JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мы описываем подходы для манипулирования генов в системе Эволюционная модель Астианакт гракл. Описываются три различных методов: Tol2-опосредованной трансгенез, целенаправленные манипуляции генома используя ТРИФОСФАТЫ/Cas9 и сногсшибательно выражения с использованием морфолиновая. Эти инструменты должны облегчить прямое расследование генов, лежащие в основе различия между формами поверхности и пещера жилище.

Аннотация

Пещерных животных обеспечивают убедительные системы для изучения эволюции механизмов и генетических основ лежащих в основе изменений в многочисленных сложных черты, включая глаз дегенерации, альбинизм, потеря сна, hyperphagia и сенсорной обработки. Виды cavefish от всего мира отображения конвергентной эволюции морфологических и поведенческих признаков из-за общих экологических проблем между различными пещерных систем. Были изучены различные пещеры видов в лабораторных условиях. Мексиканский tetra, гракл Астианакт, с нормальным зрением и слепых форм, предоставила уникальные идеи в молекулярных и биологических процессов, лежащих в основе эволюции сложных черты и хорошо готовы как формирующейся модели системы. В то время как в A. гракл был выявлен кандидат генов, регулирующих эволюцию различных биологических процессов, возможность проверки роли для отдельных генов был ограниченным. Приложение трансгенез и Джин редактирования технология имеет потенциал для преодоления этого значительные препятствия и изучить механизмы, лежащие в основе эволюции сложных черты. Здесь мы описываем различные методологии для манипулирования экспрессии генов в A. гракл. Подходы включают использование морфолиновая, Tol2 трансгенез, и Джин редактирования системы, часто используемые в данио рерио и другие рыбы модели, чтобы манипулировать функции гена в A. гракл. Эти протоколы включают подробные описания процедур приурочен разведения, коллекции оплодотворенные яйца, инъекции и отбора генетически модифицированных животных. Для исследования генетических и нейронных механизмов, лежащих в основе эволюции различных признаков в A. граклпозволит эти методологические подходы.

Введение

С тех пор Происхождение видовДарвина1ученые получили глубокое понимание как черты эволюционно формируются в ответ на определенные природоохранные и экологические давление, благодаря пещера организмов2. Мексиканский tetra, A. гракл, состоит из глазами предков «поверхности» популяций, которые населяют рек Мексики и Южной Техас и по крайней мере 29 географически изолированные популяции производных пещера морф, населяющих Abra Сьерра-дель- и другие районы северо-восточной Мексике3. Было выявлено несколько черт, связанных пещера в A. гракл, включая потребление кислорода изменены, депигментация, потерю глаза и изменили кормления и нагула поведение4,5,6, 7,8,9. A. гракл представляет мощную модель для изучения механизмов конвергентной эволюции благодаря четко определенной эволюционной истории, подробная характеристика состояния окружающей среды и присутствие независимо эволюционировали пещера населением в10,11. Многие из пещеры производные признаки, которые присутствуют в cavefish, включая потерю глаз, потеря сна, увеличилось, питание, потеря школьного обучения, снижение агрессии и уменьшить стресс ответы, развивались несколько раз через независимого происхождения, зачастую с использованием различные генетические пути между пещеры8,12,13,14,15. Это повторяется, эволюция является мощным аспектом A. гракл системы и может обеспечить проницательность в более общий вопрос о как генетических систем может возмущенных для создания аналогичных фенотипов.

В то время как в многих видов рыб (в том числе A. гракл) был ограниченным применения генетических технологий механистический расследования функции гена, последние достижения в zebrafish обеспечивают основу для разработки генетических технологий в рыбе 16,17,18,19,20. Многочисленные инструменты широко используются в zebrafish манипулировать экспрессии генов, и осуществление этих процедур давно были стандартизированы. К примеру инъекции oligos Морфолино (MOs) на стадии одноклеточных выборочно блокирует РНК и предотвращает перевод для краткое временного окна во время разработки21,22. Кроме того, ген редактирования подходы, такие, как кластерный регулярно interspaced короткие палиндром повторяется (ТРИФОСФАТЫ) / ТРИФОСФАТЫ, связанные белком 9 (Cas9) и транскрипции активатор как эффекторных нуклеиназы (TALEN), позволяют для генерации определенных исключений или, в некоторых случаях, вставки через рекомбинации в геномах19,,2023,24. Трансгенез используется для манипулирования стабильной ген выражение или функцию определенным образом тип ячейки. Система Tol2 эффективно используется для создания трансгенных животных, coinjecting Транспозаза мРНК с Tol2 плазмида ДНК, содержащие трансген25,26. Система Tol2 использует Tol2 Транспозаза оризии для создания стабильной микрофлорой вставки трансгенных construct17. Создание Tol2 мутация включает в себя coinjecting плазмиды, содержащий трансген, обрамленная Tol2 интеграции сайтов и мРНК Tol2 Транспозаза17. Эта система используется для создания массива трансгенных линий в данио рерио и его использование недавно расширена еще формирующейся модели систем, включая цихлид, Пецилиевые рыбы, колюшка и, более недавно, мексиканской cavefish27, 28,29,30.

В то время как cavefish это увлекательный биологическая система для разъяснения механизмов черта эволюции, его потенциал как Эволюционная модель не были использованы полностью. Это частично объясняется невозможностью манипулировать генетических и сотовой функция непосредственно31. Кандидат генов, регулирование сложных черты были определены с использованием количественных признаков локусов (QTL) исследования, но проверка этих генов кандидат был трудным32,33,34. Недавно переходных нокдаун, используя морфолиновая, Джин, редактирование с помощью систем ТРИФОСФАТЫ и TALEN и использование Tol2-опосредованной трансгенез были использованы для изучения генетической основы, лежащие в основе ряда признаков35,36,37 ,38. Осуществление и стандартизации этих методов позволит для манипуляции, которые допрашивают молекулярных и нейронных основы биологических черт, в том числе манипуляции функции гена, маркировки определенных клеточных популяций, и выражение функциональных репортеров. Успешное осуществление этих генетических инструменты для манипулирования генов или сотовой функция была продемонстрирована в формирующейся модели систем, в то время как в A. граклпо-прежнему отсутствуют подробные протоколы.

A. гракл обеспечивают критический взгляд в механизмы эволюции в ответ на меняющиеся условия и возможность для определения новых генов, регулирующих различные черты. Ряд факторов предполагают, что A. гракл является чрезвычайно шансов справиться с возникающими модель для применения установленных геномной инструментов, имеющихся в настоящее время в установленные генетические моделей, включая возможность легко поддерживать рыбы в лабораториях, большой размер выводка, прозрачности, последовательности генома и определенных поведенческих анализов39. Здесь мы описываем методологии для использования морфолиновая, трансгенез и Джин редактирования в поверхность и пещера популяциях A. гракл. Более широкое применение этих инструментов в A. гракл позволит механистический расследование молекулярных процессов, лежащих в основе эволюции развития, физиологические и поведенческие различия между cavefish и поверхности рыбы.

протокол

1. Морфолино oligo дизайн

Примечание: Последовательности для A. гракл доступны через Национальный центр биотехнологической информации (NCBI) ген и SRA NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov), а также из Ensembl генома браузер (https://www.ensembl.org). При проектировании Морфолино для использования в обеих формах поверхности - и местонахождения троглофильных, важно определить любые генетические различия между морф на данном этапе, так как цели для морфолиновая можно избежать этих генетических регионов. Все полиморфные вариацию Морфолино целевого сайта может привести к неэффективной привязки. Дизайн похож на другие системы рыбы, например данио рерио и ранее было показано, чтобы эффективно работать в A. гракл21,36,40.

  1. Дизайн блокирования перевода морфолиновая
    Примечание: Блокирование перевода морфолиновая блокировать перевод путем привязки к эндогенной стартовый сайт и препятствуют трансляционная техника от привязки последовательность мРНК через их пространственной препятствие.
    1. Идентифицировать кодирвоания целевого гена, начиная с начала сайт ATG.
    2. Запишите первые 25 пар оснований последовательности целевых объектов путем копирования и вставки последовательность в текстовый редактор или лаборатории ноутбука.
    3. С помощью онлайн программного обеспечения (например, http://reverse-complement.com) или ручной перевод, генерировать обратный дополнение последовательности целевого объекта. Сохраните полученный обратный дополнением в текстовом редакторе или лаборатории ноутбука.
    4. Заказывайте Морфолино с последовательностью обратный дополнение от компании, которая создает Морфолино олигонуклеотидов. Смотрите Таблицу материалы для компаний.
  2. Дизайн сплайс преграждать морфолиновая
    Примечание: Блокирование Splice морфолиновая блокировать сплайсинга и, таким образом, предотвратить формирования зрелой молекулы мРНК. Это обеспечивает альтернативный метод для нокдаун, когда начала сайты не являются четко определенными, или более оптимальный подход желано проверки нокдаун через полимеразной цепной реакции (ПЦР). Это преимущество сплайс преграждать морфолиновая (над ГПТ преграждать MOs) это что экзона исключение или включение Интрон можно легко оценить с обратной транскриптазы (RT)-PCR и размер различия, визуализируется на геле. RT-PCR и гель электрофореза для определения эффективности Морфолино должно быть сделано с помощью стандартных лабораторных процедур.
    1. Определите последовательность пре мРНК гена целевого объекта. Используйте имеющуюся информацию из генома A. гракл через NCBI или Ensembl для определения границ Интрон экзона33.
    2. Целевые Экзон Интрон (соединитель доноров) или Интрон экзона границы (соединитель акцептор) сайты для Интрон включение или экзона исключения.
      Примечание: Сплайсосома обычно цели последовательности «ГУ» (U1 цель) в Интрон на месте сращивания 5' и последовательности AG» »на сайте intronic соединитель (U2 целевой) 3'. При нормальных условиях Сплайсосома U1 и U2 субблоков привязать эти целевые сайты на пре мРНК последовательности для надлежащего сплайсинга происходят. Однако если любой из этих последовательностей целевой блокируется Морфолино, Сплайсосома будет двигаться следующий доступный узел в области U1 и U2, вызывая Интрон исключение или экзона в последовательность мРНК. Это будет включать планирование/оптимизации, в зависимости от целевого гена21. Как правило блокирование внутренний сайт U1 перенаправляет соединитель следующий доступный узел U1, вызывая экзона эксцизии. Кроме того блокировка перекрестка первой или последней сращивания вызывает включение Интрон потому что нет никакой другой сайт, чтобы перенаправить соединитель для. Используйте программное обеспечение последовательности для прогнозирования эффекта различных исключений против включений. Прогнозы можно указать потенциальных frameshifts или преждевременной остановки кодонов, указав более эффективной целевой сайт для срыва мРНК.
    3. После определения целевого сайта, записи его последовательности в текстовый редактор или лаборатории книги. Убедитесь, что целевой сайт 25 пар оснований (ВР) длиной.
    4. С помощью онлайн программного обеспечения (например, http://reverse-complement.com) или ручной перевод, генерировать обратный дополнение последовательности целевого объекта. Запись последовательности в текстовый редактор или лаборатории книги.
    5. Заказывайте Морфолино с последовательностью обратный дополнение от компании, которая создает Морфолино олигонуклеотидов. Смотрите Таблицу материалы для образца компаний.

2. морфолиновая для инъекций

Примечание: Несколько концентрации или томов MO инъекции нужно будет выполняться для установления оптимальной концентрации для вставки. Типичный инъекции количества являются 400 – 800 pg MO. Эффект Морфолино нокдаун может сохраняться до 6 дней postinjection.

  1. Получение акций Морфолино. Складе Морфолино прибывает лиофилизированные. Гидрат с стерильных H2O до использования в нужной концентрации запасов (например, 4 мм). Хранить при-20 °C до использования.

3. ТРИФОСФАТЫ gRNA дизайн, в vitro транскрипция и подготовка

  1. ТРИФОСФАТЫ gRNA дизайн
    Примечание: оформления созданные с использованием ранее опубликованных исследований Varshney et al.40 и41Wierson и др.
    1. С помощью браузера генома, определите кодирвоания гена интереса. С использованием геномной последовательности, определить последовательности целевых объектов в пределах экзона gRNA путем поиска для 20 bp нуклеотидов целевой последовательности, начиная с GG и Пэм последовательность (НЭС). Регионе гена после того, как будут направлены на запуск (ГПТ).
      Примечание: Если в желаемого экзона гена, один или оба из G'не удалось найти целевой последовательности с GG в конце 5' s можно заменить для первой и второй нуклеотидов в 5' конце последовательности. Однако два G's должны быть включены в oligo, поскольку они необходимы для транскрипции T7.
    2. Дизайн и заказать ген специфического олигонуклеотида (oligo A: 5'-TAATACGACTCACTATAGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3'). Добавьте ген специфического 20 bp gRNA последовательности целевых объектов (жирным шрифтом) без PAM последовательности между T7 промоутер последовательности (красный) и дублирования последовательность, используемая для отжига для второй олигонуклеотида (синий). Отжиг и усилить (см. шаг 3.2.1) этот oligo A и второй oligo (oligo B: 5'-GATCCGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTT AACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC-3') для создания gRNA шаблон, используемый для транскрипции.
      Примечание: Oligo B является одинаковым для каждой реакции и нужно только заказать 1 x.
  2. подготовка gRNA и транскрипции
    1. Отжиг и усилить oligos. Включить следующие Праймеры для того чтобы усилить gRNA для того чтобы увеличить урожайность: 5'-TAATACGACTCACTATA-3' (T7 грунт) и 5'-GATCCGCACCGACTCGGTG-3' (3' gRNA грунтовка). Выполните с помощью Thermococcus kodakaraensis (код) полимеразы PCR.
      Примечание: Для обоих грунтовки в oligo A и oligo Б, 10 циклов рекомендуется для хорошего урожая. Подробный протокол можно найти в Wierson et al.41.
    2. Транскрибируйте gRNA использование коммерчески доступных в vitro транскрипция наборы (см. Таблицу материалы). Это делается путем изменения производителя'протокол s Опубликовано Klaassen et al.42.
    3. Осадок, вымыть и Ресуспензируйте gRNA, как описано в Klaassen et al.42.
      Примечание: GRNA должен быть высокомобильна в РНКазы свободной воды для предотвращения деградации.
    4. Запись концентрация gRNA, который может быть определен с помощью спектрофотометра. Оценить качество РНК, запустив 2 мкл на геле агарозы. Аликвота РНК избежать замораживания/оттаивания и хранить его на-80 °C до непосредственно перед инъекции.
  3. Cas9 подготовка и транскрипции
    1. Cas9 мРНК могут быть транскрибированы использование коммерчески доступных в vitro транскрипция наборы (см. Таблицу материалы) как описано ранее43. Используйте версию nls-Cas9-nls43.
    2. Регистрировать концентрацию gRNA и оценить его качества, запустив 2 мкл на геле агарозы. Аликвота РНК во избежание разложения, который возникает через несколько циклов замораживания оттаивания и хранить аликвоты-80 °C.

4. Подготовка Tol2 конструкций, Tol2 Транспозаза и трансгенез

  1. Подготовка Tol2 трансген конструкции для инъекций.
    Примечание: Мы успешно использовали публикации доступны данио рерио и оризии конструкций в A. гракл. Эти конструкции являются полностью функциональными в A. гракл, вероятно из-за высокого уровня последовательности гомологии (обратитесь к AddGene репозиторий и данио рерио информационной сети [ZFIN] базы данных для имеющихся конструкций). Данио рерио промоутер фрагменты выразили трансгенов в ожидаемых тканях при использовании в A. гракл.
    1. Приобрести Tol2 конструкции или генерировать плазмида с ткани конкретной промоутера, желаемого трансген и Tol2 оружия (см. Кван et al.44). По получении последовательность конструкции для проверки плазмиды.
    2. Выполнить midiprep для конструкции в зависимости от производителя's руководящие принципы. Элюировать окончательный плазмида в свободный РНКазы H2O, определить концентрацию с спектрофотометр, ослабить концентрацию до 100–300 нг / Л,μи Алиготе и магазин конструкции при-20 °C.
  2. Дайджест Tol2 Транспозаза плазмиды и синтез мРНК.
    1. Получите копию плазмида Транспозаза Tol2 (ПК zT2TP) как шаблон для генерации мРНК Tol245.
    2. Согласно данным производителя'Midiprep ПК zT2TP построить s руководящие принципы. Элюировать в низкий объем РНКазы свободной воды или буфера (~ 50 мкл). Хранить аликвоты при-20 °C.
    3. Дайджест Tol2 плазмиду с помощью энзима ограничения.
      1. Выполните дайджест ограничение на 10 мкг круговой ПК zT2TP плазмиду с помощью таблицы 1.
      2. Разделение реакции в 2–50 мкл реакции и инкубировать и реакции на ночь в 37 °C в тепловая велосипедист.
      3. На следующий день инактивирует фермент путем нагревать его к 65 °C в течение 20 мин.
      4. Очищайте линеаризованного плазмида сразу же после дайджест, используя коммерчески доступные наборы очищения ПЦР (см. Таблицу материалы) с требованиями производителей' . Элюировать плазмида в 15 мкл РНКазы свободный H2O и определить концентрацию продукта с помощью спектрофотометра.
      5. Запуск 1 мкл переваривается плазмиды и 1 мкл режиссерский плазмида на 1,5% агарозном гель для подтверждения линеаризованного плазмиды.
    4. Выполните в vitro транскрипция Tol2 мРНК.
      1. Используйте как шаблон для транскрипции 1 мкг линеаризованного ПК zT2TP плазмиды. Следуйте производитель's руководящие принципы в vitro транскрипция (см. Таблицу материалы), как описано в таблице 2.
      2. Инкубируйте при 37 °C в тепловой циклователь на производителя's руководящих принципов.
      3. 1 мкл DNase, инкубации при 37 °C в тепловой циклователь на производителя's руководящие принципы.
      4. Выполняйте Лития хлорид осадков в транскрипции Кит протокол. Ресуспензируйте Пелле РНК в ~ 20–30 мкл РНКазы свободный H2O.
      5. Определение концентрации продукта, используя спектрофотометр и записывать качество РНК.
      6. Разбавить продукт–300 нг/мкл и Алиготе ~ 100 в 5 образцов 10 мкл–, чтобы избежать повторного замораживания оттаивания. Храните их в-80 °C до использования.
        Примечание: Это можно проверить 1–2 мкл очищенный Tol2 мРНК для мазка и полосами с электрофорезом геля.

5. микроинъекций

  1. Подготовка общих инструментов для инъекций
    Примечание: Процедуры, описанные в этом разделе были описаны подробно Kowalko et al.46, и здесь представлен обзор с незначительными изменениями.
    1. Сгенерировать инъекции пластины, поливая теплой 3% агарозы, растворенных в воде системы рыбы в 100 мл Петри. Осторожно поместите яйцо инъекции плесень в свеже налил агарозы для скважин на икру. Место на стороне плесень в агар под углом 45° и, затем, медленно опустите его в агарозном; медленно снижение плесень под углом избегает воздуха, получить в ловушке под плесень. Осторожно удалите плесень, после затвердевшим агарозы. Пластины могут быть сохранены, герметичный, 4 °C на срок до 1 недели.
    2. Вытащить из боросиликатного стекла капилляров для инъекций в электрод/иглы съемник согласно данным производителя'иглы s руководящих принципов. Этот протокол будет варьироваться в пипетку съемник; Однако образец потянув иглу программы можно найти в таблице 3.
      Примечание: Оптимизация игла имеет важное значение для инъекции, как иглы, которые слишком долго будет согнуть, а не чисто проникают яйцо.
    3. Сделайте большой диаметр стеклянной пипетки для передачи яйцо, разбив стандартные стеклянные пипетки, так что открытие является достаточно большой для яиц. С помощью горелки Бунзена, польский сломанной конца стекла, подвергая конце сломанной пипетки пламени до тех пор, пока оно не станет гладким.
  2. Установки размножения
    Примечание: Существует множество различных протоколов, используемых для разведения A. гракл. Подробный протокол Borowsky39см. Запустите программу установки разводить 1 неделю до инъекции.
    1. На 1 день место два-три женщины мужчины и три-четыре в одном 10 галлон танк, на уровне 24 ± 1 °C.
    2. В дни 1–7, увеличьте, питание ~ 3 раза в день. Убедитесь, что диета включает в себя живую пищу, такие как черный червей и артемии.
    3. На 6 день добавьте один резервуар подогреватель, равным 27 °C. Lab танк температура может варьироваться; Таким образом это будет увеличение 2–нормальный танк температура 3 °C относительно.
    4. Вечером 7, день, который вечером (zeitgeber [ZT] 9–11) инъекций ночью, тщательно очистите танки с губкой, смоченной водой и удалить любой избыток пищи или мусора, с помощью чистой тонкой сеткой или сифон.
    5. В ночь на 7 день начало проверку поверхности икры на ZT15 и продолжайте проверять каждые 15–30 мин до ZT18. Для cavefish начать проверку для яиц в ZT17 и продолжайте проверять каждые 15–30 мин до ZT20.
      Примечание: Время основаны на 14:10 h свет: темные цикла с использованием zeitgeber время. Разведение раз являются оценочными и отдельных лабораториях необходимо определить точное время. Важно, чтобы собирать яйца, вскоре после того, как они выпустили/оплодотворенной чтобы привнести их в стадии одноклеточных.
  3. Сбор яиц стадии одноклеточных
    1. Ночью, в котором ожидается разведения, изучите танки каждые 15–монитор для яиц в нижней части бака и 30 мин. Яйца появляются полупрозрачные, измерения около 1 мм в диаметре.
    2. Использование чистой тонкой сетки рыбу собирать яйца и передавать их в кастрюлю с водой системы свежей рыбы. Изучите яйца под микроскопом, чтобы подтвердить, что яйца находятся в стадии одной ячейки.
    3. С помощью пипетки стеклянные, передачи одноклеточных яйца для инъекций пластины. Пипетки стеклянные необходимы на данном этапе, как яйца будут придерживаться пластика.
    4. С помощью пипетки, тщательно выпуск яйца в скважины агарозы инъекции пластины из раздела 5.1. Заполните строки подогретую (при комнатной температуре) инъекций пластины с максимальное количество яиц (30–40 в строке и до пяти строк). Полные строки помогают держать яйца от перемещения во время инъекции. Храните яйца гидратированных на пластину инъекции с небольшим количеством воды системы рыбы до выполнения инъекции.
  4. Пико инъекции установки и руководящие принципы оптимизации общего инъекций
    1. Засыпки инъекционным иглам, используя либо гель загрузки дозаторов советы, которые вписываются внутрь капиллярной или с помощью стандартных микропипеткой советы и добавить 2–4 мкл болюс в конце. После того, как заполнены иглы, используйте щипцы обрезать излишки длиной от инъекционной иглы.
    2. Выполните с помощью иглы, смонтированные в микроманипулятор, подключенных к microinjector пиколитр микроинъекций.
    3. Установить время инъекций 0,03 s и давления из на ~0.0 psi. Давление впрыска будет изменяться соответственно с незначительными различиями между иглами, так оптимизировать для достижения ~1.0 nL введения болюса.
      Примечание: Давление впрыска часто находится в диапазоне от ~ 10–30 psi.
    4. Стандартизировать болюсного введения путем впрыскивать в минеральное масло и измерения болюс размер микрометром слайд для достижения 1 ~–1.5 объем впрыска nL. Отрегулируйте давление впрыска (psi) для увеличения или уменьшения громкости болюса.
    5. Черпать воду от самой верхней части яйца с помощью лаборатории тканей.
      Примечание: Яйцо Хорион Астианакт немного сложнее для проникновения чем данио рерио яйца. Мы находим, что черпания воды из верхней части яйца помогает облегчить проникновение иглы в яйцо. Пластина оптимизации может позволить для ~ 200 яиц на одной пластине.
    6. Используйте микроманипулятор проникнуть каждое яйцо с иглой, и внедрить непосредственно в желтке. После того, как расположены в желтке, придать яйцо, нажав педаль вставки кнопка или инъекции.
      Примечание: Полное пластина может быть введен в течение ~ 15 мин. Стадии одноклеточных длится ~ 40 мин.
  5. Инъекции морфолиновая
    Примечание: Количество необходимых для сногсшибательно не вызывая токсичности Морфолино будет необходимо оптимизировать каждого гена целевого объекта; Однако концентрация 400 ПГ является хорошим местом для начала.
    1. Подготовьте Морфолино, так что 400 pg Морфолино будут вводиться на яйцо. Морфолино оттепели на льду. Инъекционного раствора состоит из Морфолино (на желаемой концентрации), RNase свободный H2O или Danieau's решение и фенола красного (10% от конечного объема). В качестве примера см. таблицу 4.
    2. Придать 1 nL за эмбриона.
  6. ТРИФОСФАТЫ инъекции
    1. Подготовьте РНК, так что 25 pg gRNA и 300 pg Cas9 мРНК всего будет выведена за эмбриона. Для образца ТРИФОСФАТЫ/Cas9 инъекции смеси см. таблицу 5.
    2. Придать 2 nL gRNA/Cas9 мРНК за эмбриона непосредственно в эмбрион.
  7. Инъекции Tol2 Транспозаза и Tol2-бокам плазмиду для трансгенез
    1. Размораживание Транспозаза мРНК и Tol2 плазмиды на льду. Комбайн Cas9 мРНК (на 25 нг/мкл), желаемый Tol2 конструкцию (25 нг /μЛ) и красный (≤10% от конечного объема) фенола в воде, RNase бесплатно. Для образца Tol2 трансгенез инъекции смеси см. таблицу 6.
    2. Держите инъекционного раствора и иглы на льду, чтобы избежать деградации мРНК. Залить на 1 nL в томе за эмбриона.

6. воспитание и скрининг вводят рыбы

  1. Вводят рыбы животноводства
    1. После того, как яйца вводят, немедленно перевести их в стеклянной чаши (10 x 5 см) заполнены с ~ 200 мл воды системы рыбы. Яйца легко промыть путем погружения плиты инъекций в чаш, наполненных рыбы воды и полоскать яйца с пипеткой.
    2. Место ~ 50–80 эмбрионы вводят в миску и сзади них 22–24 °C.
    3. Чистить чаши с рыбой вводят 2 раза в день для удаления мертвых зародышей и изменить ~ 20% воды на ежедневной основе.
    4. Дополнительные воспитания осуществляется в соответствии с ранее опубликованные протоколы39.
  2. Скрининг лиц, вводят Морфолино
    1. Визуализируйте животных под стереомикроскопом экран для фенотипов. Морфолиновая эффект может сохраняться до ~ 5 дней постинъекционные21.
    2. Мера поведенческих фенотипов на 4 дня postinjection.
  3. Скрининг для ТРИФОСФАТЫ indels
    1. Дизайн праймеров для того чтобы усилить дна genomic вокруг целевого сайта. Дизайн праймеров, таким образом, чтобы целевой продукт PCR приблизительно 100–125 bp.
      Примечание: например, для oca2 локус, регион вокруг gRNA целевой сайт был усиленный с помощью вперед грунтовка 5'-CTCCTCTGTCAGGCTGTGC-3' и обратный грунтовка 5'-GAAGGGGATGTTGTCTATGAGC-3' для ПЦР продукта длиной 105 bp.
    2. Жертву эмбрионов или плавник клип взрослых рыб согласно институциональных животных протокол.
    3. Собирать эмбрионов или расчлененных плавники в ПЦР-пробирки и извлечь ДНК и выполняют протоколы PCR ГКДЗ. пример для гена специфические праймеры можно найти в35мА и др.
    4. Чтобы оценить для мутагенеза, запуск 5 мкл ПЦР продукта на 3% агарозном геле на 70 V для 3 h. одичал тип (nonmutagenized) ДНК приведет к продукт PCR как собственный группа. Мутант ДНК приведет в замазанных текстов группы на геле.
    5. Чтобы определить последовательность мутантные аллели, TA клонировать продукт PCR, по словам производителя's инструкции, выбрать колоний и алкалический культур. Отправьте полученный ДНК для виртуализации.
    6. Устанавливать и поддерживать линии рыб, препровождающее мутантные аллели, крест взрослых рыб вводят одичал типа рыб, и экран 5–10 эмбрионов, чтобы определить, если любой из потомства нести Мутантный аллель гена, следующие шаги 6.3.1-6.3.6.
      Примечание: Различные F1 человек из же F0 основатель рыбы может нести различные мутации. Убедитесь, что получить мутации, предсказал производить аллелей, которые выходят за рамки виртуализируются мутантных линий.
    7. Идентификации рыб, перевозящих Мутантный аллель методом ПЦР, используя assay замазанных текстов группы (шаги 6.3.1-6.3.6) или путем разработки Аллел Специфически PCR праймеры, которые будут усиливать мутант и одичал тип полос (рис. 2 c).
    8. После создания линии рыб, homozygose мутантных аллелей для проверки рецессивных фенотипов.
  4. Скрининг для трансгенных позитивных людей
    Примечание: С помощью конструкций, содержащих флуоресцентные чайник рекомендуется упорядочить скрининга для трансгенных положительных людей. Однако, Стандартное PCR скрининг методы могут использоваться для экран для передачи.
    1. Визуализируйте флуоресцентные ткани специфических белков в F0 рыба postinjection 2 дня, в кратчайшие сроки с эпифлуоресцентного, пройдя через область.
      Примечание: Выражение в F0 личинки мозаики, и позитивные люди могут иметь широкий спектр выражение фенотипов.
    2. Сохранить позитивные лица как F0 основатель рыбы.
    3. Когда ф0достигают зрелости, backcross основателей рыбы nontransgenic лицам, производный от тот же запас населения/лаборатории. Экран F1 потомство, используя тот же протокол, как описано в пункте 6.2.
      Примечание: Выражение в личинок1 F единообразные и обеспечивает согласованность между F1 братьев и сестер.
    4. Поскольку интеграция Tol2-это не сайт опосредованной и интеграция могут варьироваться среди учредителей, выберите F1 братьев и сестер производный один основатель0 F и скрещиванию положительный выражая F1 братьев и сестер для создания2ф. Это потомство будет основой для стабильного линии.

Результаты

Несколько популяций местонахождения троглофильных A. гракл показывают сокращение сна и повышенная бодрствования/активность по отношению к их поверхности жилище сородичами14. Hypocretin/orexin (HCRT) является весьма сохранены нейропептида, который действует для увеличения бодр...

Обсуждение

Здесь мы предоставили методологию для манипулирования функции гена, используя морфолиновая, ТРИФОСФАТЫ/Cas9 гена редактирования и трансгенез методологии. Богатство генетических технологий и оптимизации этих систем в данио рерио, скорее всего, позволит для передачи этих средств в A. г?...

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Авторы благодарят Sunishka Тхакур за ее помощь в генотипирования и визуализации oca2 мутант рыб, изображенный на рисунке 2. Эта работа была поддержана Национальный фонд науки (NSF) награду 1656574 A.C.K., премии 1754321 NSF J.K. и A.C.K. и национальных институтов здравоохранения (НИЗ) премии R21NS105071 A.C.K. и E.R.D.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Fish breeding & egg supplies
Fine mesh fish netPenn PlaxBN4
Fish tank heaterAqueon100106108
Egg trapsCustom madeNADesign and create plastic grate to place at bottom of tank to protect eggs
Glass pipettesFisher Scientific13-678-20C
Pipette bulbsFisher Scientific03-448-21
AgaroseFisher ScientificBP160-500
Egg moldsAdaptive Science ToolsTU-1
Morpholino supplies
Control MorpholinoGene Tools, LLCStandard control olio
Custom MorpholinoGene Tools, LLCNA
Phenol RedSigma AldrichP0290-100ML
CRISPR supplies
Cas9 PlasmidAddGene46757
GoTaq DNA PolymerasePromegaM3001
KOD Hot Start TaqEMD Millipore71-842-3
PrimersIntegrated DNA TechnologiesCustom
T7 Megascript KitAmbion/ThermofisherAM1333
miRNeasy KitQiagen217004
mMessage mMachine T3 kitAmbion/ThermofisherAM1348
MinElute KitQiagen28204
Tol2 transgenesis supplies
pCS-zT2TP plasmidKawakami et al., 2004Request from senior author
CutSmart BufferNew England BiolabsB7204
NotI-HF Restriction EnzymeNew England BiolabsR3189
PCR purification KitQiagen28104
SP6 mMessenger KitAmbion/ThermofisherAM1340
Microinjection supplies
Glass Capillary TubesSutter InstrumentsBF100-58-10
Pipette pullerSutter InstrumentsP-97
PicoinjectorWarner InstrumentsPLI-100A
MicromanipulatorWorld Precision InstrumentsM3301R
Micromanipulator StandWorld Precision InstrumentsM10
Micmanipulator BaseWorld Precision InstrumentsSteel Plate Base, 10 lbs

Ссылки

  1. Darwin, C. . On the Origin of Species by Means of Natural Selection. , (1859).
  2. Culver, D. C., Pipan, T. . The Biology of Caves and Other Subterranean Habitats. , (2009).
  3. Mitchell, R. W., Russell, W. H., Elliott, W. R. . Mexican Eyeless Characin Fishes, Genus Astyanax: Environment, Distribution, and Evolution. , (1977).
  4. Huppop, K. Oxygen consumption of Astyanax fasciatus (Characidae, Pisces): A comparison of epigean and hypogean populations. Environmental Biology of Fishes. 17, 299-308 (1986).
  5. Moran, D., Softley, R., Warrant, E. J. Eyeless Mexican Cavefish Save Energy by Eliminating the Circadian Rhythm in Metabolism. PLoS ONE. 9 (9), e107877 (2014).
  6. Protas, M. E., et al. Genetic analysis of cavefish reveals molecular convergence in the evolution of albinism. Nature genetics. 38, 107-111 (2006).
  7. Wall, A., Volkoff, H. Effects of fasting and feeding on the brain mRNA expressions of orexin tyrosine hydroxylase (TH), PYY and CCK in the Mexican blind cavefish (Astyanax fasciatus mexicanus). General and Comparative Endocrinology. 183, 44-52 (2013).
  8. Aspiras, A., Rohner, N., Marineau, B., Borowsky, R., Tabin, J. Melanocortin 4 receptor mutations contribute to the adaptation of cavefish to nutrient-poor conditions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (31), 9668-9673 (2015).
  9. Yoshizawa, M., Gorički, &. #. 3. 5. 2. ;., Soares, D., Jeffery, W. R. Evolution of a behavioral shift mediated by superficial neuromasts helps cavefish find food in darkness. Current Biology. 20 (18), 1631-1636 (2010).
  10. Jeffery, W. R. Regressive Evolution in Astyanax Cavefish. Annual Review of Genetics. 43, 25-47 (2009).
  11. Gross, J. B. The complex origin of Astyanax cavefish. BMC Evolutionary Biology. 12, 105 (2012).
  12. Elipot, Y., Hinaux, H., Callebert, J., Rétaux, S. Evolutionary shift from fighting to foraging in blind cavefish through changes in the serotonin network. Current Biology. 23 (1), 1-10 (2013).
  13. Kowalko, J. E. J., et al. Loss of schooling behavior in cavefish through sight-dependent and sight-independent mechanisms. Current Biology. 23 (19), 1874-1883 (2013).
  14. Duboué, E. R. E. R., Keene, A. C. A. C., Borowsky, R. L. R. L. Evolutionary convergence on sleep loss in cavefish populations. Current Biology. 21 (8), 671-676 (2011).
  15. Chin, J. S., et al. Convergence on reduced stress behavior in the Mexican blind cavefish. Developmental Biology. , (2018).
  16. Scheer, N., Campos-Ortega, J. A. Use of the Gal4-UAS technique for targeted gene expression in the zebrafish. Mechanisms of Development. 80 (2), 153-158 (1999).
  17. Kawakami, K., Shima, A., Kawakami, N. Identification of a functional transposase of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish, and its transposition in the zebrafish germ lineage. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (21), 11403-11408 (2000).
  18. Balciunas, D., et al. Enhancer trapping in zebrafish using the Sleeping Beauty transposon. BMC Genomics. , (2004).
  19. Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome Research. 24 (1), 142-153 (2014).
  20. Kimura, Y., Hisano, Y., Kawahara, A., Higashijima, S. I. Efficient generation of knock-in transgenic zebrafish carrying reporter/driver genes by CRISPR/Cas9-mediated genome engineering. Scientific Reports. 4, (2014).
  21. Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. A Primer for Morpholino Use in Zebrafish. Zebrafish. 6 (1), 69-77 (2009).
  22. Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene “knockdown” in zebrafish. Nature Genetics. , (2000).
  23. Sander, J. D., et al. Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs. Nature Biotechnology. , (2011).
  24. Huang, P., et al. Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs. Nature Biotechnology. , (2011).
  25. Kawakami, K. Transposon tools and methods in zebrafish. Developmental Dynamics. 234 (2), 244-254 (2005).
  26. Urasaki, A., Morvan, G., Kawakami, K. Functional dissection of the Tol2 transposable element identified the minimal cis-sequence and a highly repetitive sequence in the subterminal region essential for transposition. Genetics. 174 (2), 639-649 (2006).
  27. Juntti, S. A., Hu, C. K., Fernald, R. D. Tol2-Mediated Generation of a Transgenic Haplochromine Cichlid, Astatotilapia burtoni. PLoS ONE. 8 (10), (2013).
  28. Harel, I., Valenzano, D. R., Brunet, A. Efficient genome engineering approaches for the short-lived African turquoise killifish. Nature Protocols. 11 (10), 2010-2028 (2016).
  29. Erickson, P. A., Ellis, N. A., Miller, C. T. Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks. Journal of Visualized Experiments. (111), e54055 (2016).
  30. Elipot, Y., Legendre, L., Père, S., Sohm, F., Rétaux, S. Astyanax transgenesis and husbandry: how cavefish enters the laboratory. Zebrafish. 11 (4), 291-299 (2014).
  31. Keene, A., Yoshizawa, M., McGaugh, S. . Biology and Evolution of the Mexican Cavefish. , (2015).
  32. Casane, D., Rétaux, S. Evolutionary Genetics of the Cavefish Astyanax mexicanus. Advances in Genetics. 95, 117-159 (2016).
  33. Mcgaugh, S., et al. The cavefish genome reveals candidate genes for eye loss. Nature Communications. 5, 5307 (2014).
  34. Yoshizawa, M., et al. Distinct genetic architecture underlies the emergence of sleep loss and prey-seeking behavior in the Mexican cavefish. BMC Biology. 13 (1), (2015).
  35. Ma, L., Jeffery, W. R., Essner, J. J., Kowalko, J. E. Genome editing using TALENs in blind Mexican cavefish, Astyanax mexicanus. PLoS ONE. 10 (3), (2015).
  36. Bilandzija, H., Ma, L., Parkhurst, A., Jeffery, W. A potential benefit of albinism in Astyanax cavefish: downregulation of the oca2 gene increases tyrosine and catecholamine levels as an alternative to melanin synthesis. PLoS ONE. 8 (11), e80823 (2013).
  37. Alie, A., et al. Developmental evolution of the forebrain in cavefish: from natural variations in neuropeptides to behavior. eLife. 7, e32808 (2018).
  38. Jaggard, J. B., et al. Hypocretin underlies the evolution of sleep loss in the Mexican cavefish. eLife. 7, e32637 (2018).
  39. Borowsky, R. Handling Astyanax mexicanus eggs and fry. Cold Spring Harbor Protocols. 3 (11), (2008).
  40. Varshney, G. K., Sood, R., Burgess, S. M. Understanding and Editing the Zebrafish Genome. Advances in Genetics. 92, 1-52 (2015).
  41. Wierson, W. A., et al. GeneWeld: a method for efficient targeted integration directed by short homology. BioRxiv. , (2018).
  42. Klaassen, H., Wang, Y., Adamski, K., Rohner, N., Kowalko, J. E. CRISPR mutagenesis confirms the role of oca2 in melanin pigmentation in Astyanax mexicanus. Developmental Biology. , (2018).
  43. Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (34), 13904-13909 (2013).
  44. Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: A multisite gateway-based construction Kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).
  45. Kawakami, K., et al. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Developmental Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
  46. Kowalko, J., Ma, L., Jeffery, W. Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases (TALENs). Journal of Visualized Experiments. (112), e54113 (2016).
  47. Nishino, S., Ripley, B., Overeem, S., Lammers, G. J., Mignot, E. Hypocretin (orexin) deficiency in human narcolepsy. Lancet. , (2000).
  48. Lin, L., et al. The sleep disorder canine narcolepsy is caused by a mutation in the hypocretin (orexin) receptor 2. Cell. , (1999).
  49. Park, H. C., et al. Analysis of upstream elements in the HuC promoter leads to the establishment of transgenic Zebrafish with fluorescent neurons. Developmental Biology. 227 (2), 279-293 (2000).
  50. Higashijima, S., Masino, M. A., Mandel, G., Fetcho, J. R. Imaging Neuronal Activity During Zebrafish Behavior With a Genetically Encoded Calcium Indicator. Journal of Neurophysiology. , (2003).
  51. Vladimirov, N., et al. Light-sheet functional imaging in fictively behaving zebrafish. Nature Methods. 11 (9), 883-884 (2014).
  52. Halpern, M. E., et al. Gal4/UAS transgenic tools and their application to zebrafish. Zebrafish. 5 (2), 97-110 (2008).
  53. Jaggard, J. B., Stahl, B. A., Lloyd, E., Prober, D. A., Duboue, E. R., Keene, A. C. Hypocretin underlies the evolution of sleep loss in the Mexican cavefish. bioRxiv. 7, e32637 (2018).
  54. Bedell, V. M., Westcot, S. E., Ekker, S. C. Lessons from morpholino-based screening in zebrafish. Briefings in Functional Genomics. , (2011).
  55. Robu, M. E., et al. p53 activation by knockdown technologies. PLoS Genetics. , (2007).
  56. Hisano, Y., et al. Precise in-frame integration of exogenous DNA mediated by CRISPR/Cas9 system in zebrafish. Scientific reports. 5, 8841 (2015).
  57. Prykhozhij, S., et al. Optimized knock-in of point mutations in zebrafish using CRISPR/Cas9. Nucleic Acids Res. 46 (17), (2018).
  58. Tessadori, F., et al. Effective CRISPR/Cas9-based nucleotide editing in zebrafish to model human genetic cardiovascular disorders. Disease Model Mechanisms. 11 (10), (2018).
  59. Armstrong, G., Liao, M., You, Z., Lissouba, A., Chen, B., Drapeau, P. Homology Directed Knockin of Point Mutations in the Zebrafish tardbp and fus Genes in ALS Using the CRISPR/Cas9 System. PLoS ONE. 11 (3), (2016).
  60. Friedrich, R. W., Jacobson, G. A., Zhu, P. Circuit Neuroscience in Zebrafish. Current Biology. 20 (8), (2010).
  61. Friedrich, R. W., Genoud, C., Wanner, A. A. Analyzing the structure and function of neuronal circuits in zebrafish. Frontiers in Neural Circuits. 7, (2013).
  62. Scott, E. K., et al. Targeting neural circuitry in zebrafish using GAL4 enhancer trapping. Nature Methods. 4 (4), 323-326 (2007).
  63. Asakawa, K., Kawakami, K. Targeted gene expression by the Gal4-UAS system in zebrafish. Development Growth and Differentiation. , (2008).
  64. Lloyd, E., et al. Evolutionary shift towards lateral line dependent prey capture behavior in the blind Mexican cavefish. Developmental Biology. , (2018).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

146cavefish

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены