Che imita e manipolare Metaplasia acinoso--Ductal pancreatico nella coltura cellulare 3-dimensionale

Riepilogo

Isolamento primario delle cellule acinose, modulazione di espressione o attività di proteina, cultura e applicazioni a valle sono abbondantemente utili nell'ex vivo uno studio del metaplasia acinoso--duttale (ADM), un evento iniziale nello sviluppo del cancro del pancreas.

Abstract

La differenziazione delle cellule acinose a cellule duttali durante la pancreatite e l'inizio dello sviluppo del cancro del pancreas è un processo chiave che richiede ulteriore studio. Per comprendere i meccanismi di regolazione metaplasia acinoso--duttale (ADM), ex vivo di cultura 3D e differenziazione delle cellule acinose primarie a cellule duttali offre molti vantaggi rispetto ad altri sistemi. Con la tecnica qui, modulazione dell'espressione della proteina è semplice e veloce, che richiede un solo giorno per isolare, stimolare o viralmente infettare e iniziare la coltura delle cellule acinose primarie per studiare il processo ADM. A differenza dell'utilizzo di matrice della membrana basale, la semina dei mazzi delle cellule acinose in collagene extracellulare, permette che le cellule acinose mantengono la loro identità acinose prima manipolazione. Ciò è vitale quando si verifica il contributo delle varie componenti all'induzione di ADM. Non solo sono gli effetti delle citochine o altri fattori ectopically amministrati testabile attraverso questa tecnica, ma il contributo di comuni mutazioni, proteina aumentata espressione o atterramento di espressione della proteina è verificabile tramite l'infezione virale di cellule acinose primarie, utilizzando vettori adenoviral o lentivirali. Inoltre, le cellule possono essere ri-isolate da collagene o matrice della membrana basale all'endpoint e analizzati per l'espressione della proteina.

Introduzione

Acinoso-ductal metaplasia (ADM) è un meccanismo protettivo durante un processo chiave Guida di sviluppo di cancro del pancreas¹ che richiede ulteriore visione meccanicistica e pancreatite. Mentre l'infiammazione indotta ADM è reversibile², oncogeniche mutazioni di KRAS , che sono presenti nel 90% dei casi di cancro del pancreas³, impedire differenziazione torna a un fenotipo acinose^{4,5, 6}. Culturing e differenziazione di cellule acinose primarie in cellule duttali in 3D cultura permette per lo studio dei meccanismi molecolari che regolano il processo ADM, che è difficile da studiare in vivo. Tali ex vivo studi abilitare la visualizzazione in tempo reale di ADM, i suoi piloti e suoi regolatori. Sono stati identificati diversi piloti del processo di ADM, nonché informazioni sulle loro vie di segnalazione a valle, o verificato utilizzando il qui descritto metodo. Questi includono l'induzione di ADM da TGF-α (alfa di fattore di crescita trasformante)-mediata espressione di MMP-7 (matrix metalloproteinase-7) e l'attivazione della tacca⁷, così come RANTES (regolato sull'attivazione, la cellula T normale espressa e secreta; anche noto come ligando chemochina 5 o CCL5) e TNFα (fattore di necrosi tumorale alfa)-indotta ADM attraverso l'attivazione di NF-KB (nuclear factor-κB)⁸. Un ulteriore mediatore di ADM è oncogene KRas^9,10, che provoca un aumento dello stress ossidativo che migliora il processo ADM attraverso l'aumentata espressione di EGFR (recettore del fattore di crescita epidermico) e suoi ligandi, EGF ( fattore di crescita epidermico) e TGF-α¹¹.

Mentre l'uso di linee cellulari di cancro del pancreas è comune per gli studi in vitro, colture cellulari primarie offrono molti vantaggi. Per esempio, le cellule acinose primarie da topi non transgenica o topi che harboring le mutazioni d'iniziale, ad esempio Kras^G12D, sono il modello più appropriato per studiare l'evento iniziale di ADM perché le cellule hanno mutazioni pochi e controllate, che sono noti per essere presente all'inizio dello sviluppo di cancro del pancreas. Questo è in contrasto con molte linee cellulari di cancro del pancreas che hanno mutazioni multiple e varie espressione basata sul passaggio numero¹². Inoltre, le vie di segnalazione identificate da tali mezzi sono state verificate da studi sugli animali. Un avvertimento di usando le cellule acinose primarie è che essi non possono essere transfected come linee cellulari del cancro tipico possono.

Il metodo qui in dettaglio le tecniche di isolamento di cellule acinose, cultura 3D che imita ADM aggiungendo stimolanti o modulazione dell'espressione di proteine tramite infezione adenoviral o lentivirale, come pure re-isolamento delle cellule presso l'endpoint per ulteriori analisi.

Protocollo

Tutto il lavoro animale è stato approvato dalla Mayo Clinic IACUC.

1. preparazione dei materiali, soluzioni e basi di matrice 3-dimensionale

1. Tagliare 500 µm e 105 µm in polipropilene mesh in 76 mm da 76 millimetri quadrati. Piegare ogni quadrato a metà due volte per creare un quadrato più piccolo piegato. Posto uno da 500 µm e un 105 µm maglia piazza in un sacchetto autoclavabile.
2. La rete in polipropilene autoclave piazze, come pure due paia di forbici e pinze.
3. Portare a 100 mL di soluzione di Waymouth: 10x. Mescolare 1 flacone (14 g) di polvere di Waymouth in 50 mL di acqua deionizzata (DI) e, quando sciolto, aggiungere 30 mL di bicarbonato di sodio 7,5% (75 g/L). Portare il volume finale a 100 mL, utilizzo DI acqua e filtro sterilizzare.
   1. Media di negozio 10 x Waymouth a 4 ° C e utilizzare per preparare il gel del collagene e media di 1 x Waymouth. Quando precipita forma, scartare.
4. Fai 50 mL di 1x multimediale completo di Waymouth al pancreas aggiungendo 125 µ l di inibitore della tripsina della soia 40 mg/mL, 12,5 µ l di desametasone 4 mg/mL e 500 µ l di siero bovino fetale (FBS). Sterilizzare mediante filtrazione e utilizzare entro 48h.
5. Preparare le basi di matrice 3-dimensionale utilizzando la matrice di collagene o della membrana dello scantinato (Vedi tabella materiali per informazioni sul prodotto). Quando si pipetta della base, posizionare la piastra sul ghiaccio, evitare bolle e ruotare la piastra immediatamente dopo il volume di ciascun pozzetto per garantire una copertura completa di pipettaggio.
   1. Creare basi di collagene mescolando i seguenti componenti sul ghiaccio in una cappa di coltura del tessuto: 5,5 mL di tipo io la spia di coda collagene, 550 µ l di 10 x Media di Waymouth e 366.6 µ l di NaOH M 0,34 (filtrato).
      Nota: Si tratta di una soluzione abbastanza per fare basi di collagene per una piastra 24 pozzetti, 12-pozzetti o 6 pozzetti. Una piastra è sufficiente per acinosa isolamento da un pancreas.
   2. Utilizzare i seguenti volumi per piastra della base di collagene: 80 µ l (8 pozzetti vetrino), 200 µ l (piastra a 24 pozzetti), 400 µ l (12-pozzetti) o 800 µ l (piastra a 6 pozzetti).
   3. Per la membrana dello scantinato matrice basi, dispensare la matrice senza componenti aggiuntivi. Utilizzare i seguenti volumi per ciascun pozzetto: 50 µ l (8 pozzetti vetrino), 120 µ l (piastra a 24 pozzetti), 240 µ l (12-pozzetti) o 600 µ l (piastra a 6 pozzetti).
   4. Lasciate che le basi solidificare per almeno 30 min in un'incubatrice di coltura cellulare (37 ° C, 5% CO₂) prima di creare un secondo strato di matrice con celle incorporate nella parte superiore di queste basi (passaggio 4).
6. In preparazione per l'isolamento acinosa tenere un becher da 600 mL, tre provette da 50 mL, un paio in autoclave di forbici, un paio in autoclave di pinze e un secchio di ghiaccio sotto il cofano con tre barche di pesare. Quindi, apportare 30 mL di HBSS con 300 µ l di 100 x penicillina-streptomicina, mettere 10 mL in ciascuna delle due barche di pesare e mantenendo il livello finale di 10 mL in una provetta da 50 mL (per l'utilizzo nei passaggi 1.8.2 e 2.1.4).
7. Fare 40 mL di HBSS + 5% FBS, 20 mL di HBSS + 30% FBS e 5 mL di collagenasi di 2 mg/mL in HBSS. Sterilizzare la collagenasi di filtrazione (0,22 µm poro) e conservare a temperatura ambiente. Mantenere ciascuna delle soluzioni HBSS sul ghiaccio.
8. Assemblare un workspace per dissezione del pancreas, che può essere fatto su un banco di laboratorio.
   1. Posto un tampone assorbente sul tavolo, insieme a un coperchio in polistirolo rivestito in lamina. Quindi posizionare un asciugamano di carta con 4 pin sulla parte superiore della lamina.
   2. Tenere i seguenti elementi alla portata dell'area di lavoro di dissezione: un sacchetto di incenerimento, un set di pinze e forbici in autoclave, un flacone spray con etanolo al 70% e un secchio di ghiaccio (con il tubo 50 mL HBSS contenente penicillina-streptomicina dal punto 1.6).
9. Impostare una centrifuga a 4 ° C e un agitatore a 37 ° C.

2. acinoso cellula isolamento

1. Sacrificare il mouse tramite induzione di CO₂ ed eseguire dislocazione cervicale. Scomporre immediatamente il pancreas. Per sezionare il pancreas, il primo pin le zampe del mouse al coperchio in polistirolo, orientare il mouse tale che la coda sia rivolta verso il ricercatore e spruzzare l'addome con etanolo al 70%.
   Nota: il mouse utilizzato nei risultati rappresentativi era una femmina non transgenica 12 - settimana-vecchia con sfondo C57BL/6. Selezione del mouse è ulteriormente discusso nella sezione discussione.
   1. Utilizzando un set di pinze e forbici in autoclave, sollevare la pelliccia/pelle con il forcipe al midline e utilizzare le forbici per fare un'incisione attraverso la pelliccia e pelle dall'apertura uretra per l'area di diaframma/cassa toracica.
   2. Fare ulteriori incisioni a sinistra e a destra, in modo che la pelliccia/pelle è tagliata via per creare una visione chiara della cavità addominale. Tagliate la fodera peritoneale (basso al centro e a destra e a sinistra), quindi estrarla dagli organi, come è stato fatto con la pelliccia/pelle.
   3. Sollevare l'intestino con il forcipe e metterlo sul lato sinistro del mouse creando spazio per vedere il pancreas, che è luce rosa nel colore e collegato alla milza, che è un ovale rosso scuro. Il tessuto pancreatico si distingue per la sua texture morbida e spugnosa. Tagliare il pancreas che corrono lungo lo stomaco e si intrecciano con l'intestino.
   4. Separare la milza da parte del pancreas. Quindi, mettere il pancreas in un tubo da 50 mL contenente 10 mL di HBSS con 1 x penicillina-streptomicina e portare questo alla cappa a flusso laminare.
      Nota: I passaggi rimanenti del protocollo dovrebbero essere fatto utilizzando una tecnica sterile in una cappa a flusso laminare.
2. Versare il pancreas e HBSS (con penicillina-streptomicina) in un vuoto pesare barca e, usando il forcipe, lavare il pancreas agitando esso. Quindi, spostare il pancreas con il forcipe per un secondo pesare barca contenente HBSS (con penicillina-streptomicina). Ancora una volta, è possibile lavare il pancreas agitando.
3. Spostare il pancreas il terzo HBSS (con penicillina-streptomicina)-contenente pesare in barca e iniziare a tagliare il pancreas a pezzetti di 5 mm o meno. Successivamente, versare i pezzi di pancreas e HBSS in una provetta vuota 50ml.
   1. Per effettuare questa operazione, utilizzare le pinze per spostare i pezzi di pancreas nel liquido, come la barca di pesare è essere capovolto. Versare una volta che tutti i pezzi non sono più attaccati alla barca di pesare. Pick up qualsiasi pezzi rimanenti con il forcipe e lavare il forcipe nel tubo 50 mL contenente il pancreas in HBSS con penicillina-streptomicina.
4. Centrifugare a 931 x g per 2 min a 4 ° C e quindi rimuovere l'HBSS (e tutto il grasso che è mobile) pipettando fuori con una pipetta da 5 mL.
5. Aggiungere 5 mL di collagenasi (diluito in HBSS nel passaggio 1.7) al pancreas. Garantire un coperchio sigillato avvolgendo il tubo da 50 mL in pellicola di plastica paraffina e poi metterlo in un incubatore agitazione a 220 rpm per 20 min a 37 ° C.
   Nota: Il tempo di digestione della collagenosi può variare, come indicato nella discussione. Al termine dell'incubazione, non dovrebbero rimanere grossi pezzi di tessuto.
6. Per interrompere la dissociazione, collocare la provetta contenente pancreas sul ghiaccio e aggiungere 5 mL di freddo HBSS + 5% FBS. Centrifugare a 931 x g per 2 min a 4 ° C e quindi dispensare il sovranatante utilizzando una pipetta da 5 mL.
7. Risospendere in 10 mL di HBSS + 5% di FBS e centrifugare a 931 x g per 2 min a 4 ° C. Dispensare fuori il surnatante con una pipetta da 5 mL e ripetere questo passaggio con un altro 10 mL di HBSS + 5% FBS.
8. Risospendere in 5 mL di HBSS + 5% FBS e, usando un P1000, trasferire 1 mL alla volta attraverso una maglia di 500 µm in una provetta da 50 mL. Aggiungere un ulteriore 5 mL di HBSS + 5% FBS attraverso le maglie con un P1000 per lavare qualsiasi restanti cellule pancreatiche attraverso la maglia.
9. Mettere la sospensione cellulare fra le maglie di 500 µm attraverso la maglia di 105 µm di pipettaggio 1ml alla volta utilizzando un P1000. Avanti, delicatamente dispensare la sospensione cellulare in una provetta contenente HBSS + 30% FBS. Uno strato di sospensione cellulare si forma nella parte superiore; Dopo centrifugazione, le cellule acinose affonderà per formare una pallina.
10. Centrifuga a 233 x g per 2 min a 4 ° C. Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet in 1 x multimediale completo di Waymouth.
    1. Se procedere direttamente alla infissione delle cellule nel collagene o matrice della membrana basale, risospendere in un volume di 7 mL per pancreas. Se procedendo all'infezione adenoviral o lentivirale, risospendere in 4 mL al pancreas.

3. virale infezione

1. Come un pancreas è sufficiente per due infezioni virali (controllo e sperimentale, per esempio, null e cre), dividere la sospensione cellulare tra i coperchi delle due piastre di 35 mm. Utilizzando il coperchio delle piastre consente per l'infezione in sospensione e quindi facilità di movimento sul substrato finale più tardi.
   1. Quando si lavora con il virus, è possibile immergere tutti i puntali usati in candeggina al 10% per almeno 15 minuti.
      Nota: L'utilizzo delle piastre 35mm e il volume di 4ml funziona bene per le cellule dai topi non transgenici tra 8 e 16 settimane. La dimensione del piatto e il volume potrebbe essere necessario essere regolato per gli animali con maggiore o minore pancreata.
2. Per l'infezione adenoviral, aggiungere il virus (con un titolo di almeno 10⁷ TU/mL) ad una diluizione di 1:1,000 al coperchio di ogni piatto e ricciolo (Figura 2, l'adenovirus GFP). Posizionare le piastre in un'incubatrice di coltura cellulare (37 ° C, 5% CO₂) e agitare ogni 15 minuti per 1 h. incubazione continua per altre 2 ore e poi procedere per infissione delle cellule nella matrice di collagene o della membrana dello scantinato.
3. Dopo aver completato il lavoro virale nella cappa, immergere tutti i componenti nella cappa con candeggina al 10% per almeno 15 minuti e successivamente pulire a fondo la candeggina con etanolo al 70%.

4. infissione delle cellule nel collagene o matrice della membrana basale

1. Marca gel di collagene su ghiaccio combinando 7ml tipo il collagene di coda di ratto (3,3 mg/mL), 700 µ l di 10 x supporti di Waymouth e 466.6 µ l di 0,34 M NaOH.
2. Assunzione di volumi uguali di sospensione di gel e delle cellule di collagene, mescolare delicatamente. Se l'aggiunta di uno stimolo o inibitore, combinare questo con la sospensione di collagene-cellulare. Piastra uno bene alla volta (piastre dal punto 1.5.3); tenendo la piastra sul ghiaccio, agitare per distribuire uniformemente lo strato di collagene-cella.
   1. In ciascun pozzetto, dispensare i seguenti volumi di sospensione collagene-cellulare: 200 µ l (8 pozzetti vetrino), 500 µ l (piastra a 24 pozzetti), 1000 µ l (12-pozzetti) o 2000 µ l (piastra a 6 pozzetti). Si noti che ADM è indotto tramite stimolazione con TGF-α (50 ng/mL) nella Figura 2.
3. Per infissione delle cellule nella matrice della membrana basale, mescolare matrice della membrana basale di una sola parte con due parti sospensione cellulare. Come con collagene, mantenere la sospensione di cella della matrice, così come la piastra sul ghiaccio. Dispensare uno bene alla volta utilizzando gli stessi volumi notati in 4.2.1 e ricciolo per distribuzione uniforme.
4. Posizionare la piastra in un'incubatrice di coltura cellulare (37 ° C, 5% CO₂) per 30 min per solidificare e quindi aggiungere 1 x il supporto completo di Waymouth con qualsiasi stimolo o inibitore (Figure 2 usi TGF-α a 50 ng/mL). Modificare i media (con stimolo o inibitore) il giorno successivo e quindi ogni altro giorno. A seconda dello stimolo, ADM può essere osservata tra 3 e giorno 5.

5. raccolta delle cellule da collagene o matrice della membrana basale

1. Raccogliere i seguenti materiali necessari per la raccolta delle cellule dal collagene: 30 mL di collagenasi di 1 mg/mL diluito in HBSS, 40 mL di freddo HBSS, 31 mL di PBS freddo, due spatole, due provette da 50 mL e ghiaccio. Se confrontare più di due condizioni di coltura (dove ogni condizione è ½ di una piastra), regolare il numero di spatole, tubi e quantità di soluzioni. Impostare la centrifuga a 4 ° C e impostare l'agitazione incubatore a 37 ° C.
2. Rimuovere il supporto e utilizzare spatole per rimuovere i dischi di collagene con cellule incorporate. Per ogni condizione, mettere i dischi in un separato, svuotare il tubo da 50 mL.
3. Aggiungere 10 mL di collagenasi di 1 mg/mL in HBSS per ogni provetta da 50 mL. Avvolgere i tubi con pellicola di plastica paraffina e mettere in un 37 ° C in agitazione incubatore a 225 giri/min fino a 45 minuti. Monitorare la digestione e rimuovere tubi quando c'è il collagene non è più visibile.
4. Centrifugare a 233 x g a 4 ° C per 2 min con minimo rallentamento. Decollare il supernatante e risospendere in 5 mL di soluzione della collagenosi per tubo. Digerire in un 37 ° C in agitazione incubatore a 225 giri/min per 10 minuti o fino a quando non c'è nessun collagene visibili.
5. Interrompere la digestione aggiungendo 5 mL di HBSS freddo e successivamente centrifugazione a 233 x g per 2 min a 4 ° C con minimo rallentamento.
   1. Risospendere in 15 mL di HBSS freddo e centrifugare nuovamente a 233 x g per 2 min a 4 ° C con minimo rallentamento. Ripetere l'operazione.
6. Risospendere il pellet in 1 mL di PBS e spostare in provetta da 1,5 mL. Centrifugare in un secchio di swing a 233 x g per 2 min a 4 ° C con minimo rallentamento. Rimuovere il surnatante e snap-congelamento in azoto liquido o il ghiaccio secco.
   Nota: Il pellet cellulare può essere conservato a-70 ° C o utilizzato immediatamente nelle applicazioni a valle.
7. Per la raccolta della membrana dello scantinato incorporato matrice celle, media di dispensare da ogni pozzetto in una provetta da 50 mL su ghiaccio. Quindi, aggiungere la soluzione di recupero di matrice della membrana dello scantinato in ciascun pozzetto e raschiare la miscela di gel di cella nel tubo 50 mL.
   Nota: Il volume di soluzione di recupero di matrice della membrana dello scantinato per aggiungere a ciascun pozzetto è come segue: 150 µ l (8 pozzetti vetrino), 420 µ l (piastra a 24 pozzetti), 845 µ l (12-pozzetti) e 2.000 µ l (piastra a 6 pozzetti).
8. Sciacquare ogni ben due volte con la soluzione di recupero della matrice della membrana dello scantinato, aggiungendo i risciacqui al tubo 50 mL.
   Nota: Il volume di soluzione di recupero di matrice della membrana dello scantinato per ogni risciacquo è come segue: 150 µ l (8 pozzetti vetrino), 420 µ l (piastra a 24 pozzetti), 845 µ l (12-pozzetti) e 2.000 µ l (piastra a 6 pozzetti).
9. Lasciare il tubo sul ghiaccio per 1 h o fino a quando la matrice della membrana basale si dissolve e seguire con centrifugazione a 300 x g per 5 min a 4 ° C. Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet in 1 mL di PBS freddo (può trasferire a provetta da 1,5 mL volendo pellet cellulare).
10. Centrifuga a 3.500 x g per 3 min a 4 ° C. Rimuovere il supernatante e uno snap congelare il pellet cellulare o aggiungere buffer di lisi e procedere direttamente alle applicazioni a valle.

Risultati

Completamento del protocollo nel presente documento si verifica entro un giorno e dopo stimolazione, ADM è visto in 3-5 giorni. Figura 1 illustra la sequenza del metodo, per cui i passaggi da 1 a 4 sono stati completati il primo giorno. Questo include la preparazione, isolamento acinosa, infezione virale e infissione in collagene o matrice della membrana basale. Mentre la matrice della membrana basale induce ADM, cellule acinose all'interno di collagene ho b...

Discussione

La relativamente breve lasso di tempo per isolamento, infezione e placcatura primario delle cellule acinose è un vantaggio di questo metodo. Al contrario, coltura delle cellule acinose da una conseguenza di espianto richiede poco tempo hands-on, ma sono necessari sette giorni per la conseguenza di cellule acinose¹³. Protocollo alternativo per isolamento acinose¹⁴ note un metodo molto breve per l'ottenimento di cellule acinose; Tuttavia, l'EGF è un componente essenziale ne...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
37 °C shaking incubator	Thermo Scientific	SHKE4000-7
5% CO2, 37 °C Incubator	NUAIRE	NU-5500
50 mL tubes	Falcon	352070
Absorbent pad, 20" x 24"	Fisherbrand	1420662
Adenovirus, Ad-GFP	Vector Biolabs	1060
Aluminum foil	Fisherbrand	01-213-101
BD Precision Glide Needle 21 G x 1/2	Fisher Scientific	305167	Use as pins for dissection
Beaker, 600 mL	Fisherbrand	FB-101-600
Bleach, 8.25%	Clorox	31009
Cell Recovery Solution	Corning	354253	Referred to as 'basement membrane matrix recovery solution' in the manuscript.
Centrifuge	Beckman Coulter	Allegra X-15R Centrifuge
Collagenase Type I, Clostridium histolyticum	Sigma	C0130-1G	Create a 100 mg/mL solution by dissolving powder in sterile molecular biology grade water. When thawing one aliquot, dilute to 10 mg/ml, filter sterilize and place 1 ml aliquots at -20 °C.
Dexamethasone	Sigma	D1756	Create a 4 mg/mL solution by dissolving powder in methanol, aliquoting and storing at -20 °C.
Ethanol, 200 proof	Decon Laboratories	2701
Fetal Bovine Serum	Sigma	F0926-100mL
Forceps	Fine Science Tools	11002-12
Forceps	Fine Science Tools	91127-12
Glass slide, 8-well	Lab-Tek	177402
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), No calcium, No magnesium, No phenol red	Fisher Scientific	SH3048801
Ice bucket, rectangular	Fisher Scientific	07-210-103
Instant Sealing Sterilization Pouch	Fisherbrand	01-812-51
LAB GUARD specimen bags (for mouse after dissection)	Minigrip	SBL2X69S
Lentiviral Packaging Mix, Virapower	Invitrogen	44-2050
Matrigel	Corning	356234	Referred to as 'basement membrane matrix' in the manuscript.
Parafilm	Bemis	PM992	Referred to as 'plastic paraffin film' in the manuscript.
PBS	Fisher Scientific	SH30028.02
Penicillin-Streptomycin	ThermoFisher Scientific	15140122
Pipet tips, 10 µL	USA Scientific	1110-3700
Pipet tips, 1,000 µL	Olympus Plastics	24-165RL
Pipet tips, 200 µL	USA Scientific	1111-1700
Pipet-Aid	Drummond
PIPETMAN Classic P10, 1-10 μL	Gilson	F144802
PIPETMAN Classic P1000, 200-1000 μL	Gilson	F123602
PIPETMAN Classic P20, 2-20 μL	Gilson	F123600
PIPETMAN Classic P200, 20-200 μL	Gilson	F123601
Pipettes, 10 mL	Falcon	357551
Pipettes, 25 mL	Falcon	357525
Pipettes, 5 mL	Falcon	357543
Plate, 12-well	Corning Costar	3513
Plate, 24-well plate	Corning Costar	3524
Plate, 35 mm	Falcon	353001
Plate, 6-well	Falcon	353046
Polybrene	EMD Millipore	TR-1003-G	Create a 40 mg/mL solution by dissolving powder in sterile molecular biology grade water, aliquoting and storing at -20 °C.
Polypropylene Mesh, 105 µm	Spectrum Labs	146436
Polypropylene Mesh, 500 µm	Spectrum Labs	146418
Scissors	Fine Science Tools	14568-12
Scissors	Fine Science Tools	91460-11
Sodium Bicarbonate (Fine White Powder)	Fisher Scientific	BP328-500
Sodium Hydroxide	Fisher Scientific	S318-500
Soybean Trypsin Inhibitor 8	Gibco	17075029
Spatula	Fisherbrand	21-401-10
Steriflip 50 mL, 0.22 μm filters	Millipore	SCGP00525
TGF-α	R&D Systems	239-A-100
Type I Rat Tail Collagen	Corning	354236
Waymouth MB 752/1 Medium (powder)	Sigma	W1625-10X1L
Weigh boat, hexagonal, medium	Fisherbrand	02-202-101