АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол определяет экспериментальной процедуры характеризовать геном-изменения в уровнях столб-поступательные изменения гистона (ПТМ), возникающих в связи с гиперэкспрессия белков, связанные с ALS и болезни Паркинсона в Saccharomyces cerevisiae модели. После разъединения SDS-PAGE отдельные гистона PTM уровни концентрации обнаружены с модификации специфические антитела через западный blotting.

Аннотация

Нейродегенеративные заболевания, такие как боковой амиотрофический склероз (ALS) и болезнь Паркинсона (PD), приводят к потере сотен тысяч жизней каждый год. Хватает эффективного лечения может остановить прогрессирование болезни. Несмотря на обширные последовательности в больших популяциях пациентов в большинстве случаев ALS и PD остаются необъяснимые, генетические мутации в одиночку. Эпигенетики такие механизмы, как столб-поступательные изменения гистона белков, могут быть вовлечены в этиологии нейродегенеративных заболеваний и прогрессии и привести к новые цели для фармацевтических вмешательства. Млекопитающих в vivo и in vitro модели ALS и PD являются дорогостоящими и зачастую требует длительных и трудоемких экспериментальных протоколов. Здесь мы приводим практический, быстрой и экономически подход к определению генома общесистемной изменения гистона модификации уровней с помощью Saccharomyces cerevisiae как модель системы. Этот протокол позволяет для всеобъемлющего расследования эпигеномные изменения, подключенных к нейродегенеративных proteinopathies, что подтверждают ранее сделанные выводы в различных модельных системах значительно расширяя наши знания о нейродегенеративные заболевания epigenome.

Введение

Нейродегенеративные заболевания являются разрушительных болезней с практически нет доступных вариантов лечения. Среди них особенно страшны боковой амиотрофический склероз (ALS) и болезнь Паркинсона (PD). Примерно в 90% случаев ALS и PD считаются спорадические, происходящие без семейной истории болезни, в то время как оставшиеся дела работать в семьях и как правило связаны с конкретным ген мутации1,2. Интересно, что оба этих заболеваний связаны с белком mislocalization и агрегации3,4,5,6. К примеру, сливается в саркома (FUS) и TAR ДНК-связывающих белков 43 (TDP-43) являются белки, связывающие РНК mislocalize в цитоплазму и объединяют в ALS7,8,9,10, 11,12, в то время как α-synuclein — это компонент принципа белковых агрегатов, называется Леви органов в PD5,13,14,15.

Несмотря на обширные генома всей ассоциации в больших популяциях пациентов подавляющее большинство случаев ALS и PD оставаться необъяснимая генетически. Можно эпигенетики играть определенную роль в нейродегенеративных заболеваний? Эпигенетики включает в себя изменения в экспрессии генов, происходит без изменения базовой последовательности ДНК16. Основные эпигенетический механизм включает столб-поступательные изменения (PTMs) гистоновых белков16. В эукариотических клетках генетический материал плотно завернута в хроматина. Базовой единицей хроматина является нуклеосома, состоящий из 146 пар оснований ДНК, обернутые вокруг гистона octamer, состоящий из четырех пар гистонов (две копии каждого гистонами H2A, H2B, H3 и H4)17. Каждый гистона имеет N-терминальный хвост, который выступает из нуклеосомой и может быть изменена путем добавления различных химических постановление, обычно на остатков лизина и аргинина18. Эти PTMs являются динамическими, что означает, что они могут быть легко добавлены и удалены и включают группы ацетилирования, метилирование и фосфорилирования. PTMs контролировать доступность ДНК транскрипционный анализ техники и тем самым помочь управления ген выражение18. К примеру, ацетилирование гистона уменьшает силы электростатического взаимодействия между очень основные гистона белка и отрицательно заряженной ДНК позвоночника, позволяя гены, Упакованные ацетилированный гистонами быть более доступным и, таким образом высоко выраженная19. Совсем недавно замечательный биологических специфику конкретных гистона PTMs и их комбинаций привела к гистона кода гипотеза20,21 в котором белки, писать, стереть и чтение гистон PTMs все согласованно действовать для модулировать экспрессию генов.

Дрожжей является очень полезной моделью для изучения нейродегенеративные. Важно отметить, что многие нейрональных клеточных пути сохраняются из дрожжей для людей22,,2324. Дрожжи пилки цитотоксичность фенотипы и белковых включений по гиперэкспрессии FUS, TDP-43 или α-synuclein22,23,24,25,26. В самом деле Saccharomyces cerevisiae модели ALS были использованы для выявления генетических факторов риска в людей27. Кроме того дрожжи, экспрессирующих человека α-synuclein разрешено для характеристики сети Rsp5 как druggable цель улучшения α-synuclein токсичности в нейроны28,29.

Здесь мы описываем протокол эксплуатации Saccharomyces cerevisiae для выявления генома wide гистонов PTM изменения, связанные с нейродегенеративных proteinopathies (рис. 1). Использование S. cerevisiae весьма привлекательными из-за его простоту использования, низкая стоимость и скорость по сравнению с другими in vitro и животных моделей нейродегенеративные. Использование ранее разработан ALS и PD модели22,23,25,26, мы оверэкспрессировали человека FUS, TDP-43 и α-synuclein в дрожжей и открытые собственный гистона PTM изменения, происходящие в связь с каждой proteinopathy30. Протокол, который мы описываем здесь может быть завершена в менее чем за две недели от преобразования для анализа данных.

протокол

1. преобразование S. cerevisiae с нейродегенеративных proteinopathy связанные белком конструкции

  1. Расти дикого типа (WT) 303 дрожжи в дрожжевой экстракт Пептон Декстроза (YPD) бульон на ночь с встряхивания (200 об/мин) при 30 ° C.
  2. После 12−16 h роста, развести дрожжи оптической плотности на 600 Нм (600OD) 0.25 с YPD. Как 10 мл жидкой культуры дрожжей будет необходимо для каждого преобразования, подготовьте 50 мл жидкого культуры дрожжей для пяти преобразований, соответствующий FUS, TDP-43, a-synuclein и конструкции вектора только (ccdB), а также преобразования отрицательного контроля без ДНК.
  3. Растут дрожжи с перемешиванием на 30 ° C, пока не будет достигнуто ОД600 между 0,60 и 0,80. Это, как правило, занимает 4−6 h.
  4. Тридцать минут, прежде чем рост дрожжей является полным, линеаризации плазмидные конструкции.
    Примечание: Плазмидные конструкции, используемые здесь должна быть интегрирована непосредственно в геном, и следовательно до преобразования требуется линеаризации.
    1. Вычислить объем запасов плазмида что составляет 1 мкг. вычесть этот объем от 44 мкл для расчета суммы нуклеиназы бесплатно H2O требуется.
    2. Добавление пробки microcentrifuge нуклеиназы бесплатно H2O, 5 мкл 10 x энзима ограничения буфера (Таблица материалов), 1 мкл NheI энзима ограничения (Таблица материалов) и соответствующее количество плазмида (исчисляемый шаг 1.4.1). Тщательно перемешать, закупорить вверх и вниз и инкубировать при 37 ° C 15 мин. Плазмида в настоящее время линеаризованного и готовы к трансформации.
  5. После дрожжи культуры достигает ОД600 0,6-0,8, урожай клетки в 50 мл Конические трубки и спин вниз на 850 x g при 4 ° C на 3 мин удалить супернатант.
  6. Вымойте клетки Пелле в 10 мл стерильной H2O и центрифуги на 850 x g при 4 ° C на 3 мин удалить супернатант. Повторите 3 x для в общей сложности четыре смывки.
  7. В начале третьей стирки оттепель и варить 10 мкл спермы ДНК лосося за преобразование реакции на 5 мин на Отопление блока.
  8. Ресуспензируйте Пелле клеток в 100 мкл dH2O на преобразование и разделить на соответствующее количество трубок microcentrifuge. Для пяти преобразований Ресуспензируйте Пелле в 500 мкл dH2O и равномерно разделена на пять отдельных microcentrifuge трубы.
  9. Центрифуга для 5 мин при 850 x g при комнатной температуре (RT) и удалить все остатки воды.
  10. В следующем порядке, 50 мкл стерильных H2O, 240 мкл 50% полиэтиленгликоля (PEG), 36 мкл 1 М LiAc, 10 мкл спермы лосося ДНК, 20 мкл линеаризованного плазмидной ДНК (или нуклеиназы свободной воды для преобразования управления ДНК). Тщательно перемешать после каждого добавления и вихревой кратко после добавления всех компонентов преобразования.
  11. Инкубируйте преобразования реакции при 42 ° C в течение 20 мин.
    Примечание: Провести этот инкубации в водяной бане для более последовательного контроля температуры.
  12. Центрифуга на 470 x g на RT для 5 минут удалить супернатант и Ресуспензируйте каждой ячейки Пелле в 200 мкл стерильных H2O.
  13. Пластина подвески дрожжей на выборочной СМИ пластины и распространение с прокатки бисером или распределителя. Инкубировать пластины для 2−3 дня при температуре 30 ° C.
    Примечание: Определенные синтетические (SD)-его плиты используются для плазмид, описанных здесь.

2. съемка подавления роста колонии и хранения в запасах глицерина

  1. Прививок одной колонии от преобразования пластины в 5 мл селективного СМИ, дополнена Рафиноза 2%. Растут на шейкер на 30 ° C на ночь. Выберите по крайней мере 12 колоний за преобразования.
    Примечание: Не колоний ожидаются в пластину управления преобразования «нет ДНК».
  2. Стерилизуйте контактный frogger с этанолом, следуют пылающий.
  3. Для каждой культуры, аликвота 100 мкл суспензии насыщенных клеток в первой строке 96-луночных плиты. Добавьте 200 мкл стерильных H2O на всех скважинах хорошо смежных столбцов. Для 1:5 серийных разведений добавьте 50 мкл из первого столбца в соседнем столбце позади с многоканальные пипетки. Тщательно перемешать, закупорить. Затем добавьте 50 мкл из второго столбца в третьей колонке и микс, закупорить. Повторите это для остальной части пластины.
  4. Пластина дрожжей, поместив frogger в 96-луночных пластине и затем штамповки аккуратно и равномерно нажимая вниз на выборочный СМИ пластины с и без галактозы. Инкубируйте 2−3 дня при температуре 30 ° С.
    Примечание: SD-его и SGal-его плиты используются для плазмид, описанных здесь.
  5. FUS, TDP-43 и а-synuclein преобразований определите колонии, отображение наиболее подавления роста присутствии галактозы. Выберите этот колонии от SD-его пластины и инокуляции в 10 мл селективного СМИ с 2% Рафиноза ночь роста. Для контроля переносчиков выберите отображение не подавление роста присутствии галактозы колонии.
  6. Подготовить глицерин запасов, объедините 0,5 мл насыщенной жидкости культуры с 0,5 мл 50% глицерина. Смешать, закупорить вверх и вниз и заморозить при температуре-80 ° C.
    Примечание: Глицерин запасов может храниться до года-80 ° c.

3. гиперэкспрессия нейродегенеративных proteinopathy связанных белков в S. cerevisiae

  1. Из замороженных глицерин запасов, повторно испещрять дрожжей на гистидина, 2% глюкозы агар селективного СМИ пластины и проинкубируйте 2−3 дня при температуре 30 ° C.
  2. Для каждой из моделей гиперэкспрессия и контроля в 5 мл гистидина селективного жидких сред с 2% Рафиноза инокуляции одной колонии. Расти с встряхивания (200 об/мин) при 30 ° C на ночь.
  3. Расти 100 мл жидкого культуры для каждой из моделей гиперэкспрессия и контроль (FUS, TDP-43 и Векторный контроль;-synuclein и вектор управления).
    1. Подготовка 100 мл культуры в выборочной СМИ с 2% галактозы.
    2. Измерить ОД600 ночь культур и рассчитать количество ночь культуры, необходимые для визуализации гиперэкспрессия культур начала ОД600 0,3. Как правило на ночь культуры достигнет ОД600 0.9−10, требует около 5 мл на ночь культуры начать 100 мл свежего культуры.
    3. Побудить гиперэкспрессия белка путем выращивания дрожжей на СМИ галактозу (см. шаг 3.3.1) для 5 h (FUS и TDP-43) или 8 h (a-synuclein) с тряску при 30 ° C.
  4. Мера ОД600 каждой культуры в конце периода индукции. Стандартизация всех клеток с наименьшим значением600 ОД. Урожай в 50 мл трубки культуры центрифугированием при 850 x g 5 мин при 4 ° C. Выбросите супернатант.
    Примечание: Если ОД600 , измеренные в конце индукции 0.654 и 0,984, соответственно, 100 мл-synuclein культуры и 100 мл культуры управления, урожай 95 мл-synuclein культуры и 67,1 мл культуры управления.
  5. Ресуспензируйте Пелле в 1 мл стерильного dH2O для каждые 10 мл культуры выросли. Равномерно разделить гранулы, aliquoting 1 мл клеток ресуспендирования в microcentrifuge трубы. Например если начиная с 100 мл культуры, Ресуспензируйте Пелле в 10 мл стерильной dH2O и разделить его на 10 microcentrifuge трубы.
  6. Центрифуга на 850 x g 5 минут при температуре 4 ° C, а затем удалить супернатант. Оснастки замораживание клеток окатышей в жидком азоте и хранить при температуре-80 ° C.
    Примечание: Клетки гранулы могут храниться при температуре-80 ° C на срок до одного года.

4. клетки лизис и Западный blotting для обнаружения столб-поступательные изменения гистона

  1. Лизис клеток
    1. Оттепель дрожжевых клеток окатышей на льду и Ресуспензируйте клеток окатышей в 100 мкл dH2O.
    2. Для ячейки взмучивания добавьте 0,2 М NaOH 300 мкл и 20 мкл 2-меркаптоэтанол. Ресуспензируйте, закупорить вверх и вниз.
    3. Инкубировать клетки на льду за 10 мин и затем центрифуги на 3200 x g на настольная центрифуга для 30 s на RT. удалить супернатант.
    4. Ресуспензируйте Пелле клеток в 100 мкл 1 x загрузки красителя и варить 10 мин на Отопление блока.
      Примечание: Рецепт для 6 x загрузки краситель можно найти в Таблице материалов.
  2. Электрофорез геля полиакриламида додецилового сульфата натрия и мембраны передачи
    1. Подготовьте камеру гель, поставив два гели в гель держатель и заполнение внутренней камере на вершину с управлением буфера и заполнение вне камеры до отметки 2 гель линии.
    2. Загрузите 15 мкл пример из шага 4.1.4 за хорошо в геле полиакриламида 12% 10-хорошо. Для белка лестница Лейн нагрузка 5 мкл.
    3. Побегите гель для приблизительно 45 мин, 150 V, или до тех пор, пока загрузка краситель фронта достигает нижней части геля.
    4. Пока выполняется гель, подготовка к передаче мембраны путем замачивания волоконно колодки (два на гель) в буфер передачи (Таблица материалов) и замачивания винилидена фторида (PVDF) мембраны в метаноле. Промойте мембрану в буфер передачи перед передачей.
      Примечание: PVDF мембрану должны быть сокращены к размеру геля и использовать один из PVDF мембраны для каждого гель переводится.
    5. Монтаж на полусухой передачи аппарат клеток, передача «сэндвич»: от нижней электрода, место (1) замоченный волоконно колодки, (2) замоченный и промыть PVDF мембрану, (3) гель от шага 4.2.3 и (4) второй замоченный волоконно колодки.
      Примечание: Убедитесь избежать воздушных пузырей в передаче «сэндвич». Аккуратно ролл «сэндвич» с Серологические Пипетки вытеснить пузыри. После того, как гель был сделан на вершине PDVF мембраны, убедитесь, что не для того переместить его.
    6. Осуществлять передачи белка, установив пакет мощность до 150 мА на 1 ч (для одного «сэндвич»).
  3. Обнаружение гистона PTMs с модификации специфические антитела
    1. Удаление мембраны из передачи аппарат. Промойте кратко dH2O.
      1. При необходимости проверьте Перенос белков с пятно Пуансо, поливая достаточно Пуансо пятно покрытие мембраны в пластиковую коробочку и инкубации на RT с нежно тряска для 30−60 s. Удалите Пуансо пятно и промойте dH2O до тех пор, пока пятно фон исчезает и белка полосы видны невооруженным глазом. Продолжать промыть dH2O до тех пор, пока все пятно удаляется из мембраны.
    2. Блокировать мембраны, инкубации помарку для 1 h на RT с плавное покачивание с трис-буфер солевой (TBS) блокирующий буфер (Таблица материалов) в небольшой коробке окрашивание. Используйте достаточно блокирующий буфер для покрытия помаркой.
      Примечание: Будьте осторожны, чтобы место мембраны вертикально в поле окрашивания, так что стороной мембраны, на котором белки лежат не обращены вниз.
    3. Инкубировать пятно в поле окрашивания на ночь с гистонов модификации специфические антитела реактивной к дрожжей на 4 ° C. Разбавьте антитела в блокирующем буфере TBS согласно спецификации производителя. Также включать элемент управления надлежащего ядерного загрузки, такие как анти всего H3, поднятые в различных принимающих видов от модификации специфические антитела. Например если зондирование для H3S10ph с антитела анти H3S10ph, вырос в кролика, используйте антитело против всего H3, вырос в мыши как элемент загрузки. Повторите это для каждого блот при необходимости.
      Примечание: Разбавления антитела могут быть использованы для в общей сложности три раза в течение одного месяца. Хранить их при 4 ° C.
    4. Промойте мембрану 4 x в дом сделал TBS + 0.1% Полисорбат 20 (TBST) за 5 мин с качания на RT.
    5. Инкубировать пятно с флуоресцентные вторичные антитела на указанный производителем разведений (осел анти кролик 680 и осел анти мышь) за 1 ч на RT.
      Примечание: Флуоресцентные вторичные антитела должны быть защищены от света во время хранения и использования. Осуществлять инкубации в темные пластмассовые ящики или накрыть алюминиевой фольгой.
    6. Промойте мембрану 4 x с TBST за 5 минут и промыть TBS 5 минут во время раскачивания на RT.
    7. Визуализация пятно на флуоресцентные западную помарку изображений системы за 2 мин визуализировать анти кролик 680 и вторичные антитела анти мыши 800 в 800 Нм, 700 Нм каналов и соответственно.
      Примечание: Реплицирует независимо проводятся начиная с раздела 1. Необходимо убедиться, что сигнал реакции антитела находится в пределах диапазона, над которой сигнал ответа является линейным для интерпретации соответствующих данных в этих экспериментах.

5. анализ данных и статистика

  1. Открыть изображение пятно в изображений программное обеспечение (Таблица материалов). Приобрести объемная плотность образцов изменения конкретных групп в вектор управления, TDP-43 и фу (или переносчиками и a-synuclein), нарисовав прямоугольник, кадры группы в режиме анализа.
  2. Повторите шаг 5.1 для загрузки элемента управления ленты.
    Примечание: Там будет загрузки контролировать изменения конкретных диапазонах в каждом образце и.
  3. Вычислить относительную плотность изменения конкретных групп путем деления каждой группы плотность соответствующей группы в образце векторного управления. Это нормализует данные с переносчиками.
  4. Вычислить относительную плотность нагрузки группы управления путем деления каждой группы плотность загрузки соответствующего управления полоса в образце векторного управления.
  5. Вычисления скорректированного относительная плотность каждой группы путем деления относительная плотность модификации конкретные группы над относительной плотности нагрузки группы управления для каждого образца. Теперь данные могут быть визуализированы в форме гистограммы.
    Примечание: Для удобства обработки, шаги 5.3-5.5 может быть сделано в электронной таблице (Дополнительный файл).
  6. После нескольких независимых реплицирует, выполнения Уэлч T-тесты между двумя контрольными образцами и соответствующие proteinopathy модели (элементы управления против FUS, управления по сравнению с TDP-43 и по сравнению с a-synuclein) с p = 0,05 как отсечки для значение .

Результаты

Для иллюстрации этого метода, мы будем использовать недавно опубликованные результаты30. WT человека FUS и TDP-43 были оверэкспрессировали за 5 ч, в то время как WT α-synuclein был оверэкспрессировали за 8 ч. Конструкция ccdB был использован как элемент отрицательный век...

Обсуждение

Протокол, описанные здесь обеспечивает простой, целесообразным и экономически эффективным способом изменения генома wide гистонов ПТМ, коррелирует с нейродегенеративных proteinopathies классификации. Хотя есть другие модели ALS и PD, например в vitro линий клеток человека и мышиным модели

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Мы благодарим Royena Tanaz, Юсуф Худа и Sadiqa Taasen для получения технической помощи. Мы очень благодарны профессор Джеймс короче за щедрое предоставление реагентов и интеллектуальной помощи в разработке сахарозы настройки экспериментов. Плазмиды дрожжи были щедрый подарок от профессор Аарон Gitler (включая 303 Гал-Фу; Плазмиды # 29614 Addgene). Бруклинский колледж и расширенный научно исследовательский центр (КЮНИ), а также низ NINDS Advanced докторской перехода награду (K22NS09131401) поддержал M.P.T.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
-His DO SupplementClontech630415
10x Running BufferMix: 141.65 g glycine (ThermoFisher BP381-1), 30.3 g Tizma base (Sigma-Aldrich T6066), 10 g sodium dodecyl sulfate (Sigma-Aldrich L3771), and 1 L deionized water, pH 8.8.
12% Polyacrylamide GelsBIO-RAD456-1041
2-mercaptoethanolSigma-AldrichM3148
Anti-acetyl-Histone H3 (Lys14) Primary AntibodyMilliporeSigma07-353 (Lot No. 2762291)Dilution: 1/1000
Anti-acetyl-Histone H4 (Lys 16) Primary AntibodyAbcamab109463 (Lot No. GR187780)Dilution: 1/2000
Anti-acetyl-Histone H4 (Lys12) Primary AntibodyAbcamab46983 (Lot No. GR71882)Dilution: 1/5000
Anti-dimethyl-Histone H3 (Lys36) Primary AntibodyAbcamab9049 (Lot No. GR266894, GR3236147)Dilution: 1/1000
Anti-Histone H3 Primary AntibodyAbcamab24834 (Lot No. GR236539, GR174196, GR3194335)Nuclear Loading Control; Dilution: 1/2000
Anti-phospho-Histone H2B (Thr129) Primary AntibodyAbcamab188292 (Lot No. GR211874)Dilution: 1/1000
Anti-phospho-Histone H3 (Ser10) Primary AntibodyAbcamab5176 (Lot No. GR264582, GR192662, GR3217296)Dilution: 1/1000
BioPhotometer D30Eppendorf6133000010
Cell Culture Dish (100 x 20 mm)Eppendorf30702118
Cell Culture Plate, 96 wellEppendorf30730011
Centrifuge 5804/5804 R/5810/5810 REppendorf22625501
Donkey Anti-Mouse IRDye 800 CWLI-COR926-32212 (Lot No. C60301-05, C61116-02, C80108-05)Dilution: 1/5000
Donkey Anti-Rabbit IRDye 860 RDLI-COR926-68073 (Lot No. C60217-06, C70323-06, C70601-05, C80116-07)Dilution: 1/2500
EthanolSigma-AldrichE7023
Extra thick blot paper (filter paper)BIO-RAD1703968
GalactoseSigma-AldrichG0750Prepare 20% w/v stock solution.
GlucoseSigma-AldrichG8270Prepare 20% w/v stock solution.
GlycerolSigma-AldrichG5516Prepare 50 % w/v solution.
Immobilon-FL Transfer MembranesMilliporeSigmaIPFL00010
Lithium acetate dihydrate (LiAc)Sigma-AldrichL4158Prepare a 1 M solution.
Loading DyeMix: 1.2 g sodium dodecyl sulfate, 6 mg bromophenol blue (Sigma-Aldrich B8026), 4.7 mL glycerol, 1.2 mL 0.5M Trizma base pH 6.8, 0.93 g DL-Dithiothreitol (Sigma-Aldrich D0632), and 2.1 mL deionized water.
MethanolThermoFisherA412-4
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoeresis CellBIO-RAD1658004
Multichannel pipetEppendorf2231300045
NEB Restriction Enzyme Buffer 2.1, 10xNew England Bio Labs102855-152
Nhe I Restriction EnzymeNew England Bio Labs101228-710
Nuclease Free WaterQiagen129114
Odyssey Fc Imaging SystemLI-COR Biosciences2800-03
OmniTray Cell Culture Treated w/Lid Sterile, PS (86 x 128 mm)ThermoFisher165218
pAG303GAL-a-synuclein-GFPGift from A. Gitler
pAG303GAL-ccdBAddgene14133
pAG303Gal-FUSAddgene29614
pAG303GAL-TDP-43Gift from A. Gitler
Poly(ethylene glycol) (PEG)Sigma-AldrichP4338Prepare a 50% w/v solution.
Ponceau S StainSigma-AldrichP3504Mix: 0.5 g 0.1% w/w Ponceau S dye, 5 mL 1% v/v acetic acid (Sigma-Aldrich 320099), and 500 mL deionized water.
PowerPac Basic Power SupplyBIO-RAD164-5050
Raffinose pentahydrateSigma-AldrichR7630Prepare 10% w/v stock solution.
Salmon Sperm DNAAgilent Tech201190
SD-His platesMix: 20 g Agar (Sigma-Aldrich A1296), 0.77 g -His DO supplement, 6.7 g yeast Nitrogen Base w/o amino acids (ThermoFisher 291920), and 900 mL deionized water.
SGal-His platesMix: 20 g Agar, 0.77 g -His DO supplement, 6.7 g yeast Nitrogen Base w/o amino acids, 100 mL galactose solution, and 900 mL deionized water.
Sodium dodecyl sulfate Loading BufferStore at -20 oC. 6X, Mix: 1.2 g sodium dodecyl sulfate, 6 mg bromophenol blue, 0.93 g DL-Dithiothreitol, 2.1 mL deionized water, 4.7 mL glycerol, and 1.2 mL 0.5 M Trizma base, pH 6.8.
Sodium hydroxideSigma-Aldrich221465Prepare 0.2 M solution.
SucroseSigma-Aldrich84097Prepare 20% w/v stock solution.
TBS + 0.1% Tween 20 (TBST)Mix: 100 mL 10X TBS, 1 mL Tween 20 (Sigma-Aldrich P7949), and 900 mL deionized water.
TBS Blocking BufferLI-COR927-5000
Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer CellBIO-RAD170-3940
Transfer BufferMix: 22.5 g glycine, 4.84 g Tizma base, 400 mL methanol, 1 g sodium dodecyl sulfate, and 1.6 L deionized water.
Tris-Buffered Saline (TBS)10X, 7.6 pH, Solution: Mix 24 g Trizma base, and 88 g sodium chloride (Sigma-Aldrich S7653). Fill to 1 L with deionized water.
WT 303 S. cerevisiae yeastGift from J. Shorter
Yeast Extract Peptone Dextrose (YPD)Sigma-AldrichY1375

Ссылки

  1. Landgrave-Gómez, J., Mercado-Gómez, O., Guevara-Guzmán, R. Epigenetic mechanisms in neurological and neurodegenerative diseases. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 58 (2015).
  2. Paez-Colasante, X., Figueroa-Romero, C., Sakowski, S. A., Goutman, S. A., Feldman, E. L. Amyotrophic lateral sclerosis: mechanisms and therapeutics in the epigenomic era. Nature Reviews Neurology. 11 (5), 266-279 (2015).
  3. Beitz, J. M. Parkinson's Disease: a Review. Frontiers in Bioscience. 6, 65-74 (2014).
  4. Kim, H. J., et al. Mutations in prion-like domains in hnRNPA2B1 and hnRNPA1 cause multisystem proteinopathy and ALS. Nature. 495 (7442), 467-473 (2013).
  5. Poewe, W., et al. Parkinson disease. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17013 (2017).
  6. Robberecht, W., Philips, T. The changing scene of amyotrophic lateral sclerosis. Nature Reviews Neuroscience. 14 (4), 248-264 (2013).
  7. Chen-Plotkin, A. S., Lee, V. M. Y., Trojanowski, J. Q. TAR DNA-binding protein 43 in neurodegenerative disease. Nature Reviews Neurology. 6 (4), 211-220 (2010).
  8. Couthouis, J., et al. A yeast functional screen predicts new candidate ALS disease genes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (52), 20881-20890 (2011).
  9. Da Cruz, S., Cleveland, D. W. Understanding the role of TDP-43 and FUS/TLS in ALS and beyond. Current Opinion in Neurobiology. 21 (6), 904-919 (2011).
  10. King, O. D., Gitler, A. D., Shorter, J. The tip of the iceberg: RNA-binding proteins with prion-like domains in neurodegenerative disease. Brain Research. 1462, 61-80 (2012).
  11. Neumann, M., et al. FET proteins TAF15 and EWS are selective markers that distinguish FTLD with FUS pathology from amyotrophic lateral sclerosis with FUS mutations. Brain. 134 (9), 2595-2609 (2011).
  12. Neumann, M., et al. Ubiquitinated TDP-43 in Frontotemporal Lobar Degeneration and Amyotrophic Lateral Sclerosis. Science. 314 (5796), 130-133 (2006).
  13. Baba, M., et al. Aggregation of alpha-synuclein in Lewy bodies of sporadic Parkinson's disease and dementia with Lewy bodies. The American Journal of Pathology. 152 (4), 879-884 (1998).
  14. Lotharius, J., Brundin, P. Pathogenesis of parkinson's disease: dopamine, vesicles and α-synuclein. Nature Reviews Neuroscience. 3 (12), 932-942 (2002).
  15. Spillantini, M. G., et al. α-Synuclein in Lewy bodies. Nature. 388 (6645), 839-840 (1997).
  16. Probst, A. V., Dunleavy, E., Almouzni, G. Epigenetic inheritance during the cell cycle. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (3), 192-206 (2009).
  17. Luger, K., Mäder, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 Å resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
  18. Mazzio, E. A., Soliman, K. F. A. Basic concepts of epigenetics. Epigenetics. 7 (2), 119-130 (2012).
  19. Struhl, K. Histone acetylation and transcriptional regulatory. Genes & Development. 12 (5), 599-606 (1998).
  20. Garcia, B. A., Shabanowitz, J., Hunt, D. F. Characterization of histones and their post-translational modifications by mass spectrometry. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (1), 66-73 (2007).
  21. Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).
  22. Jovicic, A., et al. Modifiers of C9orf72 dipeptide repeat toxicity connect nucleocytoplasmic transport defects to FTD/ALS. Nature Neuroscience. 18 (9), 1226-1229 (2015).
  23. Sanchez, Y., Lindquist, S. L. HSP104 required for induced thermotolerance. Science. 248 (4959), 1112 (1990).
  24. Outeiro, T. F., Lindquist, S. Yeast Cells Provide Insight into Alpha-Synuclein Biology and Pathobiology. Science. 302 (5651), 1772 (2003).
  25. Johnson, B. S., et al. TDP-43 Is Intrinsically Aggregation-prone, and Amyotrophic Lateral Sclerosis-linked Mutations Accelerate Aggregation and Increase Toxicity. Journal of Biological Chemistry. 284 (30), 20329 (2009).
  26. Sun, Z., et al. Molecular Determinants and Genetic Modifiers of Aggregation and Toxicity for the ALS Disease Protein FUS/TLS. PLOS Biology. 9 (4), e1000614 (2011).
  27. Elden, A. C., et al. Ataxin-2 intermediate-length polyglutamine expansions are associated with increased risk for ALS. Nature. 466 (7310), 1069-1075 (2010).
  28. Wijayanti, I., Watanabe, D., Oshiro, S., Takagi, H. Isolation and functional analysis of yeast ubiquitin ligase Rsp5 variants that alleviate the toxicity of human α-synuclein. The Journal of Biochemistry. 157 (4), 251-260 (2015).
  29. Tardiff, D. F., et al. Yeast Reveal a “Druggable” Rsp5/Nedd4 Network that Ameliorates α-Synuclein Toxicity in Neurons. Science. 342 (6161), 979 (2013).
  30. Chen, K., et al. Neurodegenerative Disease Proteinopathies Are Connected to Distinct Histone Post-translational Modification Landscapes. ACS Chemical Neuroscience. 9 (4), 838-848 (2018).
  31. Flick, J. S., Johnston, M. Two systems of glucose repression of the GAL1 promoter in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 10 (9), 4757 (1990).
  32. Fernandez-Santiago, R., Ezquerra, M. Epigenetic Research of Neurodegenerative Disorders Using Patient iPSC-Based Models. Stem Cells International. 2016, 9464591 (2016).
  33. Armakola, M., et al. Inhibition of RNA lariat debranching enzyme suppresses TDP-43 toxicity in ALS disease models. Nature Genetics. 44 (12), 1302-1309 (2012).
  34. Tibshirani, M., et al. Cytoplasmic sequestration of FUS/TLS associated with ALS alters histone marks through loss of nuclear protein arginine methyltransferase 1. Human Molecular Genetics. 24 (3), 773-786 (2015).
  35. Masala, A., et al. Epigenetic Changes Associated with the Expression of Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) Causing Genes. Neuroscience. 390, 1-11 (2018).
  36. Eryilmaz, I. E., et al. Epigenetic approach to early-onset Parkinson’s disease: low methylation status of SNCA and PARK2 promoter regions. Neurological Research. 39 (11), 965-972 (2017).
  37. Daniele, S., et al. Epigenetic Modifications of the α-Synuclein Gene and Relative Protein Content Are Affected by Ageing and Physical Exercise in Blood from Healthy Subjects. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2018, 3740345 (2018).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

145synucleinTAR 43

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены