşim Frekanslar sıfır olarak ayarlayın. Hata Çubuklarõn SD n = 3. Bu rakam ek Şekil 4 Morgan, Stefanie L., arkdeğiştirildi. 9. Bu rakam indirmek için buraya tıklayınız.

Ek Şekil 5: dimerization 72 saat sonra tersine çevrilebilir kalır CLOuD9 kromatin döngü. K562s 3C tahlil CLOuD9 reversibility β-globin/LCR kişiler ABA tedavi 72 saat sonra indüklenen gösterir. 3C değerleri tübülin için normalleştirilmiş ve çapa parçası ve β/HS parçası kapsayan parçası arasındaki etkileşim Frekanslar sıfır olarak ayarlayın. Hata Çubuklarõn SD n = 3. Bu rakam ek Şekil 5 Morgan, Stefanie L., arkdeğiştirildi. 9. Bu rakam indirmek için buraya tıklayınız.

Ek Şekil 6: CLOuD9 indüklenen β-globin/LCR döngü değil globin hedef site tarafından etkiledi. CSA ve CSP yönetmenlik LCR veya döngü indüksiyon benzer tersinir değişiklikleri β globin organizatörü sonuçlarında diğer bölgeler için 3 C tarafından ABA tedavi 72 saat takip oluşturur. 3C değerleri tübülin için normalleştirilmiş ve çapa parçası ve β/HS parçası kapsayan parçası arasındaki etkileşim Frekanslar sıfır olarak ayarlayın. Hata Çubuklarõn SD n = 3. Bu rakam ek Şekil 6 Morgan, Stefanie L., arkdeğiştirildi. 9. Bu rakam indirmek için buraya tıklayınız.

Ek Şekil 7: gen ifadesinde bağlı değişiklikler globin hedef site ne olursa olsun sürekli CLOuD9. CSA ve CSP yönetmenlik β globin organizatörü diğer bölgelerinde yapıları ve LCR gen ekspresyonu dimerization 72 h takip indüksiyon üzerinde herhangi bir etkisi yoktur. Ancak, bazı aşağıdaki uzun vadeli (10 gün) dimerization gözlenmiştir gen ekspresyonu gücüne etkisi iken, β-globin tedavi kontrol hücreleri göre yüksek düzeyde 10 ek gün boyunca sürekli aşağıdaki sonraki ligand silinerek geçiş edildi. Önemi tedavi kontrol hücreleri göre verilir. p < 0,001, t 10.25, df = = 5; p < 0,0001, sol için doğru t 8.697, df = = 6, t 40.31, df = = 7; tutarak önemli olmayan. Tüm hata çubukları SD gösterir Bu rakam ek Şekil 7 Morgan, Stefanie L., arkdeğiştirildi. 9. Bu rakam indirmek için buraya tıklayınız.

Ek Şekil 8: denetim transduced CLOuD9 hücreleri gösterir hiçbir değişiklik β globin ifadede. İki yönetmenlik CLOuD9 ya LCR oluşturur veya β globin organizatörü ABA tedavi kontrol tedavi göre aşağıdaki β globin ifade hiçbir önemli değişikliklere neden olmaktadır. Önemi tedavi kontrol hücreleri göre verilir. tutarak önemli olmayan. Bu rakam ek Şekil 8 Morgan, Stefanie L., arkdeğiştirildi. 9. Bu rakam indirmek için buraya tıklayınız.

Ek Şekil 9: uzun süreli kontrol tedavi kromatin rehberde herhangi bir değişiklik neden olmaktadır. 3 c iki K562 hücrelerdeki endojen kromatin biçimsel hiçbir değişiklik DMSO, bir denetim aracı ile tedavi 10 gün boyunca indükler veya HEK 293Ts. 3C değerleri tübülin ve etkileşim frekansları arasında bağlantı parçası ve parça için normalleştirilmiş β/HS parçası kapsayan sıfıra ayarla. Hata Çubuklarõn SD n = 3. Bu rakam ek Şekil 9 Morgan, Stefanie L., arkdeğiştirildi. 9. Bu rakam indirmek için buraya tıklayınız.

Ek Şekil 10: uzun vadeli indüklenen β-globin/LCR döngü değil globin hedef site tarafından etkilenen CLOuD9. CSA ve CSP yönetmenlik LCR diğer bölgelerinde oluşturur veya β globin organizatörü sonuçlarında benzer şekilde sürekli döngü indüksiyon 3 C tarafından 10 gün ABA tedavi ve 10 gün sonraki ligand silinerek geçiş aşağıdaki gösterildiği gibi. 3C değerleri tübülin için normalleştirilmiş ve çapa parçası ve β/HS parçası kapsayan parçası arasındaki etkileşim Frekanslar sıfır olarak ayarlayın. Hata Çubuklarõn SD n = 3. Bu rakam ek Şekil 10 Morgan, Stefanie L., arkdeğiştirildi. 9. Bu rakam indirmek için buraya tıklayınız.

Ek Şekil 11: geri dönüşümsüz CLOuD9 yapıları ilişkilendirmek için uzun vadeli ABA tedaviye yanıt. Co-immunoprecipitations geri dönüşü olmayan ABA tedavi 10 gün ve ligand silerek geç 10 sonraki gün aşağıdaki CSA ve CSP dCas9 proteinleri Derneği gösteren. Bu rakam ek Şekil 11 Morgan, Stefanie L., arkdeğiştirildi. 9. Bu rakam indirmek için buraya tıklayınız.

Ek tablo 1: astar listesi serileri gRNAs, qRT-PCR, 3 C ve ChIP qPCR. Bu tablo ek tablo 1 Morgan, Stefanie L., arkdeğiştirildi. 9. Bu tabloyu indirmek için buraya tıklayınız

Tartışmalar

The Most CLOuD9 kromatin döngü kritik adım vardır: 1) tasarlama veya doğru gRNAs kullanarak, ABA veya DMSO, dahil olmak üzere günlük CLOuD9 transduced hücrelerde, 2) değişen medya 3) ABA tazeliğini korumak ve 4) doğru ve dikkatli değerlendirme gerçekleştirme Kromatin biçimi.

CLOuD9 sınırlarını öncelikle hedef bölgeyi tercih kılavuzları tasarım yeteneği bulunur. Kılavuzu RNA'ların dCas9 bileşenleri dimerized için hedef DNA bölgelerine yerelleştirme önemli görevi gerçekleştirmek ve kılavuzları etkinliğini belirli hedef sitede temel alır. Uygun gRNA bileşenleri sistem geri dönülebilir olarak oluşturmak mümkün olmayacaktır CLOuD9 döngüler indüklenen. Böylece, ilgi her bölge için birden çok kılavuzları tasarlama ve kılavuzları 250-1000 bp bir bölge üzerinde yayılıyor, en az bir başarılı Kılavuzu sağlanacak. Kılavuzu konumu da doğru sonuçlar için ayrılmaz bir parçasıdır. Arka plan efektleri gibi yukarı veya aşağı transkripsiyon önlemek için kılavuzları transkripsiyon faktörü bağlayıcı siteleri veya diğer kritik bölgelerde bulunan önlemek önemlidir. Ayrıca, CLOuD9 yapýsý tam yerini biraz hedef Gen transkripsiyonu etkileyebilir. Bu kılavuzların her hedef bölgenin en güçlü çifti için Deneysel amaçlar tanımlamak için birden çok ikili test önemini vurgular. Ayrıca, her çifti hedef bölgeleri, CSA yapı gRNAs ile S. aureusiçin hedef olmalıdır ve CSP yapı gRNAs ile S. pyogenes için özgüllük hedefleme için hedef olmalıdır.

Doğru sonuçlar ve doğru dimerization emin olmak için bu da CLOuD9 yapıları, iletim takip hücresel ortamlar tazeliğini korumak önemlidir. Günlük medya değiştirmek ve taze dimerizer (veya kontrol) eklenmesi tamamlayıcı yapıları yakınlık içinde kalır ve değiştirilmiş kromatin biçimi korumak sağlar. Ayrıca, ABA taze ve uygun şekilde (6 ay, soğuk, ışıktan korunan muhafaza açılır) üreticinin protokolüne göre depolanan garanti otantik sonuçları elde etmek için esastır.

Özellikle, daha yaygın olarak kullanılan FRB ve FKBP sistemi yerine CLOuD9 ABA dimerizer ABI ve PYL dimerization proteinler ile kullanıldı. Bir rapalog gerekliliği FRB/FKBP sistemi için CLOuD9, uygulanabilirliği için kanser hücrelerinin zehirlenmesi nedeniyle sınırlı. Alternatif ABI/PYL sistemi etkili bir şekilde daha geniş kullanılabilecek olmak CLOuD9 etkinleştirme bu sınırlama hile.

Topluca, biz CLOuD9, zorla ama geri dönülebilir olarak kişiler arasında uzun menzilli hedef genomik loci oluşturmak benzersiz ve güçlü bir teknoloji geliştirdik. Kromatin döngüler inducing aracılığıyla, biz de CLOuD9 gen ekspresyonu uygun hücresel bağlamda değiştirmek için kullanılması gereken göstermek. Sınırsız çalışma bölgeleri döngüye veya mekanizmaları döngü ile ön bilgi gerek kalmadan herhangi bir iki genomik loci arasındaki etkileşimler için teknolojiye uyum sağlar. Buna ek olarak, CLOuD9'ın benzersiz gösterdiği reversibility daha fazla döngü mekanizmaları incelenmesi hastalık ve geliştirme sağlar. Kromatin döngü hedef üzerinde etkilerini açıkça göstermiştir, orada iken henüz hedef üzerinde döngüler hedef kapalı döngü ve sonraki etkisi etkileri içgörü sunan veri olmak.

Bizim veri bu araç sadece birkaç uygulamaları göstermektedir ancak kromatin düzenleme gen ifadesi göstergesidir büyük temel fikir anlamına gelir. Bizim teknoloji çalışma ve gen düzenlemesi, böylece genlerin transkripsiyon katlama kromatin rolü genel anlayışı artırma kromatin yapısında nüansları ortaya çıkarmak için kullanılabilir. Transkripsiyon dynamics inceliklerini daha iyi anlaşılmasını araştırma ve tedavi kanser, kalıtsal hastalıklar ve konjenital bozukluklar, hangi farklı kromatin derleme şüphesiz gen ifade20değiştirir şekilde yol açabilir, 21,22,23. Sonraki çalışma CLOuD9 teknoloji kullanarak daha fazla düzenleme ve kromatin etki alanları ve nasıl onlar istikrarlı gen ekspresyonu geliştirme ve hastalık sürdürebilmek için katlama sürücü dinamiklerini ayrıntılarını yanacaktır.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

H. Chang, T. Oro, S. Tavazoie, R. Flynn, P. Batista, E. Calo ve tüm Wang laboratuvar teknik destek ve makalenin eleştirel okuma için teşekkür ederiz. S.L.M. NSFGRF (DGE-114747), NDSEGF (FA9550-11-C-0028) ve Ulusal Kanser Enstitüsü (1F99CA222541-01) aracılığıyla bu çalışmalarında desteklenmiştir. K.C.W. bir kariyer Ödülü Burroughs Wellcome fondan tıp bilim adamları için desteklenir ve Donald E. ve Delia B. Baxter Vakfı Fakültesi bilim adamı.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
RPMI 1640  mediaLife Technologies11875-119For K562 cell culture
DMEM mediaLife Technologies11995-0651X, for 293T cell culture
lentiCRISPR v2Addgene plasmid#52961For CLOuD9 plasmid development
pRSV-RevAddgene plasmid#12253For lentivirus production
pMD2.GAddgene plasmid#12259For lentivirus production
pMDLg/pRREAddgene plasmid#12251For lentivirus production
Lipofectamine 2000Thermo Fisher Scientific11668-019For lentivirus production
anti-HA antibodyCell Signaling3724For immunoprecipitation
anti-Flag antibodySigmaF1804For immunoprecipitation
DNeasy Blood and Tissue KitQiagen69504For DNA extraction
TRIzolLife Technologies15596-018For RNA extraction
RNeasy KitQiagen74106For RNA extraction
Superscript VILOLife Technologies11754-050For cDNA 
SYBR Green I MasterMixRoche4707516001For qPCR analysis
Light Cycler 480IIRocheFor qPCR analysis
anti-H3K4me3 antibodyAbCamab8580For ChIP-qPCR
anti-RNA Pol-II antibodyActive Motif61083For ChIP-qPCR
EDTA free protease inhibitorRoche11873580001For protein extraction
4-12% Tris Glycine gelBioradAny size, For western blot
anti-Rabbit HRP antibodySanta Cruzsc-2030For western blot
anti-mouse HRP antibodyCell Signaling7076SFor western blot
K562 and H3K293 ChIP-Seq dataEncodeENCSR000AKUFor ChIP-seq analysis
K562 and H3K293 ChIP-Seq dataEncodeENCSR000APEFor ChIP-seq analysis
K562 and H3K293 ChIP-Seq dataEncodeENCSR000FCJFor ChIP-seq analysis
K562 and H3K293 ChIP-Seq dataGEOGSM1479215For ChIP-seq analysis
Dynabeads Protein A for ImmunoprecipitationThermo Fisher Scientific10001DFor immunoprecipitation
Dynabeads Protein G for ImmunoprecipitationThermo Fisher Scientific10004DFor immunoprecipitation
RNA Clean & Concentrator-5Zymo ResearchR1015For RNA purification
Pierce 16% Formaldehyde Methanol-freeThermo Fisher Scientific28908For crosslinking
PX458 PlasmidAddgene48138Suggested active Cas9 plasmid for gRNA cloning, but any active Cas9 plasmid will do
QIAquick PCR Purification KitQiagen28104For PCR purification
FastDigest BsmBIThermo Fisher ScientificFD0454For cloning guide RNAs
FastAPThermo Fisher ScientificEF0651For cloning guide RNAs
10X FastDigest BufferThermo Fisher ScientificB64For cloning guide RNAs
QIAquick Gel Extraction KitQiagen28704For cloning guide RNAs
10X T4 Ligation BufferNEBB0202SFor cloning guide RNAs
T4 PNKNEBM0201SFor cloning guide RNAs
2X Quick Ligase BufferNEBB2200SFor cloning guide RNAs
Quick LigaseNEBM2200SFor cloning guide RNAs
Buffers
Farnham lysis buffer1% Tris-Cl pH 8.0, 1% SDS, 1% protease inhibitor water solution (non-EDTA), and 1 mM EDTA in water
Modified RIPA buffer1% NP40/Igepal, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 1 mM EDTA, and 1% protease inhibitor water solution (non-EDTA) in PBS pH 7.8 or 7.4
IP dilution buffer0.01% SDS, 1.1% Triton-X 100, 1.2 mM EDTA, 16.7 mM Tris-HCl pH 8.0, 167 mM NaCl, 0.1x protease inhibitor
Wash buffer100 mM Tris pH 9, 100 mM LiCl, 1% NP-40, and 1% sodium deoxycholate
Swelling buffer0.1 M Tris pH 7.5, 10 mM potassium acetate, 15 mM magnesium acetate, 1% NP-40
Dilution buffer0.01% SDS, 1.1% Triton X-100, 1.2 mM EDTA, 16.7 mM Tris pH 8 and 167 mM NaCl
IP elution buffer1% SDS, 10% NaHCO3  

Referanslar

  1. Krivega, I., Dean, A. Chromatin looping as a target for altering erythroid gene expression. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1368, 31-39 (2016).
  2. Matharu, N., Ahituv, N. Minor loops in major folds: Enhancer-promoter looping, chromatin restructuring, and their association with transcriptional regulation and disease. PLoS Genet. 11, e1005640 (2015).
  3. Dekker, J., Martí-Renom, M. A., Mirny, L. A. Exploring the three-dimensional organization of genomes: interpreting chromatin interaction data. Nat. Rev Genet. 14, 390-403 (2013).
  4. Kim, A., Dean, A. Chromatin loop formation in the b-globin locus and its role in globin gene transcription. Mol Cells. 34, 1-5 (2012).
  5. Petrascheck, M., et al. DNA looping induced by a transcriptional enhancer in vivo. Nucleic Acids Res. 33, 3743-3750 (2005).
  6. Ameres, S. L., et al. Inducible DNA-loop formation blocks transcriptional activation by an SV40 enhancer. EMBO J. 24, 358-367 (2005).
  7. Deng, W., et al. Controlling Long-Range Genomic Interactions at a Native Locus by Targeted Tethering of a Looping Factor. Cell. 149, 1233-1244 (2012).
  8. Deng, W., et al. Reactivation of developmentally silenced globin genes by forced chromatin looping. Cell. 158, 849-860 (2014).
  9. Morgan, S. L., et al. Manipulation of Nuclear Architecture through CRISPR-Mediated Chromosomal Looping. Nature Communications. 8, (2017).
  10. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biol. 17 (1), 148 (2016).
  11. . . Lipofectamine 2000 Reagent. , (2013).
  12. . . DNeasy Blood & Tissue Kit Handbook. , (2006).
  13. . . Determining Genome Targeting Efficiency using T7 Endonuclase I (M0302). , (2016).
  14. Guschin, D. Y., et al. A rapid and general assay for monitoring endogenous gene modification. Methods Mol Biol. 649, 247-256 (2010).
  15. Shalem, O., Sanjana, N. E., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. , 83-87 (2014).
  16. . . RNeasy Mini Handbook. , (2012).
  17. . . SuperScript VILO cDNA Synthesis Product Information Sheet. , (2015).
  18. Theunissen, T. W., et al. Systematic identification of culture conditions for induction and maintenance of naive human pluripotency. Cell Stem Cell. 15, 471-487 (2014).
  19. Mokry, M., et al. Integrated genome-wide analysis of transcription factor occupancy, RNA polymerase II binding and steady state RNA levels identify differentially regulated functional gene classes. Nucleic Acids Res. 40, 148-158 (2012).
  20. Drier, Y., et al. An oncogenic MYB feedback loop drives alternate cell fates in adenoid cystic carcinoma. Nat Genet. 48, 265-272 (2016).
  21. Ryan, R. J. H., et al. Detection of enhancer-associated rearrangements reveals mechanisms of oncogene dysregulation in B-cell lymphoma. Cancer Discov. 5, 1058-1071 (2015).
  22. Montavon, T., et al. A regulatory archipelago controls Hox genes transcription in digits. Cell. 147, 1132-1145 (2011).
  23. Lupianez, D. G., et al. Disruptions of topological chromatin domains cause pathogenic rewiring of gene-enhancer interactions. Cell. 161, 1012-1025 (2015).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Genetiksay 139kromatin d ng lerkatlamagen ifadeCRISPRdCas9kromatin gen d zenlemesigeri d n ml dimerizationdinamik kromozom d zenlenmesi

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır