JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы представляем протокол к сцене и проанализируем развитие обоняния ткани от дрозофилы видов. Иссеченную ткань могут затем использоваться для молекулярного анализа, например количественного RT-PCR (обратный транскрипции-полимеразной цепной реакции) или РНК последовательности (RNAseq), а также в естественных условиях анализ таких иммуногистохимия или на месте гибридизации.

Аннотация

Обонятельная сенсорная система дрозофилы является широко используемой системой развития нейробиологии, систем неврологии, а также нейрофизиологии, поведения и поведенческих эволюции. Дрозофилы обонятельных тканей дом обонятельных рецепторов нейронов (ORNs), которые обнаруживают летучие химические сигналы наряду с гидро - и термо сенсорных нейронов. В этом протоколе мы описываем рассечение развития периферической обонятельных ткани взрослых видов дрозофилы . Мы сначала описывается этап и возраста личинок дрозофилы , следуют рассечение усиков диска от ранней стадии куколки, следуют рассечение антенн от середины куколки этапов и взрослых. Мы также показать методы, где препараты могут быть использованы в молекулярные методы, такие как извлечение RNA qRT-PCR, RNAseq или иммуногистохимия. Эти методы могут также применяться другие Drosophila видов после раз вегетационных куколки развития определяются, и соответствующих этапов рассчитывается для соответствующего старения.

Введение

Обонятельная сенсорная система дрозофилы является широко используемой системой развития нейробиологии, неврологии систем, а также нейрофизиологии, исследования поведения и поведенческих эволюция1,2,3, 4. Дрозофилы обонятельных тканей дом обонятельных рецепторов нейронов (ORNs), которые обнаруживают летучие химические сигналы наряду с гидро - и термо Сенсорные нейроны1,5,6. Общая цель этой рукописи должна продемонстрировать как этап и вскрыть развивающихся куколки и взрослых обонятельных ткани у дрозофилы видов. Обоснование этой техники заключается в создании образцов из различных куколки этапов для молекулярной и развития анализ периферической обонятельной системы, такие как RNAseq и количественного RT-PCR, кроме в vivo ткани маркировки методы . Этот метод может быть особенно полезно для выявления динамики транскрипционный анализ профиля в системе развивающихся взрослых обонятельных от не -melanogaster Drosophila видов, которые не имеют всех трансгенных реагенты для определенного типа клеток маркировка и анализы. В этой рукописи мы продемонстрируем вскрыть усиков дисков и антенн от видов дрозофилы куколки и взрослых. Во-первых мы покажем, как определить 0 h формирования puparium (АТФ, белые куколки или prepupae) для развития промежуточной и поставляемому старения дрозофилы . Далее мы покажем, как вскрыть усиков диски и третий усиков сегмент; в частности как отделить их от глаз диска и второй усиков сегмент для чистоты ткани, необходимые для RNAseq или RT-PCR. Этапы в D. melanogaster , указанных в настоящем Протоколе примерно соответствуют предварительно узорной усиков диск (prepupae), выбор прекурсоров из усиков диск (8 h НФА), начало дифференцировки терминала для ORNs (40 h НФА), и Взрослый антенна. Наконец мы даем примеры для количественного RT-PCR от взрослых антенн, изоляции с помощью метода, а для иммуногистохимии в естественных условиях . Этот метод может использоваться для создания образцов для анализа РНК/ДНК и иммуногистохимии на развитие периферийных обонятельных тканей из различных видов дрозофилы .

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Следующий протокол в соответствии с руководящими принципами этики Комитет по этике исследований университета Duke.

1. Подготовка тканей и развития постановка Drosophila melanogaster куколки

  1. Во-первых определите, как много мух, будет необходимо для рассечения. RT-PCR и RNAseq Соберите 100-200 усиков дисков и антенн от лиц, которые необходимы на этапах prepupal, 8 h НФА, 40 h НФА и взрослого. Для иммуногистохимии вскрыть 10-20 человек.
  2. Очистить все материалы, включая рассечение колодки и щипцы, с помощью салфетки с 70% EtOH. Если расчлененных материал является использоваться для извлечения РНК, очистить все РНКазы нейтрализаторами и сделать все решения с помощью свободной от нуклеиназы или диэтиловым pyrocarbonate (DEPC) очищенной воды.
    Примечание: Этот протокол использует силиконовые подушечки рассечение вместо стекла для вскрытия. Силиконовые накладки являются дружественными для сверхтонкого щипцами и способствовать быстрое и высокое качество вскрытия.
  3. Собирайте куколки в 0 ч НФА/prepupal стадии.
    1. Чтобы обеспечить наиболее точную постановку, контролировать личинки в 30 мин с интервалом 1 ч.
      Примечание: Блуждающих третьего instar личинок в умеренно переполненном бутылка будет скорее всего окукливаются в течение нескольких часов.
    2. Как только личинки становятся неподвижными и окружены очень легкий (почти белый) цветные куколки случай, перенести их в небольшой 2 - в Петри с влажной бумагой фильтра.
    3. Продолжаться в течение 1-2 ч, иногда мониторинга, выявления и перевода prepupae.
      Примечание: в качестве альтернативы, ясно бутылка всех куколок и позволяют личинки развивать за 2 ч. Все куколки собранных после 2 h будет в диапазон 0 - 2 h НФА.
  4. Сразу перейти к шагу 3.1 вскрыть prepupal усиков диск для этапа 0 h НФА. Если prepupa должен быть в возрасте, собрать их в блюдо, Обложка блюдо и место парафин фильм по краям подавляют сухости и место Петри при 25 ° C.
    Примечание: Куколки могут теперь быть в возрасте до eclosion.
  5. Для куколок, собранных в диапазоне 2 h, возраст prepupae на 2 часа меньше, чем требуемый возраст для того, чтобы обеспечить, что куколки не излишек.
  6. Используйте ультра-тонкой щипцы (Дюмон 55) ткани очень мелкие и хрупкие.

2. Подготовка тканей и развития стадии куколки от других видов дрозофилы

  1. Для определения длины куколки развития других видов дрозофилы , поместите образцы при оптимальной температуре, записывать даты, когда наблюдаются prepupae, сортировать их в свежий флакон и записывать количество дней от prepupa до совершеннолетия.
  2. Запишите отношение времени куколки развития для не -melanogaster видов и melanogaster. Умножьте коэффициент развития времени на количество часов, используемых для постановки melanogaster чтобы получить количество часов, чтобы возраст не -melanogaster видов.

3. рассечение D. melanogaster куколки усиков диска

Примечание: Все раз старения и протоколы вскрытия описаны для Drosophila melanogaster. Для всех других видов изменение протокола старения на основе вегетационных развития время точек будет необходимо, как описано выше.

  1. Для вскрытия куколки усиков диск собирать 50-100 0 - 2 h или 6-8 ч старый куколок, с помощью шпателя и разместить их на площадку рассечение.
  2. Пипетка 150 мкл раствора изоляции РНК в РНКазы бесплатно отцентрифугировать 1,5 мл трубки с помощью пипетки 200 мкл и поместить трубку на льду.
  3. Вскрыть куколки в 150-200 мкл ПБС (фосфатный буфер, нуклеиназы бесплатно). Место несколько капель PBS (150-200 мкл на капельки) на клавиатуре рассечение.
  4. На площадку рассечение место 0 - 2 h или куколки в возрасте 6-8 ч (одна куколка на каплю) расчлененный в одном из 1 x PBS капельки. Используйте щипцы в одной руке для стабилизации тела.
  5. Для 0 - 2 h возрасте куколок, используя пинцет с другой стороны, провести на наиболее передней части (рот крючки) prepupa и вытащите его подвергать мозги и имагинальных дисков, прилагается к делу передней куколки.
  6. Для 8 h НФА куколок сначала осторожно слезает куколки случай от наиболее передней четверти куколки, обнажая головку в мешок мембраны, которая окружает тело.
    Примечание: Тело, на данном этапе, выглядит как вырождающихся личинки.
  7. Удалите головы на шее сустав.
    Примечание: Это гарантирует, что усиков диски не будут потеряны, которые на данном этапе связаны главным образом с оптической долей головного мозга.
  8. Ткани с мозги и имагинальных дисков передать еще 1 x капелька PBS с помощью щипцов или 20 мкл пипетки.
  9. Идентифицировать глаз усиков диск подключен к мозга на оптические лопастями. С помощью щипцов, отключите глаз усиков диск от мозга и куколки дела. Передача его в новый 1 x капелька PBS с помощью щипцов или 20 мкл пипетки.
    Примечание: Prepupal глаз усиков диск является плоской ткани. Однако по 8 h куколок, глаз диски вращаются купирования усиков диски, который сидит впереди центральной мозга.
  10. С помощью щипцов, сократить ткани в месте соединения между глаз и усиков диск. Использование пипетки 20 мкл мягко переводить Иссеченную ткань на РНК изоляции раствора реагента. Минимизируйте количество жидкости, переданные закупорить сумму как можно меньше.
  11. Повторяйте, пока все куколки были расчленены.

4. рассечение D. melanogaster середине куколки и взрослых антенн

Примечание: По 40 h НФА, большинство метаморфоза является полным, и взрослый структуры становятся очевидными, но по-прежнему белый и невзрачный. В этот момент времени развития взрослых антенна приняло свою окончательную форму, но по-прежнему является прозрачным и большинство обонятельные рецепторы, за исключением нескольких, не начали выражение.

  1. Для куколки усиков Анатомирование собирать 50-100 prepupae, как описано в шаге 1 и их возраст за 40 ч при 25 ° C.
  2. Накапайте 150 мкл раствора изоляции РНК в РНКазы бесплатно microcentrifuge 1,5 мл трубки с помощью пипетки 200 мкл и поместить трубку на льду.
  3. На площадку рассечение место куколки расчлененный в одну из 1 x PBS капельки. Используйте щипцы в одной руке для стабилизации тела. С помощью щипцов с другой стороны, осторожно слезает куколки случай от наиболее передней четверти куколки, обнажая головку в мешок мембраны, которая окружает тело.
  4. С помощью щипцов, тщательно Отрежьте голову от остальной части тела куколки, удерживая тела с одним набором щипцами и сорвал голову на шею совместно с другой набор щипцов. Аккуратно перенесите голову в другой 1 x капелька PBS с помощью щипцов. Пипетка вверх и вниз, чтобы очистить содержимое головы (мозга и т.д.) чтобы получить четкие мембраны, которая используется для окружают развивающихся дрозофилы головы.
    Примечание: В 40-50 h НФА, усики соединены в секцию передней большинстве мембраны. Они станут очевидными для вскрытия, когда содержимое головы очищается с закупорить.
  5. С помощью щипцов, отключите куколки антенн от мембраны. Отключить сегмента 2nd антенны от 3rd с помощью щипцов кусочек на сегментные сустава, как только 3rd сегмент будет дом обонятельных рецепторов нейронов.
  6. Использование пипетки 20 мкл мягко переводить Иссеченную ткань на РНК изоляции раствора реагента. Минимизируйте количество жидкости, переданные закупорить сумму как можно меньше. Повторяйте, пока все куколки были расчленены.
  7. Для взрослых усиков Анатомирование собирают около 50 взрослых и возраст их за неделю после eclosion.
    Примечание: Экспрессии генов, обонятельных рецепторов и других генов пик через неделю после eclosion. Взрослые выдерживаются в неделю, чтобы обеспечить биологически соответствующих генов с низкой изобилие стенограммы подняться выше порога обнаружения.
  8. Для извлечения РНК вскрыть мух, пока они еще живы на площадку CO2 . Лечить CO2 pad с битор РНКазы. Для конфокальная томография, вскрыть мух на площадку рассечение в 1 x PBS или PBS + 0,2% Тритон.
  9. Во-первых поставьте взрослых спать на CO2 станции площадку под область рассечение. На площадку CO2 станции, используя пинцет в одной руке для стабилизации тела Используйте щипцы в другой аккуратно вытащить/щепотку третьего усиков сегмент от второго.
  10. Передача антенн в РНК изоляции решение, используя пинцет для размещения антенн непосредственно в жидкости. Повторяйте, пока все взрослые были расчленены.
    Примечание: Убедитесь, что антенн погружен в раствор РНК изоляции. Антенны могут стать застрял на стороне трубки. Это приведет к увеличению деградации мРНК, снижение количества и качества РНК.
  11. Непосредственно перейти к извлечение RNA или поместить трубку на-80 ° C для длительного хранения.

5. РНК изоляции от расчлененных тканей

  1. Удалите все образцы от-80 ° C хранения и размораживать их на льду.
  2. Кратко спина (5-6 s, ~ 6000 x g) каждый образец для сбора материала в нижней части трубки.
  3. Шлифуют каждый образец, используя газобетона пластиковые пестик и электромотором для 10 s на льду.
  4. Повторите шаги 5.2 и 5.3 4.
  5. Выполните извлечение RNA, используя имеющиеся наборы и следующие протоколы производителя для оптимальной урожайности.
  6. Выполните qRT ПЦР использование коммерчески доступных реагентов и конкретных грунтовки против гены интереса и после производителя протоколы.
    1. Выполнять все ПЦР-реакции, с помощью следующих условий: денатурации 95 ° C за 10 мин, после чего 40 циклов 95 ° c 15 s, 55 ° C за 30 s и 60 ° C за 30 s.
      Примечание: Грунтовка пар для DIP и dpr генов, перечислены в таблице 1, и грунты для обонятельных рецепторов генов, перечислены в CE сказал et al. 8.

6. Фиксация куколки усиков дисков и антенн для иммуногистохимии

Примечание: Исправьте тканей в пакетах из 10-20 лиц, чтобы убедиться, что ткани фиксируются на такое же количество времени. Свести к минимуму количество времени пребывания образцы в PBT (PBS с моющим средством) до их передачи на фиксатор, чтобы максимизировать целостности тканей.

  1. Собирать расчлененных усиков дисков или куколки антенн в 200 мкл ПЦР-пробирки, содержащие 200 мкл 0,2% PBT на льду для поддержания целостности тканей и чтобы избежать образца от прилипания к стене 200 мкл ПЦР трубы которая приведет к неполной фиксации.
    Примечание: Куколки антенн и усиков дисков может быть трудно понять, как они довольно полупрозрачные. Рекомендуется использовать рассечение область для всех стиральных шаги для предотвращения потери ткани. Кроме того 96-луночных Terasaki пластины могут быть используется для фиксации и окраски лучше отслеживать ткани.
  2. Исправить расчлененных усиков диска и усиков образцы из куколки в приблизительно 200 мкл 4% PFA (параформальдегида) за 30 мин при комнатной температуре. Для этого и последующих шагов, держите трубы с образцами на nutator правильно смешивать образцов в растворе. Прогресс к шагу 6.7.
  3. Для взрослых антенны, вскрыть всю голову сначала и исправить ее в приблизительно 200 мкл 4% PFA (параформальдегида) за 1 ч при комнатной температуре.
  4. Вымойте 3 x с 200 мкл 0,2% PBT за 10 мин. Держите образцы на nutator во время инкубации.
  5. Вернуться к Микроскоп диссекции для тонкой рассечение второго сегмента усиков от фиксированной головки. С помощью щипцов для стабилизации головы, аккуратно вытащить/щепотку третьего усиков сегмент от второго.
  6. Перевести расчлененных третьего усиков сегментов в приблизительно 200 мкл 4% PFA (параформальдегида) и исправить их на 30 минут при комнатной температуре.
  7. Вымойте 3 x с 200 мкл 0,2% PBT за 10 мин. Держите образцы на nutator во время инкубации.
  8. Хранить образцы на 4 ° C, или продолжить непосредственно с вся гора иммуногистохимия.
    Примечание: Эффективность пятнать может измениться при использовании антител. Этот метод должен быть подходящим для менее обильные белка теги или слабее антител. Однако время от времени, может потребоваться оптимизация протокола (личность или количество фиксатором или время фиксации).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Иссеченную ткань развивающимися обонятельную может использоваться для извлечения РНК, следуют RT-PCR для оценки экспрессии генов или могут быть приняты через иммуногистохимия протоколы для определения его выражения и субклеточном локализация генов интерес. В этом раз...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Этот протокол является полезным ресурсом для лабораторий, заинтересованных в поиске генетические и транскрипционный анализ программ, действующих в развивающихся дрозофилы обонятельных ткани, а также сравнительный анализ этих программ через дрозофилы видов. Это особенно по...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Это исследование было поддержано грант от национального научного фонда для Pelin C. Volkan (DEB-1457690).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
10X Phosphate-buffered SalineGibco70011-044Dilute to 1X in RNase free water
CO2 tankAir GasCD R200
Two sharp forceps (Dumont #55)Fine Science Tools11255-20
TrizolInvitrogen15596-026RNA isolation solutions
Dissecting Microscope
Small bucket with ice
P20 and P200 micropipettes and tips
1.7 mL Microfuge tubesPurchase nuclease free for best results
0.2 mL PCR tubes
Paraformaldehyde powderPolysciences380
10% Triton X-100TeknovaT1105Dilute to 0.2% v/v in 1X PBS
2" petri dishes
55mm filter paperWhatman1001-055Wet with water and place in a petri dish to keep pupae moist
25 C incubator
deionized H2OPurchase nuclease free or treat with DEPC
Sylgard 184 Silicone Elastomer KitDow Corningto be used for making dissection pads from Terizaki plate covers.
MicroWell Mini Trays with lidsNunc438733Lids can be used to make silicone dissection pads
Rabbit anti-GFP antibodyMBL international corporPM005primary antibody
Mouse anti RAT CD2AbD seroTecMCA154RHDLprimary antibody
ADL195 (anti lamin, mouse)Dev studies hydoma banADL195-sprimary antibody
Alexa Fluor® 488 goat anti-rabbit IgG (H+L)invitrogenA11008Secondary antibody
Cy3 Goat Anti-Mouse IgGJackson ImmunoResearch115-166-003Secondary antibody
Triton X-100, Protein Grade Detergent, 10% Solution, Sterile-FilteredCALBIOCHEM648463detergent
Lab RotatorThermo scientificRotator
Nuclease Free WaterGrowcells.comNUPW-0125Water
Light-Duty Tissue WipersVWR82003-822For cleaning dissection supplies
Superscript IIinvitrogen18064014Reverse Transcriptase 
QIAshredder (50)RNA extractionQIAGEN79654
Oligo(dT)12-18 PrimerRTlife technologies18418012
RNeasy MinElute Cleanup Kit (50)RNA extractionQIAGEN74204
FASTSTART UNIV SG MASTER (5 ML)(500 RXN)qPCRRoche04913850001
FASTSTART ESSENTIAL GREEN DNA MASTER qPCRRoche06402712001
LIGHTCYCLER 480 - MULTIWELL PLATE 96qPCRRoche04729692001
NEBNext High-Fidelity 2X PCR Master MixqPCRNEBM0541S

Ссылки

  1. Barish, S., Volkan, P. C. Mechanisms of olfactory receptor neuron specification in Drosophila. Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 4 (6), 609-621 (2015).
  2. Pan, J. W., Volkan, P. C. Mechanisms of development and evolution of the insect olfactory system. Cell and Developmental Biology. 2, 130(2013).
  3. Ramdya, P., Benton, R. Evolving olfactory systems on the fly. Trends in Genetics. 26 (7), 307-316 (2010).
  4. Bellen, H. J., Tong, C., Tsuda, H. 100 years of Drosophila research and its impact on vertebrate neuroscience: a history lesson for the future. Nature Reviews Neuroscience. 11 (7), 514-522 (2010).
  5. Knecht, Z. A., et al. Distinct combinations of variant ionotropic glutamate receptors mediate thermosensation and hygrosensation in Drosophila. eLife. 5, 44-60 (2016).
  6. Enjin, A., et al. Humidity sensing in Drosophila. Current Biology. 26 (10), 1352-1358 (2016).
  7. Li, Q., Barish, S., Okuwa, S., Volkan, P. C. Examination of endogenous rotund expression and function in developing Drosophila. olfactory system using CRISPR-Cas9-mediated protein tagging. G3: Genes|Genomes|Genetics. 5 (12), 2809-2816 (2015).
  8. Hueston, C. E., et al. Chromatin modulatory proteins and olfactory receptor signaling in the refinement and maintenance of fruitless expression in olfactory receptor neurons. PLoS Biology. 14 (4), 1002443(2016).
  9. Li, Q., et al. Combinatorial rules of precursor specification underlying olfactory neuron diversity. Current Biology. 23 (24), 2481-2490 (2013).
  10. Li, Q., et al. A functionally conserved gene regulatory network module governing olfactory neuron diversity. PLoS Genetics. 12 (1), 1005780(2016).
  11. Pan, J. W., et al. Patterns of transcriptional parallelism and variation in the developing olfactory system of Drosophila species. Scientific Reports. 7 (1), 8804(2017).
  12. Pan, J. W., et al. Comparative analysis of behavioral and transcriptional variation underlying CO2 sensory neuron function and development in Drosophila. Fly. 11 (4), 239-252 (2017).
  13. Stern, D. L., et al. Genetic and transgenic reagents for Drosophila simulans, D. mauritiana, D. yakuba, D. santomea, and D. virilis. G3: Genes|Genomes|Genetics. 7 (4), 1339-1347 (2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

136

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены