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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Descriviamo gli approcci per la manipolazione dei geni nel sistema modello evolutivo Astyanax mexicanus. Sono descritti tre diverse tecniche: transgenesi Tol2-mediata, mirata manipolazione del genoma utilizzando CRISPR/Cas9 e atterramento di espressione utilizzando morpholinos. Questi strumenti dovrebbero facilitare l'indagine diretta di geni alla base della variazione tra forme di superficie e caverne.

Abstract

Grotta di animali forniscono un sistema convincente per indagare i meccanismi evolutivi e le basi genetiche alla base di cambiamenti in numerosi tratti complessi, tra cui la degenerazione degli occhi, albinismo, perdita di sonno, iperfagia ed elaborazione sensoriale. Specie di caverna da tutto il mondo visualizzare un'evoluzione convergente dei tratti morfologici e comportamentali a causa di pressioni ambientali condivisi tra sistemi differenti della caverna. Grotta diverse specie sono state studiate nell'impostazione del laboratorio. Il tetra messicano, Astyanax mexicanus, con forme di ipovedenti e non vedenti, ha fornito le comprensioni uniche nei processi biologici e molecolari che sono alla base dell'evoluzione dei tratti complessi ed è ben studiato come sistema modello emergenti. Mentre in a. mexicanus, sono stati identificati geni che regolano l'evoluzione di diversi processi biologici, la possibilità di convalidare un ruolo per singoli geni è stata limitata. L'applicazione della transgenesi e modifica del gene tecnologia ha il potenziale per superare questo ostacolo significativo e per studiare i meccanismi alla base dell'evoluzione dei tratti complessi. Qui, descriviamo una metodologia diversa per la manipolazione di espressione genica in a. mexicanus. Approcci includono l'uso di morpholinos, Tol2 transgenesi, e modelli di sistemi gene-editing, comunemente utilizzati in zebrafish e altri pesci di funzione del gene in a. mexicanusdi manipolare. Questi protocolli includono le descrizioni dettagliate delle procedure di allevamento temporizzata, la raccolta di uova fecondate, iniezioni e la selezione di animali geneticamente modificati. Questi approcci metodologici permetterà per l'indagine dei meccanismi genetici e neurali che l'evoluzione dei diversi tratti in a. mexicanus.

Introduzione

Da allora di Origine delle speciedi Darwin1, gli scienziati hanno acquisito profonde intuizioni come tratti sono modellati evolutivamente in risposta a pressioni ambientali ed ecologiche definite, grazie alla grotta organismi2. Il tetra messicano, a. mexicanus, consiste di eyed popolazioni 'superficie' ancestrale che popolano fiumi tutto il Messico e il Texas del sud e di almeno 29 popolazioni geograficamente isolate di morph grotta derivata che abitano la Sierra del Abra e altre zone del Messico nord-orientale3. Un numero di tratti di grotta-collegati è stato identificato in a. mexicanus, compreso consumo di ossigeno alterata, depigmentazione, perdita degli occhi e alterata alimentazione e foraggiamento comportamento4,5,6, 7,8,9. A. mexicanus presenta un potente modello per studiare i meccanismi di evoluzione convergente a causa di una ben definita storia evolutiva, una dettagliata caratterizzazione dell'ambiente ecologico e la presenza di indipendentemente evoluto grotta popolazioni10,11. Molti dei tratti grotta-derivati che sono presenti nella caverna, compresa la perdita dell'occhio, perdita di sonno, alimentazione, perdita di scolarizzazione è aumentato, ridotto di aggressione e ridotto le risposte allo stress, più volte si sono evoluti attraverso origini indipendenti, spesso utilizzando diverse vie genetiche tra grotte8,12,13,14,15. Questo ripetuto evolution è un aspetto potente del sistema a. mexicanus e può fornire spaccato la questione più generale dei sistemi genetici come può essere perturbato per generare fenotipi simili.

Mentre l'applicazione della tecnologia genetica per l'indagine meccanicistica della funzione del gene è stato limitato in molte specie di pesci (tra cui a. mexicanus), gli avanzamenti recenti in zebrafish forniscono una base per lo sviluppo della tecnologia genetica nei pesci 16,17,18,19,20. Numerosi strumenti sono ampiamente utilizzati in zebrafish per manipolare l'espressione genica e l'attuazione di queste procedure a lungo sono stati standardizzati. Ad esempio, l'iniezione di morpholino oligos (MOs) a livello di singola cellula selettivamente blocca RNA e impedisce la traduzione per una breve finestra temporale durante sviluppo21,22. Inoltre, modifica del gene approcci, come cluster regolarmente intervallate brevi ripetizioni palindromi (CRISPR) / CRISPR-collegato della proteina 9 (Cas9) e nucleasi di trascrizione attivatore-come effettore (TALEN), consentire per la generazione delle omissioni definite o, in alcuni casi, gli inserimenti attraverso una ricombinazione in genomi19,20,23,24. Transgenesi sono utilizzata per modificare l'espressione genica stabile o funzione in un modo specifico di cellula-tipo. Il sistema Tol2 viene utilizzato efficacemente per generare animali transgenici di pre transposase mRNA con un plasmide DNA Tol2 contenente un transgene25,26. Il sistema Tol2 utilizza la transposase Tol2 di medaka per generare gli inserimenti di germline stabile di transgenici construct17. Generazione di Tol2 transgenetica coinvolge pre un plasmide contenente un transgene affiancato da siti di integrazione Tol2 e mRNA per Tol2 transposase17. Questo sistema è stato utilizzato per generare una matrice di linee transgeniche in zebrafish e il suo utilizzo ha recentemente ampliato ai sistemi modello emergente addizionali, tra cui ciclidi, killifish, spinarello e, più recentemente, la caverna messicano27, 28,29,30.

Mentre la caverna è un affascinante sistema biologico per meccanismi di comprensione dell'evoluzione del tratto, sua piena capacità come un modello evolutivo non è stata pienamente sfruttata. Ciò è parzialmente dovuto un'incapacità di manipolazione genetica e cellulare direttamente funzionare31. Geni candidati tratti complessi di regolazione sono stati identificati usando quantitative trait loci (QTL) gli studi, ma la convalida di questi geni candidati è stato difficile32,33,34. Recentemente, transitoria atterramento utilizzando morpholinos, gene editing utilizzando sistemi CRISPR e TALEN e l'uso di Tol2-transgenesi mediate sono stati usati per studiare le basi genetiche alla base di un numero di tratti35,36,37 ,38. L'implementazione e la standardizzazione di queste tecniche vi permetterà per le manipolazioni che interrogano le basi molecolari e neurali di tratti biologici, tra cui la manipolazione della funzione genica, l'etichettatura delle popolazioni di cellule definito, e l'espressione dei reporter funzionale. Considerando che l'efficace attuazione di questi strumenti genetici per manipolare gene o funzione cellulare è stata dimostrata in sistemi modello emergente, protocolli dettagliati sono ancora carenti in a. mexicanus.

A. mexicanus forniscono approfondimenti critici i meccanismi dell'evoluzione in risposta ai cambiamenti ambientali e presentare l'opportunità di identificare nuovi geni che regolano diversi tratti. Una serie di fattori suggeriscono che a. mexicanus è un modello estremamente trattabile per l'applicazione degli strumenti genomici stabiliti attualmente disponibile in modelli genetici consolidati, tra cui la possibilità di mantenere facilmente il pesce nei laboratori di grandi dimensioni di covata, trasparenza, un genoma sequenziato e analisi comportamentali definiti39. Qui, descriviamo una metodologia per l'uso di morpholinos, transgenesi e gene editing in superficie e Grotta di popolazioni di a. mexicanus. La più ampia applicazione di questi strumenti in a. mexicanus consentirà un'indagine meccanicistica di processi molecolari che sono alla base dell'evoluzione delle differenze inerenti allo sviluppo, fisiologiche e comportamentali tra caverna e pesci di superficie.

Protocollo

1. Morpholino oligo design

Nota: Sequenze per a. mexicanus sono disponibili attraverso National Center di Biotechnology Information (NCBI) Gene e NCBI SRA (https://www.ncbi.nlm.nih.gov), nonché dal browser genoma Ensembl (https://www.ensembl.org). Quando si progetta un morpholino per l'uso in entrambe le forme caverna-dimora e di superficie, è fondamentale per identificare qualsiasi variazione genetica tra il morphing in questa fase, quindi queste regioni genetiche possono essere evitate come bersagli per morpholinos. Qualsiasi variazione polimorfica all'interno di un sito di destinazione di morpholino può condurre all'associazione inefficace. Il design è simile ad altri sistemi di pesce, come pesce zebra e precedentemente è stato indicato di lavorare efficacemente in a. mexicanus21,36,40.

  1. Progettazione di morpholinos traduzione-blocco
    Nota: Traduzione-blocco morpholinos bloccare traduzione legandosi al sito inizio endogeno e ostacolare traslazionale macchinari da associazione la sequenza di mRNA attraverso impedimento sterico.
    1. Identificare la regione di codificazione del gene dell'obiettivo a partire con il sito di inizio ATG.
    2. Registrare le prime 25 coppie di basi della sequenza dell'obiettivo di copia-e-incolla la sequenza in un quaderno di laboratorio o editor di testo.
    3. Utilizzando software online (ad esempio, http://reverse-complement.com) o traduzione manuale, generare il complemento inverso della sequenza di destinazione. Salvare il complemento inverso risultante in un editor di testo o il taccuino del laboratorio.
    4. Ordinare un morpholino con la sequenza inversa complemento da una società che genera oligonucleotidi morfolino. Vedi Tabella materiali per le aziende.
  2. Progettazione di morpholinos bloccante della giuntura
    Nota: Splice-blocco morpholinos bloccare splicing e, quindi, prevenire la formazione di una molecola di mRNA maturo. Questo fornisce un metodo alternativo per atterramento quando i siti di inizio non sono ben definiti, o un approccio più ottimale quando si desidera ottenere convalida di atterramento via reazione a catena della polimerasi (PCR). Questo vantaggio di morpholinos bloccante della giuntura (sopra ATG-blocco MOs) è che l'esclusione dell'esone o l'inclusione dell'introne può essere facilmente valutata con trascrittasi inversa (RT)-PCR e dimensione differenze fruite su un gel. RT-PCR ed elettroforesi su gel per determinare l'efficacia di morpholino dovrebbe essere fatto utilizzando le procedure standard di laboratorio.
    1. Identificare la sequenza di pre-mRNA del gene target. Utilizzare le informazioni disponibili dal genoma a. mexicanus via NCBI o Ensembl per determinare introne-esone confini33.
    2. Target dell'esone-introne (donatore della giuntura) o siti di contorno (accettore di splice) introne-esone per esclusione inclusione o esone introne.
      Nota: Lo spliceosoma normalmente gli obiettivi di una sequenza di "GU" (U1 destinazione) dell'introne al 5' impiombi il luogo e una sequenza di AG" "al luogo della giuntura intronic di (U2 destinazione) 3'. In condizioni normali, lo spliceosoma U1 e U2 subunità associare questi siti di destinazione nella sequenza di pre-mRNA per splicing corretto per verificarsi. Tuttavia, se una di queste sequenze di destinazione è bloccata da un morpholino, lo spliceosoma avrà avanti al prossimo sito disponibile U1 o U2, causando sia un introne esclusione o essone nella sequenza di mRNA. Ciò comporterà la pianificazione/ottimizzazione, a seconda della natura del gene bersaglio21. In genere, bloccando un sito interno U1 reindirizza l'impiombatura al sito U1 disponibile successivo, causando un'asportazione di esone. In alternativa, bloccando la giunzione della giuntura prima o l'ultima causa un'inclusione introne perché non c'è nessun altro sito di reindirizzare l'impiombatura a. Utilizzare software di sequenza per prevedere l'effetto di varie esclusioni contro inclusioni. Le previsioni possono indicare potenziali frameshift o codoni di stop prematuri, che indica un sito di destinazione più efficace per rottura del mRNA.
    3. Una volta identificato il sito di destinazione, è possibile registrare la sequenza in un libro di laboratorio o editor di testo. Assicurarsi che il sito di destinazione è 25 paia di basi (bp).
    4. Utilizzando software online (ad esempio, http://reverse-complement.com) o traduzione manuale, generare il complemento inverso della sequenza di destinazione. La sequenza di record in un libro di laboratorio o editor di testo.
    5. Ordinare un morpholino con la sequenza inversa complemento da una società che genera oligonucleotidi morfolino. Vedi Tabella materiali per le aziende del campione.

2. Morpholinos iniettabile

Nota: Diverse concentrazioni o volumi di iniezione MO saranno necessario essere eseguiti per stabilire la concentrazione ottimale per iniettare. Quantità tipiche iniezioni sono 400 – 800 pg di MO. L'effetto di morpholino knockdown può persistere per fino a 6 di postinjection giorni.

  1. Ottenere il morpholino stock. Il morpholino stock arriva liofilizzato. Idratare e con sterile H2O prima dell'uso alla concentrazione stock desiderata (ad es., 4 mM). Conservare a-20 °C fino all'utilizzo.

3. CRISPR gRNA design, trascrizione in vitro e preparazione

  1. Progettazione di gRNA CRISPR
    Nota: gRNAs sono stati generati utilizzando ricerca precedentemente pubblicata da Varshney et al.40 e41di Wierson et al.
    1. Utilizzando un browser del genoma, identificare la regione di codificazione del gene di interesse. Utilizzando la sequenza genomic, identificare la sequenza di destinazione gRNA all'interno di un esone ricercando un 20 bp del nucleotide destinazione sequenziamento che cominciano con GG e seguito da una sequenza di PAM (NGG). Una regione del gene dopo l'inizio (ATG) sarà mirato.
      Nota: Se una sequenza di destinazione con GG all'estremità 5' non può essere trovata nel desiderato esone del gene, uno o entrambi i G's può essere sostituito per i nucleotidi primi e la secondo all'estremità 5' della sequenza. Tuttavia, le due G's deve essere incorporata in oligo, come questi sono richiesti per la trascrizione di T7.
    2. Progettare e ordinare un oligonucleotide di gene-specific (oligo r: 5'-TAATACGACTCACTATAGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3'). Aggiungere la sequenza bersaglio di gene-specifico 20 bp gRNA (in grassetto) senza la sequenza di PAM tra una sequenza del promotore T7 (rossa) e una sequenza di sovrapposizione utilizzato tempri un secondo oligonucleotide (blu). Tempri e amplificare (Vedi punto 3.2.1) questo oligo A e una seconda oligo (oligo b: 5'-GATCCGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTT AACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC-3') per generare il modello gRNA utilizzato per la trascrizione.
      Nota: È lo stesso per ogni reazione e bisogno di essere ordinato solo 1x Oligo B.
  2. trascrizione e gRNA preparazione
    1. Tempri e amplificare i oligos. Includono i seguenti primer per amplificare il gRNA al fine di aumentare la resa: 5'-TAATACGACTCACTATA-3' (T7 primer) e 5'-GATCCGCACCGACTCGGTG-3' (3' gRNA primer). Eseguire una PCR utilizzando Thermococcus Thermococcus (KOD) polimerasi.
      Nota: Per entrambi primer oligo A e oligo B, 10 cicli è consigliato per una buona resa. Un protocollo dettagliato può essere trovato in Wierson et al.41.
    2. Trascrivere il gRNA usando i kit di trascrizione in vitro commercialmente disponibili (Vedi Tabella materiali). Questo viene fatto attraverso modifiche il produttore'protocollo s pubblicato da Klaassen et al42.
    3. Precipitare, lavare e risospendere il gRNA come descritto da Klaassen et al42.
      Nota: Il gRNA deve essere risospeso in acqua RNAsi-libera per prevenire il degrado.
    4. Si trascrive la concentrazione di gRNA, che possa essere determinata utilizzando uno spettrofotometro. Valutare la qualità del RNA mediante l'esecuzione di 2 µ l su un gel di agarosio. Aliquota RNA per evitare congelamento/scongelamento e conservare a-80 °C fino a immediatamente prima le iniezioni.
  3. Trascrizione e preparazione Cas9
    1. Cas9 mRNA può essere trascritto usando i kit di trascrizione in vitro commercialmente disponibili (Vedi Tabella materiali) come descritto in precedenza43. Utilizzare la versione nls-Cas9-nls43.
    2. Si trascrive la concentrazione del gRNA e valutarne la qualità tramite l'esecuzione di 2 µ l su un gel di agarosio. Aliquota RNA per evitare la decomposizione che si pone nei diversi cicli di gelo-disgelo e conservare le aliquote a-80 °C.

4. preparazione di costrutti Tol2, transposase Tol2 e transgenesi

  1. Preparare Tol2 transgene costrutti per l'iniezione.
    Nota: Abbiamo utilizzato con successo pubblicato/disponibile zebrafish e medaka costruisce in a. mexicanus. Questi costrutti sono completamente funzionali in a. mexicanus, probabilmente a causa del livello elevato di omologia di sequenza (fare riferimento al repository AddGene e la rete di informazioni di Zebrafish [ZFIN] databases per costrutti disponibile). I frammenti del promotore di zebrafish hanno espresso i transgeni nei tessuti previsti quando utilizzato in a. mexicanus.
    1. Acquisire Tol2 costrutti o generare plasmide con un promotore tessuto-specifici, il transgene desiderato e Tol2 braccia (Vedi Kwan et al.44). Al ricevimento, sequenza il costrutto per convalidare il plasmide.
    2. Eseguire una midiprep per costrutti secondo il produttore'degli orientamenti. Eluire il plasmide finale privo di RNasi H2O, determinare la concentrazione con uno spettrofotometro, diluire la concentrazione a 100–300 ng /μL e aliquota e store i costrutti a-20 °C.
  2. Digerire Tol2 transposase plasmide e sintetizzare mRNA.
    1. Ottenere una copia del plasmide transposase Tol2 (pCS-zT2TP) come modello per la generazione di mRNA Tol245.
    2. Midiprep pz-zT2TP costruire secondo il produttore'degli orientamenti. Eluire esso in un basso volume di acqua RNAsi-libera o buffer (~ 50 μL). Conservare le aliquote a-20 °C.
    3. Digerire il plasmide Tol2 usando un enzima di restrizione.
      1. Eseguire una raccolta di limitazione su 10 µ g di plasmide circolare pCS-zT2TP utilizzando la tabella 1.
      2. Dividere la reazione in 2–50 reazioni di μL e incubare le reazioni durante la notte a 37 °C in un termociclatore.
      3. Il giorno seguente, inattivare l'enzima riscaldandolo a 65 °C per 20 min.
      4. Purificare il plasmide linearizzato immediatamente dopo il digest, utilizzando commercialmente disponibili PCR Kit di purificazione (Vedi Tabella materiali) per la Guida di riferimento di produttori' . Eluire il plasmide in 15 μL di RNAsi-libera H2O e determinare la concentrazione del prodotto utilizzando uno spettrofotometro.
      5. Eseguire 1 μL di plasmide digerito e 1 μL del plasmide non tagliato su un 1,5% di agarosio gel per confermare il plasmide linearizzato.
    4. Eseguire una trascrizione in vitro di Tol2 mRNA.
      1. Utilizzare 1 µ g di plasmide linearizzato pz-zT2TP come un modello per la trascrizione. Seguire il produttore'degli orientamenti per la trascrizione in vitro (Vedi Tabella materiali), come descritto nella tabella 2.
      2. Incubare a 37 °C in un termociclatore per il produttore'degli orientamenti.
      3. Aggiungere 1 µ l di DNasi, incubare a 37 °C in un termociclatore per il produttore'degli orientamenti.
      4. Eseguire precipitazioni di cloruro di litio per protocollo di kit di trascrizione. Risospendere il pellet di RNA in ~ 20–30 μL di RNAsi-libera H2O.
      5. Determinare la concentrazione del prodotto utilizzando uno spettrofotometro e registrare la qualità di RNA.
      6. Diluire il prodotto a ~ 100–300 ng / µ l e aliquota in 5 campioni di 10 μL di–per evitare ripetuti di congelamento-scongelamento. Conservarli a-80 °C fino all'utilizzo.
        Nota: È possibile controllare 1–2 µ l di purificato Tol2 mRNA per sbavatura/band con elettroforesi su gel.

5. microiniezioni

  1. Preparazione di strumenti generali per iniezioni
    Nota: Le procedure descritte in questa sezione sono stati descritti dettagliatamente da Kowalko et al.46, e qui viene presentata una panoramica con modifiche minori.
    1. Generare piastre iniezione di agarosio 3% caldo versando disciolto in acqua sistema di pesci in un mL 100 di Petri. Posizionare un stampaggio ad iniezione di uovo nell'agarosio appena spillata a fare pozzi per le uova di pesce. Posizionare il lato dello stampo in agar a un angolo di 45° e, quindi, abbassarlo lentamente in agarosio; abbassare lentamente la muffa in un angolo evita aria rimanere intrappolato sotto lo stampo. Rimuovere delicatamente lo stampo una volta l'agarosio è solidificato. Le piastre possono essere memorizzate, sigillato, a 4 °C fino a 1 settimana.
    2. Tirare aghi dai vasi capillari di vetro borosilicato per iniezione in un estrattore di elettrodo/aghi secondo il produttore'degli orientamenti. Questo protocollo varierà per estrattore pipetta; Tuttavia, un programma di esempio tirando ago può essere trovato nella tabella 3.
      Nota: Ottimizzare l'ago è importante per iniezioni, come gli aghi che sono troppo lunghi saranno piegare piuttosto che penetrare in modo pulito l'uovo.
    3. Fare pipette in vetro di grosso calibro per il trasferimento di uovo rompendo pipette in vetro standard, quindi l'apertura è abbastanza grande per le uova. Utilizza un bruciatore di Bunsen, polacco alla fine rotta del vetro esponendo alla fine delle pipette rotte alla fiamma fino a quando non è liscia.
  2. Installazione di allevamento
    Nota: Ci sono diversi protocolli utilizzati per l'allevamento a. mexicanus. Per un protocollo dettagliato, vedere Borowsky39. Avviare il setup di allevamento 1 settimana prima le iniezioni.
    1. Il giorno 1, posizionare due o tre femmine e tre o quattro maschi in una vasca singola 10 galloni mantenuta a 24 ± 1 °C.
    2. Nei giorni 1–7, aumentare l'alimentazione di ~ 3 volte al giorno. Garantire che la dieta include cibo vivo, come vermi neri e gambero di salamoia.
    3. Il giorno 6, aggiungere un riscaldatore serbatoio singolo impostato a 27 °C. Lab serbatoio le temperature variano; Pertanto, si tratta di un aumento di 2–parente di 3 °C alla temperatura normale del carro armato.
    4. La sera del giorno 7, ovvero la sera (zeitgeber [ZT] 9–11) della notte di iniezione, accuratamente pulire i serbatoi con una spugna imbevuta di acqua e rimuovere qualsiasi cibo in eccesso o detriti utilizzando una rete a maglia fine o un sifone.
    5. La notte del giorno 7, avviare il controllo per le uova di pesce superficie alle ZT15 e continuare a controllare ogni 15–30 min fino a ZT18. Per caverna, avviare il controllo per le uova alla ZT17 e continuare a controllare ogni 15–30 min fino a ZT20.
      Nota: I tempi sono basati su un 14:10 h luce: ciclo scuro utilizzando zeitgeber tempo. Tempi di allevamento sono stime e laboratori individuali devono comunicare l'orario esatto. È fondamentale per raccogliere le uova subito dopo sono rilasciato/fertilizzato per iniettare loro a livello di singola cellula.
  3. Raccolta di uova di cella singola fase
    1. La notte in cui è previsto l'allevamento, esaminare i carri armati ogni 15–30 min e monitor per le uova nella parte inferiore del serbatoio. Le uova appaiono traslucide, misura circa 1 mm di diametro.
    2. Utilizzare una rete a maglia fine dei pesci per raccogliere uova e trasferirli in una ciotola di vetro riempita di acqua del sistema di pesce fresco. Esaminare le uova sotto un microscopio per confermare che le uova sono in fase di un cella.
    3. Utilizzando pipette in vetro, trasferire uova cella singola per le piastre di iniezione. Pipette in vetro sono necessari in questa fase, come le uova si attaccano alla plastica.
    4. Utilizzando una pipetta, rilasciare con attenzione le uova nei pozzetti della piastra iniezione dell'agarosi dalla sezione 5.1. Riempire le righe della piastra iniezione preriscaldata (a temperatura ambiente) con il numero massimo di uova (30–40 per ogni riga e fino a cinque righe). Intere righe aiutano a mantenere le uova di muoversi durante le iniezioni. Mantenere le uova idratate sulla piastra con una piccola quantità di acqua di pesci sistema iniezione fino al compimento delle iniezioni.
  4. Installazione di Pico-iniezione e iniezione generale ottimizzazione linee guida
    1. Recupero informazioni gli aghi per iniezione utilizzando una pipetta di gel-caricamento suggerimenti che corrispondono all'interno del capillare o usando puntali standard micropipetta e l'aggiunta di un bolo di 4 µ l di–2 fino alla fine. Una volta che l'ago è pieno, è possibile utilizzare pinze per tagliare la lunghezza in eccesso dall'ago per iniezione.
    2. Eseguire microiniezioni con un ago montato in un micromanipolatore, collegato ad un microinjector picolitri.
    3. Impostare il tempo di iniezione di 0.03 s e la pressione fuori a ~0.0 psi. La pressione di iniezione varierà di conseguenza con le differenze secondarie fra gli aghi, così ottimizzare per ottenere un bolo di iniezione nL ~1.0.
      Nota: La pressione di iniezione è spesso nella gamma di ~ 10–30 psi.
    4. Standardizzare il bolo iniezione iniezione in olio minerale e misurando il bolo dimensione con una slitta micrometrica per ottenere un ~ 1–1.5 volume di iniezione di nL. Regolare la pressione di iniezione (psi) per aumentare o diminuire il volume del bolo.
    5. Attingere acqua al largo della parte superiore delle uova utilizzando un tessuto di laboratorio.
      Nota: Il corion uovo Astyanax è leggermente più difficile da penetrare rispetto alle uova di pesce zebra. Troviamo che l'acqua al largo della parte superiore delle uova di disegno aiuta a facilita la penetrazione dell'ago nella cellula uovo. Ottimizzazione di piastra può consentire per ~ 200 uova su un piatto unico.
    6. Utilizzare il micromanipolatore di penetrare ogni uovo con l'ago e iniettare direttamente nel tuorlo. Una volta posizionata nel tuorlo, iniettare l'uovo premendo il pedale del piede inject pulsante o iniezione.
      Nota: Un piatto completo può essere iniettato all'interno di ~ 15 min. La fase di cella singola dura per ~ 40 min.
  5. Iniezione di morpholinos
    Nota: La quantità di morpholino necessaria per atterramento senza causare tossicità dovrà essere ottimizzato al gene bersaglio; Tuttavia, una concentrazione di 400 pg è un buon punto di partenza.
    1. Preparare morpholino affinché 400 pg di morpholino sarà iniettato per ogni uovo. Disgelo morpholino sul ghiaccio. La soluzione iniettabile è costituita di morpholino (alla concentrazione desiderata), privo di RNasi H2O o Danieau's soluzione e rosso fenolo (10% del volume finale). Per un esempio, vedere la tabella 4.
    2. Iniettare 1 nL per embrione.
  6. Iniezioni di CRISPR
    1. Preparare il RNA affinché 25 pg di gRNA e 300 pg di Cas9 mRNA totale verrà iniettati per embrione. Per una miscela di iniezione CRISPR/Cas9 campione, cfr. tabella 5.
    2. Iniettare 2 nL di gRNA/Cas9 mRNA per embrione direttamente nell'embrione.
  7. Iniezione di transposase Tol2 e plasmide Tol2-affiancata per transgenesi
    1. Scongelare transposase mRNA e plasmide Tol2 su ghiaccio. Combinare Cas9 mRNA (a 25 ng / µ l), desiderato Tol2 costrutto (25 ng /μL) e rosso fenolo (≤10% del volume finale) in acqua RNAsi-libera. Per una miscela di iniezione di campione Tol2 transgenesi, vedere tabella 6.
    2. Conservare la soluzione per iniezione e aghi sul ghiaccio per evitare la degradazione del mRNA. Iniettare 1 nL in volume per ogni embrione.

6. allevamento e screening iniettato pesce

  1. Allevamento di pesci iniettato
    1. Dopo le uova vengono iniettate, immediatamente di trasferirli a ciotole di vetro (10 x 5 cm) riempito con ~ 200 mL di acqua sistema di pesci. Le uova sono facilmente risciacquabile immergendo le piastre di iniezione in ciotole piene di pesce acqua e risciacquo le uova con una pipetta.
    2. Posto di ~ 50–80 embrioni iniettati per ciotola e allevarli a 22–24 °C.
    3. Pulire le ciotole con iniettato pesce 2 volte al giorno per rimuovere embrioni morti e modificare ~ 20% dell'acqua su una base quotidiana.
    4. Ulteriori allevamento viene eseguita secondo protocolli precedentemente pubblicati39.
  2. Screening degli individui morpholino-iniettato
    1. Visualizzare gli animali sotto un microscopio stereoscopico a schermo per i fenotipi. L'effetto di morpholinos può persist fino a ~ 5 giorni postinjection21.
    2. Misura fenotipi comportamentali presso postinjection 4 giorni.
  3. Screening per CRISPR indels
    1. Disegnare primers per amplificare il DNA di genomic intorno al sito di destinazione. Disegnare primers, in modo che il prodotto di PCR di destinazione è di circa 100–125 bp.
      Nota: ad esempio, per il locus oca2 , la regione che circonda il sito di destinazione gRNA è stata amplificata utilizzando il forward primer 5'-CTCCTCTGTCAGGCTGTGC-3' e il reverse primer 5'-GAAGGGGATGTTGTCTATGAGC-3' per una lunghezza di prodotto PCR di 105 bp.
    2. Sacrificare embrioni o pinna pesci adulti clip secondo il protocollo istituzionale degli animali.
    3. Raccogliere embrioni o pinne dissecati in provette per PCR ed estrarre il DNA ed esecuzione dei protocolli di PCR di PCRs. campione per gli iniettori di gene-specific possono essere trovati in Ma et al.35.
    4. Per valutare per mutagenesi, eseguire 5 µ l di prodotto di PCR su un gel di agarosio al 3% a 70 V per 3 h. Wild-type (nonmutagenized) del DNA si tradurrà in un prodotto PCR come un gruppo distinto. DNA mutante si tradurrà in una band untuosa sul gel.
    5. Per determinare la sequenza degli alleli del mutante, TA clonare il prodotto PCR secondo il produttore's istruzioni, scegliere colonie e culture miniprep. Inviare il DNA risultante per il sequenziamento.
    6. Per stabilire e mantenere linee di pesce trasmettendo gli alleli del mutante, attraversare pesci adulti iniettato di selvaggio-tipo pesce e schermo 5–10 embrioni per determinare se uno qualsiasi della prole trasportare un allele del mutante del gene seguendo passaggi 6.3.1-6.3.6.
      Nota: Gli individui di1 F diverso dal pesce stesso del fondatore F0 possono trasportare diverse mutazioni. Garantire linee mutanti sono in sequenza per ottenere le mutazioni possono produrre gli alleli che sono fuori dall'inquadratura.
    7. Identificare il pesce che trasportano un allele del mutante di PCR usando l'analisi di banda untuosa (misure 6.3.1-6.3.6) o di progettazione degli iniettori PCR allele-specifico che amplificheranno mutante e bande di selvaggio-tipo (Figura 2).
    8. Una volta stabilita una linea di pesce, gli alleli del mutante di homozygose per testare per fenotipi recessivi.
  4. Screening per individui positivi transgenici
    Nota: Utilizzando costrutti contenenti un bollitore fluorescente è consigliato per snellire lo screening per individui positivi transgenici. Tuttavia, i metodi di screening standard di PCR può essere utilizzato a schermo per la trasmissione.
    1. Visualizzare le proteine fluorescenti tessuto-specifica nel pesce0 F più presto di postinjection 2 giorni, con un ambito di dissezione di epifluorescenza.
      Nota: L'espressione nelle larve0 F è mosaico, e gli individui positivi possono avere una gamma di fenotipi di espressione.
    2. Mantenere gli individui positivi come F0 fondatore pesci.
    3. Quando F0s raggiungono la maturità, incrocio fondatori pesce a nontransgenic individui che deriva da uno stesso stock di popolazione/laboratorio. Schermo F1 prole usando lo stesso protocollo, come descritto al punto 6.2.
      Nota: L'espressione nelle larve di F1 è uniforme e garantisce la coerenza fra i fratelli germani1 F.
    4. Poiché non è Tol2 integrazione sito-mediata e integrazione può variare tra fondatori, selezionare F1 fratelli derivato un singolo fondatore0 F e incrociarsi esprimendo la positiva fratelli germani di1 F per generare F2s. Questa prole sarà la base per una linea stabile.

Risultati

Popolazioni più della caverna-dimora a. mexicanus mostrano ridotta sonno e veglia/attività aumentata rispetto al loro conspecifici di superficie-abitazione14. Ipocretina/orexina (HCRT) è un neuropeptide altamente conservato, che agisce per aumentare lo stato di Veglia, e aberrazioni nella via HCRT causano narcolessia in esseri umani ed altri mammiferi47,48. Precedentemente abbiamo dimostrato quella grotta a. mexicanus ...

Discussione

Qui, abbiamo fornito una metodologia per la manipolazione di funzione del gene usando morpholinos, CRISPR/Cas9 gene editing e metodologia di transgenesi. La ricchezza della tecnologia genetica e l'ottimizzazione di questi sistemi in zebrafish consentirà probabilmente per il trasferimento di questi strumenti a. mexicanus con facilità52. Recenti scoperte hanno utilizzato questi approcci in a. mexicanus, ma rimangono sottoutilizzate nell'indagine su diversi tratti morfologici, del...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Riconoscimenti

Gli autori ringraziano Sunishka Thakur per la sua assistenza in genotipizzazione e imaging il pesce mutante oca2 rappresentato nella Figura 2. Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Science Foundation (NSF) award 1656574 a A.C.K, NSF award 1754321 J.K. e A.C.K e premio National Institutes of Health (NIH) R21NS105071 a A.C.K ed E.R.D.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Fish breeding & egg supplies
Fine mesh fish netPenn PlaxBN4
Fish tank heaterAqueon100106108
Egg trapsCustom madeNADesign and create plastic grate to place at bottom of tank to protect eggs
Glass pipettesFisher Scientific13-678-20C
Pipette bulbsFisher Scientific03-448-21
AgaroseFisher ScientificBP160-500
Egg moldsAdaptive Science ToolsTU-1
Morpholino supplies
Control MorpholinoGene Tools, LLCStandard control olio
Custom MorpholinoGene Tools, LLCNA
Phenol RedSigma AldrichP0290-100ML
CRISPR supplies
Cas9 PlasmidAddGene46757
GoTaq DNA PolymerasePromegaM3001
KOD Hot Start TaqEMD Millipore71-842-3
PrimersIntegrated DNA TechnologiesCustom
T7 Megascript KitAmbion/ThermofisherAM1333
miRNeasy KitQiagen217004
mMessage mMachine T3 kitAmbion/ThermofisherAM1348
MinElute KitQiagen28204
Tol2 transgenesis supplies
pCS-zT2TP plasmidKawakami et al., 2004Request from senior author
CutSmart BufferNew England BiolabsB7204
NotI-HF Restriction EnzymeNew England BiolabsR3189
PCR purification KitQiagen28104
SP6 mMessenger KitAmbion/ThermofisherAM1340
Microinjection supplies
Glass Capillary TubesSutter InstrumentsBF100-58-10
Pipette pullerSutter InstrumentsP-97
PicoinjectorWarner InstrumentsPLI-100A
MicromanipulatorWorld Precision InstrumentsM3301R
Micromanipulator StandWorld Precision InstrumentsM10
Micmanipulator BaseWorld Precision InstrumentsSteel Plate Base, 10 lbs

Riferimenti

  1. Darwin, C. . On the Origin of Species by Means of Natural Selection. , (1859).
  2. Culver, D. C., Pipan, T. . The Biology of Caves and Other Subterranean Habitats. , (2009).
  3. Mitchell, R. W., Russell, W. H., Elliott, W. R. . Mexican Eyeless Characin Fishes, Genus Astyanax: Environment, Distribution, and Evolution. , (1977).
  4. Huppop, K. Oxygen consumption of Astyanax fasciatus (Characidae, Pisces): A comparison of epigean and hypogean populations. Environmental Biology of Fishes. 17, 299-308 (1986).
  5. Moran, D., Softley, R., Warrant, E. J. Eyeless Mexican Cavefish Save Energy by Eliminating the Circadian Rhythm in Metabolism. PLoS ONE. 9 (9), e107877 (2014).
  6. Protas, M. E., et al. Genetic analysis of cavefish reveals molecular convergence in the evolution of albinism. Nature genetics. 38, 107-111 (2006).
  7. Wall, A., Volkoff, H. Effects of fasting and feeding on the brain mRNA expressions of orexin tyrosine hydroxylase (TH), PYY and CCK in the Mexican blind cavefish (Astyanax fasciatus mexicanus). General and Comparative Endocrinology. 183, 44-52 (2013).
  8. Aspiras, A., Rohner, N., Marineau, B., Borowsky, R., Tabin, J. Melanocortin 4 receptor mutations contribute to the adaptation of cavefish to nutrient-poor conditions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (31), 9668-9673 (2015).
  9. Yoshizawa, M., Gorički, &. #. 3. 5. 2. ;., Soares, D., Jeffery, W. R. Evolution of a behavioral shift mediated by superficial neuromasts helps cavefish find food in darkness. Current Biology. 20 (18), 1631-1636 (2010).
  10. Jeffery, W. R. Regressive Evolution in Astyanax Cavefish. Annual Review of Genetics. 43, 25-47 (2009).
  11. Gross, J. B. The complex origin of Astyanax cavefish. BMC Evolutionary Biology. 12, 105 (2012).
  12. Elipot, Y., Hinaux, H., Callebert, J., Rétaux, S. Evolutionary shift from fighting to foraging in blind cavefish through changes in the serotonin network. Current Biology. 23 (1), 1-10 (2013).
  13. Kowalko, J. E. J., et al. Loss of schooling behavior in cavefish through sight-dependent and sight-independent mechanisms. Current Biology. 23 (19), 1874-1883 (2013).
  14. Duboué, E. R. E. R., Keene, A. C. A. C., Borowsky, R. L. R. L. Evolutionary convergence on sleep loss in cavefish populations. Current Biology. 21 (8), 671-676 (2011).
  15. Chin, J. S., et al. Convergence on reduced stress behavior in the Mexican blind cavefish. Developmental Biology. , (2018).
  16. Scheer, N., Campos-Ortega, J. A. Use of the Gal4-UAS technique for targeted gene expression in the zebrafish. Mechanisms of Development. 80 (2), 153-158 (1999).
  17. Kawakami, K., Shima, A., Kawakami, N. Identification of a functional transposase of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish, and its transposition in the zebrafish germ lineage. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (21), 11403-11408 (2000).
  18. Balciunas, D., et al. Enhancer trapping in zebrafish using the Sleeping Beauty transposon. BMC Genomics. , (2004).
  19. Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome Research. 24 (1), 142-153 (2014).
  20. Kimura, Y., Hisano, Y., Kawahara, A., Higashijima, S. I. Efficient generation of knock-in transgenic zebrafish carrying reporter/driver genes by CRISPR/Cas9-mediated genome engineering. Scientific Reports. 4, (2014).
  21. Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. A Primer for Morpholino Use in Zebrafish. Zebrafish. 6 (1), 69-77 (2009).
  22. Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene “knockdown” in zebrafish. Nature Genetics. , (2000).
  23. Sander, J. D., et al. Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs. Nature Biotechnology. , (2011).
  24. Huang, P., et al. Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs. Nature Biotechnology. , (2011).
  25. Kawakami, K. Transposon tools and methods in zebrafish. Developmental Dynamics. 234 (2), 244-254 (2005).
  26. Urasaki, A., Morvan, G., Kawakami, K. Functional dissection of the Tol2 transposable element identified the minimal cis-sequence and a highly repetitive sequence in the subterminal region essential for transposition. Genetics. 174 (2), 639-649 (2006).
  27. Juntti, S. A., Hu, C. K., Fernald, R. D. Tol2-Mediated Generation of a Transgenic Haplochromine Cichlid, Astatotilapia burtoni. PLoS ONE. 8 (10), (2013).
  28. Harel, I., Valenzano, D. R., Brunet, A. Efficient genome engineering approaches for the short-lived African turquoise killifish. Nature Protocols. 11 (10), 2010-2028 (2016).
  29. Erickson, P. A., Ellis, N. A., Miller, C. T. Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks. Journal of Visualized Experiments. (111), e54055 (2016).
  30. Elipot, Y., Legendre, L., Père, S., Sohm, F., Rétaux, S. Astyanax transgenesis and husbandry: how cavefish enters the laboratory. Zebrafish. 11 (4), 291-299 (2014).
  31. Keene, A., Yoshizawa, M., McGaugh, S. . Biology and Evolution of the Mexican Cavefish. , (2015).
  32. Casane, D., Rétaux, S. Evolutionary Genetics of the Cavefish Astyanax mexicanus. Advances in Genetics. 95, 117-159 (2016).
  33. Mcgaugh, S., et al. The cavefish genome reveals candidate genes for eye loss. Nature Communications. 5, 5307 (2014).
  34. Yoshizawa, M., et al. Distinct genetic architecture underlies the emergence of sleep loss and prey-seeking behavior in the Mexican cavefish. BMC Biology. 13 (1), (2015).
  35. Ma, L., Jeffery, W. R., Essner, J. J., Kowalko, J. E. Genome editing using TALENs in blind Mexican cavefish, Astyanax mexicanus. PLoS ONE. 10 (3), (2015).
  36. Bilandzija, H., Ma, L., Parkhurst, A., Jeffery, W. A potential benefit of albinism in Astyanax cavefish: downregulation of the oca2 gene increases tyrosine and catecholamine levels as an alternative to melanin synthesis. PLoS ONE. 8 (11), e80823 (2013).
  37. Alie, A., et al. Developmental evolution of the forebrain in cavefish: from natural variations in neuropeptides to behavior. eLife. 7, e32808 (2018).
  38. Jaggard, J. B., et al. Hypocretin underlies the evolution of sleep loss in the Mexican cavefish. eLife. 7, e32637 (2018).
  39. Borowsky, R. Handling Astyanax mexicanus eggs and fry. Cold Spring Harbor Protocols. 3 (11), (2008).
  40. Varshney, G. K., Sood, R., Burgess, S. M. Understanding and Editing the Zebrafish Genome. Advances in Genetics. 92, 1-52 (2015).
  41. Wierson, W. A., et al. GeneWeld: a method for efficient targeted integration directed by short homology. BioRxiv. , (2018).
  42. Klaassen, H., Wang, Y., Adamski, K., Rohner, N., Kowalko, J. E. CRISPR mutagenesis confirms the role of oca2 in melanin pigmentation in Astyanax mexicanus. Developmental Biology. , (2018).
  43. Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (34), 13904-13909 (2013).
  44. Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: A multisite gateway-based construction Kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).
  45. Kawakami, K., et al. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Developmental Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
  46. Kowalko, J., Ma, L., Jeffery, W. Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases (TALENs). Journal of Visualized Experiments. (112), e54113 (2016).
  47. Nishino, S., Ripley, B., Overeem, S., Lammers, G. J., Mignot, E. Hypocretin (orexin) deficiency in human narcolepsy. Lancet. , (2000).
  48. Lin, L., et al. The sleep disorder canine narcolepsy is caused by a mutation in the hypocretin (orexin) receptor 2. Cell. , (1999).
  49. Park, H. C., et al. Analysis of upstream elements in the HuC promoter leads to the establishment of transgenic Zebrafish with fluorescent neurons. Developmental Biology. 227 (2), 279-293 (2000).
  50. Higashijima, S., Masino, M. A., Mandel, G., Fetcho, J. R. Imaging Neuronal Activity During Zebrafish Behavior With a Genetically Encoded Calcium Indicator. Journal of Neurophysiology. , (2003).
  51. Vladimirov, N., et al. Light-sheet functional imaging in fictively behaving zebrafish. Nature Methods. 11 (9), 883-884 (2014).
  52. Halpern, M. E., et al. Gal4/UAS transgenic tools and their application to zebrafish. Zebrafish. 5 (2), 97-110 (2008).
  53. Jaggard, J. B., Stahl, B. A., Lloyd, E., Prober, D. A., Duboue, E. R., Keene, A. C. Hypocretin underlies the evolution of sleep loss in the Mexican cavefish. bioRxiv. 7, e32637 (2018).
  54. Bedell, V. M., Westcot, S. E., Ekker, S. C. Lessons from morpholino-based screening in zebrafish. Briefings in Functional Genomics. , (2011).
  55. Robu, M. E., et al. p53 activation by knockdown technologies. PLoS Genetics. , (2007).
  56. Hisano, Y., et al. Precise in-frame integration of exogenous DNA mediated by CRISPR/Cas9 system in zebrafish. Scientific reports. 5, 8841 (2015).
  57. Prykhozhij, S., et al. Optimized knock-in of point mutations in zebrafish using CRISPR/Cas9. Nucleic Acids Res. 46 (17), (2018).
  58. Tessadori, F., et al. Effective CRISPR/Cas9-based nucleotide editing in zebrafish to model human genetic cardiovascular disorders. Disease Model Mechanisms. 11 (10), (2018).
  59. Armstrong, G., Liao, M., You, Z., Lissouba, A., Chen, B., Drapeau, P. Homology Directed Knockin of Point Mutations in the Zebrafish tardbp and fus Genes in ALS Using the CRISPR/Cas9 System. PLoS ONE. 11 (3), (2016).
  60. Friedrich, R. W., Jacobson, G. A., Zhu, P. Circuit Neuroscience in Zebrafish. Current Biology. 20 (8), (2010).
  61. Friedrich, R. W., Genoud, C., Wanner, A. A. Analyzing the structure and function of neuronal circuits in zebrafish. Frontiers in Neural Circuits. 7, (2013).
  62. Scott, E. K., et al. Targeting neural circuitry in zebrafish using GAL4 enhancer trapping. Nature Methods. 4 (4), 323-326 (2007).
  63. Asakawa, K., Kawakami, K. Targeted gene expression by the Gal4-UAS system in zebrafish. Development Growth and Differentiation. , (2008).
  64. Lloyd, E., et al. Evolutionary shift towards lateral line dependent prey capture behavior in the blind Mexican cavefish. Developmental Biology. , (2018).

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