Подражая и манипулирования поджелудочной железы ацинарной протоковой метаплазии в 3-мерной клеточной культуре

Резюме

Изоляция первичного железистый клетки, белок выражение или деятельности модуляции, культура и вниз поток приложения обильно полезны в ex vivo исследования ацинарной протоковой метаплазия (ADM), раннее событие в развитии рака поджелудочной железы.

Аннотация

Дифференциация железистый клетки протоковой клетки в течение панкреатита и в начале развития рака поджелудочной железы является ключевым процессом, который требует дальнейшего изучения. Чтобы понять механизмы регулирования ацинарной протоковой метаплазия (ADM), ex vivo 3D культуры и дифференциации клеток первичного ацинарной протоковой клетки предлагает много преимуществ по сравнению с другими системами. С техникой здесь модуляции экспрессии белков является простой и быстрый, требующих только один день, чтобы изолировать, стимулировать или вирусно заражать и начать культивирования первичной железистый клетки для изучения процесса адм. В отличие от использования матрицы базальной мембраны, посев железистый клетки кластеров в коллагена я внеклеточного матрикса, позволяет железистый клетки сохраняют самобытность ацинарной до манипуляции. Это очень важно при тестировании вклад различных компонентов для индукции адм Не только последствия цитокинов или других ectopically управляемых факторов для тестирования через эту технику, но вклад общих мутаций, увеличение белков или нокдаун экспрессии белков для тестирования через вирусные инфекции Основная железистый клетки, используя аденовирусных или лентивирусные векторы. Кроме того клетки могут быть повторно изолированы от коллагена или матрица базальной мембраны в конечной точке и проанализированы для выражения протеина.

Введение

Железистый протоковой метаплазия (ADM) — это защитный механизм течение панкреатита и ключевой процесс вождения развития рака поджелудочной железы¹ требует дальнейшего механистического понимания. В то время как воспаление индуцированной ADM реверсивные², онкогенных мутаций в крас , которые присутствуют в 90% случаев рак поджелудочной железы³, предотвратить дифференциация обратно в железистый фенотип^{4,5, 6}. Culturing и дифференциации первичных железистый клетки в протоковой клетки в культуре 3D позволяет для изучения молекулярных механизмов, регулирующих процесс ADM, который трудно изучать в естественных условиях. Такие ex vivo исследований позволяют в реальном времени визуализации ADM, его водителя и его регуляторы. Было выявлено несколько драйверов ADM процесса, а также механистического понимания по их течению сигнальных путей, или проверить с помощью здесь описал метод. К ним относятся ADM индукции, TGF-α (альфа фактор роста трансформации)-опосредованной выражение MMP-7 (матрицы металлопротеиназы-7) и активации Notch⁷, а также RANTES (регулируется по активации, нормальной клетки T выразил и выделяется; также известна как лиганд хемокиновых 5 или CCL5) и TNFα (фактора некроза опухоли альфа)-индуцированной ADM через активацию NF-κB (ядерный фактор κB)⁸. Дополнительные посредника ADM является онкогенный крас^9,10, который вызывает увеличение окислительного стресса, что улучшает процесс ADM путем увеличения выражение EGFR (рецептор к эпидермальному фактору роста) и его лигандов, EGF ( эпидермальный фактор роста) и TGF-α¹¹.

Хотя использование линий клеток рака поджелудочной железы является общим для исследования in vitro, культуры главной ячейки предлагают много преимуществ. Например, основной железистый клетки от не трансгенных мышей или мышей, укрывательство инициирующей мутации, например крас^G12D, являются наиболее подходящей моделью для изучения раннее событие ADM, потому что клетки имеют несколько и управляемой мутации, которые как известно, чтобы присутствовать в начале развития рака поджелудочной железы. Это в отличие от многих линий клеток рака поджелудочной железы, которые имеют несколько мутаций и разнообразные выражения, основанные на проход номер¹². Кроме того исследования на животных были проверены сигнальные пути, определены такими средствами. Одно предостережение использования первичных железистый клетки является, что они не могут transfected как типичные рак клеточных линий.

Метод здесь подробно методы железистый клетки изоляции, 3D культуры, которая имитирует ADM, добавляя стимуляторов или модулирующая белков через лентивирусные или аденовирусных инфекций, а также переизоляция клеток в конечной точке для дальнейшего анализа.

протокол

Все животные работы был одобрен IACUC клиники Майо.

1. Подготовка материалов, 3-мерной матрицы базы и решения

1. Cut 500 мкм и 105 мкм полипропиленовых сеток в 76 мм 76 мм квадратов. Сложите каждый квадрат пополам дважды, чтобы создать меньше сложить квадрат. Место один 500 мкм и один 105 мкм сетка квадрат в автоклавируемый мешочек.
2. Автоклав полипропиленовая сетка квадраты, а также две пары ножниц и щипцы.
3. Сделайте 100 мл 10 x Waymouth в раствор. Перемешать 1 флакон (14 g) Waymouth в порошок в 50 мл деонизированной воды (DI) и, когда распался, добавить 30 мл бикарбоната натрия 7,5% (75 г/Л). Положить окончательный объем 100 мл с помощью ди воды и фильтрации стерилизации.
   1. СМИ хранилище 10 x Waymouth на 4 ° C и используется для подготовки коллагеновые гели и 1 x Waymouth СМИ. Если преципитаты формы, отменить.
4. Сделайте 50 мл 1 x Waymouth в полный СМИ в поджелудочной железы, добавив 125 мкл ингибитора трипсина 40 мг/мл соевого, 12,5 мкл дексаметазона 4 мг/мл и 500 мкл плода бычьим сывороточным (ФБС). Стерилизуют фильтрацией и использовать в течение 48 ч.
5. Подготовка 3-мерной матрицы баз с помощью коллагена или базальной мембраны матрицы (см. таблицу материалы для информации). Когда закупорить база, установите пластину на льду, избежать пузырей и поверните пластину сразу же после дозирование объема каждой скважины для обеспечения полного охвата.
   1. Создание базы коллагена, смешивая следующие компоненты на льду в культуре ткани капюшоном: 5,5 мл типа я крысы хвост коллаген, 550 мкл 10 x Waymouth в СМИ и 366.6 мкл 0,34 M NaOH (отфильтрованные).
      Примечание: Это достаточно решение сделать коллагена баз для одной 24-а, 12-ну или 6-ну плиты. Одна пластина является достаточным для ацинарной изоляции от одного поджелудочной железы.
   2. Используйте следующие тома для пластины коллагена база: 80 мкл (8-Ну стеклянное скольжение), 200 мкл (24-ну плита), 400 мкл (12-ну Латы) или 800 мкл (6-ну плита).
   3. Для базальной мембраны матрица базы, накапайте матрица без каких-либо дополнительных компонентов. Используйте следующие тома для каждой скважины: 50 мкл (8-Ну стеклянное скольжение), 120 мкл (24-ну плита), 240 мкл (12-ну Латы) или 600 мкл (6-ну плита).
   4. Пусть баз затвердеть в течение по крайней мере 30 минут в инкубатор культуры клеток (37 ° C, 5% CO₂) прежде чем создавать второй слой матрицы с встроенный клетки на вершине этих баз (шаг 4).
6. В рамках подготовки к ацинарной изоляции Держите один стакан 600 мл, три 50 мл трубки, газобетона пару ножниц, газобетона пара щипцов и ведро льда под капотом с три лодки весят. Затем сделайте 30 мл HBSS с 300 мкл, 100 x пенициллин-стрептомицина, положив 10 мл в каждую из двух лодки весят и помня окончательного 10 мл тюбик 50 мл (для использования в шагах 1.8.2 и 2.1.4).
7. Сделать 40 мл HBSS + 5% FBS, 20 мл HBSS + 30% FBS и 5 мл коллагеназы 2 мг/мл в HBSS. Стерилизовать коллагеназы по фильтрации (0.22 мкм поры) и держать при комнатной температуре. Держите каждое из решений HBSS на льду.
8. Соберите рабочую область для рассечения поджелудочной железы, что может быть сделано на скамейке в лаборатории.
   1. Место Впитывающим вкладышем на таблице, вместе с крышкой из полистирола покрыты фольгой. Затем поместите бумажное полотенце с 4 штырями поверх фольги.
   2. Держите следующие пункты досягаемости рассечение рабочей: сжигание мешок, один набор газобетона ножницы, щипцы, спрей бутылку с 70% этанол и ведро льда (с 50 мл трубки HBSS, содержащих пенициллин стрептомицина из шага 1.6).
9. Установите центрифуге до 4 ° C и шейкер до 37 ° C.

2. железистый клетки изоляции

1. Пожертвовать мыши через CO₂ индукции и выполнять шейки матки дислокации. Сразу же вскрыть поджелудочной железы. Для того чтобы рассечь поджелудочной железы, первый pin лапы мыши крышку из полистирола, Ориент мыши, таким образом, что хвост сталкивается исследователь и спрей живота с 70% этиловом спирте.
   Примечание: мыши, используемый в результатах представитель был 12 - неделя старый не трансгенных девушки с фоном C57BL/6. Мышь выбор более подробно рассматривается в разделе обсуждения.
   1. С помощью набора из газобетона ножницы, щипцы, поднимите мех/кожа с щипцами в средней линии и используйте ножницы, чтобы сделать надрез через мех и кожу от уретры открытия в области диафрагмы/грудной клетки.
   2. Сделать дополнительные разрезы для левой и правой, таким образом, что мех/кожа разрезается прочь, чтобы создать четкое представление о брюшной полости. Затем нарезать перитонеальный накладки (посередине и справа и слева) и потяните его от органов, как это было сделано с мех/кожа.
   3. Поднимите кишечника с щипцами и положил его на левой стороне мыши, создавая пространство, чтобы увидеть поджелудочной железы, который является свет розовый цвет и прилагается к селезенке, который является темно красный овал. Текстура мягкая, губчатая отличается ткани поджелудочной железы. Вырежьте из поджелудочной железы, которая будет проходить вдоль живота и переплетаются с кишечником.
   4. Отделите хандры от поджелудочной железы. Затем поставьте поджелудочной железы в Тюбик 50 мл, содержащие 10 мл HBSS с 1 x пенициллин стрептомицином и довести это до Ламинарный шкаф.
      Примечание: Оставшиеся шаги протокола должно быть сделано используя стерильную методику в Ламинарный шкаф.
2. Залить поджелудочной железы и HBSS (с пенициллин стрептомицином) в пустой вес лодки и, с помощью щипцов, мыть поджелудочной железы, вращая его. Затем переместите поджелудочной железы с щипцами для второй весят лодка, содержащие HBSS (с пенициллин стрептомицином). Опять же мыть поджелудочной железы, закрученной.
3. Переместить поджелудочной железы в HBSS третьего (с пенициллин стрептомицином)-содержащих весят лодку и начала резки поджелудочной железы на мелкие кусочки, 5 мм или меньше. Затем налейте в пустой 50 мл трубки части поджелудочной железы и HBSS.
   1. Для этого используйте щипцы для перемещения части поджелудочной железы в жидкость, как лодки весят отклоняется. Залейте после того, как все куски больше не прилагается к лодки весят. Подобрать любые оставшиеся куски с щипцами и мыть щипцы в Тюбик 50 мл, содержащие поджелудочной железы в HBSS с пенициллина и стрептомицина.
4. Центрифуга в 931 x g на 2 мин при температуре 4 ° C, а затем удалите HBSS (и любой жир, что плавает), дозирование Выкл с 5 мл пипетки.
5. Добавьте 5 мл коллагеназы (разводят в HBSS шаге 1.7) поджелудочной железы. Обеспечить герметичные крышки, завернув Тюбик 50 мл в пластиковых парафин фильме и затем поместите его в инкубаторе встряхивания на 220 rpm для 20 минут при 37 ° C.
   Примечание: Коллагеназы пищеварение время может варьироваться, как отмечалось в ходе обсуждения. В конце инкубации должны оставаться без больших кусков ткани.
6. Чтобы остановить диссоциации, место поджелудочной железы содержащих трубки на льду и добавить 5 мл холодного HBSS + 5% FBS. Центрифуга в 931 x g на 2 мин на 4 ° C, а затем накапайте покинуть супернатанта, с помощью пипетки 5 мл.
7. Ресуспензируйте в 10 мл HBSS + 5% FBS и центрифуги в 931 x g на 2 мин при 4 ° C. Пипетки с супернатанта, с помощью пипетки 5 мл и повторить этот шаг с другой 10 мл HBSS + 5% FBS.
8. Ресуспензируйте в HBSS + 5% 5 мл FBS и, используя P1000, передачи 1 мл раствора через сетку 500 мкм в 50 мл трубки. Добавить еще 5 мл HBSS + 5% FBS через сетку с P1000 стирать любые оставшиеся клеток поджелудочной железы через сетку.
9. Положите суспензию клеток из 500 мкм сетки через сетку 105 мкм дозирования 1 мл одновременно с помощью P1000. Далее, нежно накапайте суспензию клеток в пробирку, содержащую HBSS + 30% FBS. Слой суспензию клеток образуют наверху; После центрифугирования железистый клетки утонет в форме гранул.
10. Центрифуга на 233 x g на 2 мин при 4 ° C. Удалить супернатант и Ресуспензируйте гранулы в 1 x Waymouth в полный СМИ.
    1. Если перейти непосредственно к анкеровки клеток коллагена или матрицы базальной мембраны, Ресуспензируйте в объеме 7 мл на поджелудочной железы. Если продолжить аденовирусных или лентивирусные инфекции, Ресуспензируйте в 4 мл на поджелудочной железы.

3. вирусные инфекции

1. Как один из поджелудочной железы достаточно для двух вирусных инфекций (управления и экспериментальный, например, null и cre), Сплит суспензию клеток между крышками из двух пластин, 35 мм. Использование крышки пластин позволяет инфекции в суспензии и поэтому легко движения на окончательный подложку позже.
   1. При работе с вирусом, Замочите все используемые наконечники в 10% отбеливатель для по крайней мере 15 минут.
      Примечание: Использование плиты 35 мм и объем 4 мл хорошо работает для клетки от не трансгенных мышей между 8 и 16 недель. Размер плиты и тома может потребоваться корректироваться для животных с меньшим или большим pancreata.
2. Аденовирусных инфекций, добавьте вирус (с титр по крайней мере 10⁷ ту/мл) на 1:1,000 разрежения на крышке каждого листа и вихрем (рис. 2, GFP аденовирус). Поместите пластины в инкубатор культуры клеток (37 ° C, 5% CO₂) и вихрем каждые 15 минут за 1 ч инкубации Continue для дополнительных 2 h, а затем приступить к анкеровки клеток в матрице коллагена или базальной мембраны.
3. После завершения вирусных работа в капюшоне, Замочите все компоненты в капот с 10% отбеливатель для по крайней мере 15 минут и затем тщательно чистить отбеливателя с использованием 70% этиловом спирте.

4. анкеровки клеток коллагена или базальной мембраны матрицы

1. Сделать гель коллагена на льду, объединяя 7 мл тип I крысы хвост коллагена (3,3 мг/мл), 700 мкл 10 x Waymouth в СМИ и 466.6 мкл 0,34 M NaOH.
2. Принимая равных объемах подвеска гель и клеток коллагена, аккуратно перемешайте. Если добавление стимул или ингибитор, совместить это с суспензию коллаген клеток. Пластина одной скважины в то время (пластины из шага 1.5.3); сохраняя пластину на льду, вихрем равномерно распределить слой коллагена клетки.
   1. В каждом хорошо, накапайте следующие тома коллагена клеточной суспензии: 200 мкл (8-Ну стеклянное скольжение), 500 мкл (24-ну плита), 1000 мкл (12-ну Латы) или 2000 мкл (6-ну плита). Обратите внимание, что ADM индуцируется через стимуляции с TGF-α (50 нг/мл) на рисунке 2.
3. Для анкеровки клеток в матрице базальной мембраны смесь из одной части базальной мембраны матрица с двух частей суспензию клеток. Как и в случае с коллагеном, держите подвеска ячейку матрицы, а также пластину на льду. Накапайте один хорошо в то время, используя же томов, отметили в 4.2.1 и вихрем для равномерного распределения.
4. Место пластину в инкубатор культуры клеток (37 ° C, 5% CO₂) за 30 мин, чтобы затвердеть и затем добавить 1 x полная Waymouth в СМИ с любой стимул или ингибитора (Рисунок 2 использует TGF-α в 50 нг/мл). На следующий день и затем каждый день измените СМИ (с стимул или ингибитора). В зависимости от стимула ADM можно наблюдать между 3 и 5 день.

5. уборка клетки из коллагена или матрица базальной мембраны

1. Соберите следующие материалы, необходимые для уборки клеток из коллагена: коллагеназа 1 мг/мл по 30 мл разбавленной в HBSS, 40 мл холодного HBSS, 31 мл холодного PBS, две лопатки, две трубы 50 мл и льда. Отрегулируйте количество шпатели, труб и количество решений, если сравнение более двух условий культуры (где каждое условие — ½ плиты). Установите центрифуге до 4 ° C и установите пожимая инкубатора 37 ° C.
2. Удалите средства массовой информации и использовать шпатели для удаления коллагена диски с встроенных клеток. Для каждого условия, поставить диски в отдельном пустой Тюбик 50 мл.
3. Добавьте 10 мл коллагеназы 1 мг/мл в HBSS каждый Тюбик 50 мл. Оберните Трубы пластиковые парафин пленкой и поставить в 37 ° C, пожимая инкубатор на 225 об/мин до 45 минут. Следить за пищеварение и удалить трубы, когда есть не более заметными коллагена.
4. Центрифуга на 233 x g при 4 ° C на 2 мин с минимальным замедления. Возьмите супернатант и Ресуспензируйте в 5 мл раствора коллагеназы на трубу. Дайджест в 37 ° C, пожимая инкубатор на 225 об/мин, 10 минут или до тех пор, пока есть без видимых коллагена.
5. Остановите пищеварение, добавив 5 мл холодного HBSS и впоследствии центрифугирования в 233 x g на 2 мин при температуре 4 ° C с минимальным замедления.
   1. Ресуспензируйте в 15 мл холодного HBSS и снова центрифуги на 233 x g на 2 мин при температуре 4 ° C с минимальным замедления. Повторите эти действия.
6. Ресуспензируйте гранулы в 1 мл PBS и перейти к 1,5 мл. Центрифуга в ведро качели на 233 x g на 2 мин при температуре 4 ° C с минимальным замедления. Удалите супернатант и оснастки замораживание в жидком азоте или сухого льда.
   Примечание: Пелле клетки могут храниться на-70 ° C или немедленно использовать в приложениях, вниз по течению.
7. Урожая базальной мембраны матрица встроенный клеток, накапайте СМИ от каждой скважины в 50 мл трубки на льду. Затем добавить решение восстановления матрицы базальной мембраны в каждой скважине и очистите смесь клеток гель в Тюбик 50 мл.
   Примечание: Объем базальной мембраны Матрица решения восстановления для добавления к каждой скважины является следующим: 150 мкл (8-Ну стеклянное скольжение), 420 мкл (24-ну плита), 845 мкл (12-ну плита) и 2000 мкл (6-ну плита).
8. Промывайте хорошо дважды с базальной мембраны матрица восстановления решения, добавление полоскания Тюбик 50 мл.
   Примечание: Объем базальной мембраны Матрица решения восстановления для каждого полоскания является следующим: 150 мкл (8-Ну стеклянное скольжение), 420 мкл (24-ну плита), 845 мкл (12-ну плита) и 2000 мкл (6-ну плита).
9. Оставьте трубки на льду за 1 ч или до базальной мембраны матрица растворяется и следовать с центрифугированием при 300 x g 5 мин при 4 ° C. Удалить супернатант и Ресуспензируйте гранулы в 1 мл холодного PBS (может передавать 1,5 мл, если ячейка Пелле).
10. Центрифуга на 3500 x g 3 мин при 4 ° C. Удалить супернатант и либо оснастки заморозить Пелле ячейки или добавить буфера lysis и непосредственно перейти к течению приложений.

Результаты

Завершение протокола здесь происходит в течение одного дня и после стимуляции, ADM рассматривается в 3-5 дней. Рисунок 1 иллюстрирует последовательность метода, которой выполнены шаги 1-4 в первый день. Это включает в себя подготовку, железистый изоляции, в...

Обсуждение

Относительно короткий промежуток времени для изоляции, инфекции и покрытие первичных железистый клетки является преимуществом этого метода. В отличие от культивирования железистый клетки от экспланта нарост требует мало практический времени, но она занимает семь дней для нарост жел?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
37 °C shaking incubator	Thermo Scientific	SHKE4000-7
5% CO2, 37 °C Incubator	NUAIRE	NU-5500
50 mL tubes	Falcon	352070
Absorbent pad, 20" x 24"	Fisherbrand	1420662
Adenovirus, Ad-GFP	Vector Biolabs	1060
Aluminum foil	Fisherbrand	01-213-101
BD Precision Glide Needle 21 G x 1/2	Fisher Scientific	305167	Use as pins for dissection
Beaker, 600 mL	Fisherbrand	FB-101-600
Bleach, 8.25%	Clorox	31009
Cell Recovery Solution	Corning	354253	Referred to as 'basement membrane matrix recovery solution' in the manuscript.
Centrifuge	Beckman Coulter	Allegra X-15R Centrifuge
Collagenase Type I, Clostridium histolyticum	Sigma	C0130-1G	Create a 100 mg/mL solution by dissolving powder in sterile molecular biology grade water. When thawing one aliquot, dilute to 10 mg/ml, filter sterilize and place 1 ml aliquots at -20 °C.
Dexamethasone	Sigma	D1756	Create a 4 mg/mL solution by dissolving powder in methanol, aliquoting and storing at -20 °C.
Ethanol, 200 proof	Decon Laboratories	2701
Fetal Bovine Serum	Sigma	F0926-100mL
Forceps	Fine Science Tools	11002-12
Forceps	Fine Science Tools	91127-12
Glass slide, 8-well	Lab-Tek	177402
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), No calcium, No magnesium, No phenol red	Fisher Scientific	SH3048801
Ice bucket, rectangular	Fisher Scientific	07-210-103
Instant Sealing Sterilization Pouch	Fisherbrand	01-812-51
LAB GUARD specimen bags (for mouse after dissection)	Minigrip	SBL2X69S
Lentiviral Packaging Mix, Virapower	Invitrogen	44-2050
Matrigel	Corning	356234	Referred to as 'basement membrane matrix' in the manuscript.
Parafilm	Bemis	PM992	Referred to as 'plastic paraffin film' in the manuscript.
PBS	Fisher Scientific	SH30028.02
Penicillin-Streptomycin	ThermoFisher Scientific	15140122
Pipet tips, 10 µL	USA Scientific	1110-3700
Pipet tips, 1,000 µL	Olympus Plastics	24-165RL
Pipet tips, 200 µL	USA Scientific	1111-1700
Pipet-Aid	Drummond
PIPETMAN Classic P10, 1-10 μL	Gilson	F144802
PIPETMAN Classic P1000, 200-1000 μL	Gilson	F123602
PIPETMAN Classic P20, 2-20 μL	Gilson	F123600
PIPETMAN Classic P200, 20-200 μL	Gilson	F123601
Pipettes, 10 mL	Falcon	357551
Pipettes, 25 mL	Falcon	357525
Pipettes, 5 mL	Falcon	357543
Plate, 12-well	Corning Costar	3513
Plate, 24-well plate	Corning Costar	3524
Plate, 35 mm	Falcon	353001
Plate, 6-well	Falcon	353046
Polybrene	EMD Millipore	TR-1003-G	Create a 40 mg/mL solution by dissolving powder in sterile molecular biology grade water, aliquoting and storing at -20 °C.
Polypropylene Mesh, 105 µm	Spectrum Labs	146436
Polypropylene Mesh, 500 µm	Spectrum Labs	146418
Scissors	Fine Science Tools	14568-12
Scissors	Fine Science Tools	91460-11
Sodium Bicarbonate (Fine White Powder)	Fisher Scientific	BP328-500
Sodium Hydroxide	Fisher Scientific	S318-500
Soybean Trypsin Inhibitor 8	Gibco	17075029
Spatula	Fisherbrand	21-401-10
Steriflip 50 mL, 0.22 μm filters	Millipore	SCGP00525
TGF-α	R&D Systems	239-A-100
Type I Rat Tail Collagen	Corning	354236
Waymouth MB 752/1 Medium (powder)	Sigma	W1625-10X1L
Weigh boat, hexagonal, medium	Fisherbrand	02-202-101