JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мы описываем in vivo иммунизацию, трансляционную модель гепатита у мышей BALB / c, которая может быть использована для изучения патогенеза аутоиммунного гепатита, вызванного лекарственными средствами, включая половые различия, наблюдаемые при этом заболевании. Мы опишем, как эта модель демонстрирует воспроизводимый анализ с использованием экспериментальных методов in vivo и in vitro.

Аннотация

Медикаментозный аутоиммунный гепатит (DIH) является наиболее распространенным процессом гиперсенсибилизации печени, вызванным лекарственными средствами, наблюдаемым примерно у 9-12% пациентов с аутоиммунным гепатитом. Подавляющее большинство пациентов с DIH - женщины. Основные механизмы этих половых различий в распространенности неясны из-за нехватки животных моделей, которые имитируют болезни человека. Тем не менее, широко распространено мнение, что основные механизмы связаны с гаплотипами лейкоцитарного антигена человека и половыми гормонами. Напротив, используя модель мыши DIH, мы обнаружили, что IL-4 инициируют CD4 + Т-клетки, направленные против эпитопа цитохрома P450 2E1, индуцирует приток нейтрофилов, макрофагов и тучных клеток в печень самок мышей BALB / c. Используя эту модель, мы также показали, что IL-33-индуцированные FoxP3 + регуляторные Т-клетки обеспечивают защиту от DIH у самок и самцов мышей. Эта модель DIH индуцируется путем иммунизации мышей эпитопом CYP2E1, который был ковалентно изменен метаболитом лекарственного средства, который был связан с DIH. Этот эпитоп распознается пациентами с DIH. Наш метод индуцирует устойчивый и воспроизводимый гепатит и аутоантитела, которые могут быть использованы для изучения патогенеза DIH. В то время как исследования in vivo могут вызывать чрезмерную боль и дистресс у мышей при неправильном выполнении, преимущество модели in vivo заключается в способности оценивать патогенез заболевания у большого числа мышей. Кроме того, биологические эффекты измененных белков печени могут быть изучены с использованием инвазивных процедур. Добавление исследований in vitro к экспериментальной конструкции позволяет быстро повторять и механистически анализировать на клеточном уровне. Таким образом, мы продемонстрируем наш модельный протокол и то, как его можно использовать для изучения механизмов DIH in vivo и in vitro.

Введение

Целью этого метода является описание мышиной модели лекарственно-индуцированного аутоиммунного гепатита, который развивается in vivo, и демонстрация того, как его можно использовать для исследования молекулярной, иммунологической и генетической основы этого заболевания. Долгосрочная цель наших исследований состоит в том, чтобы выявить механизмы, ответственные за развитие хронического воспаления и повреждения печени, путем изучения DIH у восприимчивых пациентов. Заболевания печени и цирроз печени являются шестой наиболее распространенной причиной смерти у взрослых в возрасте от 25 до 64 лет. Идиосинкразический DILI, иногда называемый медикаментозным аутоиммунным гепатитом (DIH), является третьей наиболее распространенной причиной острой печеночной недостаточности в Соединенных Штатах. DIH является наиболее распространенным процессом гиперсенсибилизации печени, вызванным лекарственными средствами, наблюдаемым примерно у 9-12% пациентов с аутоиммунным гепатитом1. Подавляющее большинство пациентов с ДГК составляют женщины 2,3,4. Тип DIH развивается у восприимчивых людей после введения галогенированных летучих анестетиков, таких как изофлуран, севофлуран, десфлуран или галотан. Эти анестетики ковалентно связываются с белками печени с реактивными продуктами их метаболизма, создавая таким образом новые аутоантигены, способные вызывать аллергические или аутоиммунные реакции5.

Изучение патогенных механизмов, участвующих в разработке анестетика и любой формы DIH, ранее затруднялось отсутствием животной модели, которая близко имитирует индукцию заболевания человека. Мы разработали экспериментальную мышиную модель DIH с признаками, напоминающими иммуноопосредованный DILI у пациентов. Гепатит индуцируется иммунизацией одним из двух аутоантигенов, которые были ковалентно модифицированы метаболитом трифторацетилхлорида (TFA), который образуется после окислительного метаболизма анестетика ферментом цитохромом P450 2E1 (CYP2E1)5. Одним аутоантигеном является печеночная цитозольная фракция печени S100, которая представляет собой смесь нескольких белков6, а второй аутоантиген представляет собой эпитоп CYP2E1, который распознается сыворотками у пациентов с анестетиком иммуноопосредованным DILI7. Используя мышей BALB/c, которые относительно устойчивы к экспериментальному аутоиммунному гепатиту, мы отличаем нашу модель от S100-индуцированной модели иммунизации аутоиммунного гепатита у мышей C57Bl/6J8.

Из-за его разнообразных клинических проявлений DIH трудно изучать у пациентов. Трансляционные экспериментальные модели дают возможность оценить патогенез заболевания in vivo и in vitro. В настоящее время не существует других альтернативных методов индуцирования DIH, которые полностью исследуют адаптивные или врожденные иммунные реакции in vivo или in vitro без использования животных. Более того, поскольку трифторацетилирование S-100 или эпитопа CYP2E1, по-видимому, не производит раздражающего иммуногена, и мы индуцируем DIH путем иммунизации белками, измененными TFA, эти животные не будут получать эфир, любой галогенированный анестетик, барбитурат или алкоголь до иммунизации или других процедур, учитывая, что эти агенты могут изменить параметры, которые мы изучаем. Тем не менее, мы уменьшили использование наших мышей, используя компьютерное моделирование для подтверждения предпочтений связывания нашего обнаруженного эпитопа CYP2E19 и отразили человеческий DIH, связанный с женским полом, продемонстрировав, что у самок мышей BALB / c развивается более тяжелый DIH10.

Несмотря на разнообразные проявления DIH у пациентов и проблемы в изучении клинического заболевания, посттрансляционная модификация нативных белков метаболитами реактивных лекарственных средств является признанным ключевым механизмом в патогенезе DIH, который следует за галогенированными анестетиками11. Исследователи также признают, что CYP2E1 является основным аутоантигеном в этом процессе12,13. Роль интерлейкиновых (IL)-4-повышенных CD4+Т-клеток, которые распознают посттрансляционно модифицированный CYP2E1 и другие белки печени, является признанным инициатором анестезирующего DIH путем привлечения нейтрофилов, эозинофилов и тучных клеток в печень14, и этот механизм был подтвержден во многих формах DIH15,16. Индуцированные FoxP3-экспрессирующие CD4+CD25+Т-клетки (Tregs) снижают тяжесть DIH, а относительные недостатки этих клеток в селезенке ухудшают DIH 10,7. Таким образом, большинство достижений в понимании DIH стало возможным благодаря использованию моделей мышей in vivo для оценки генетических, метаболических и иммунологических механизмов DIH как in vivo, так и in vitro.

Поскольку мы и другие исследователи раскрыли роль IL-4, нейтрофилов и эозинофилов в инициировании DIH с использованием различных моделей мышей, мы считаем, что это наблюдение подтверждает наше утверждение о том, что независимо от используемой модели DIH, гепатит и травма индуцируются IL-4. Сила нашего протокола заключается в использовании методологии in vivo, как самцов, так и самок мышей, и повторении гистологии, анализов пролиферации CD4 + Т-клеток и цитокинов. Сила нашего использования исследований in vitro заключается в том, что они уменьшают количество необходимых мышей, обеспечивая методологию для изоляции клеточных взаимодействий, которые управляют DIH. Мы рекомендуем использовать самцов и самок мышей, потому что это снижает возможность бессознательной предвзятости в интерпретации результатов и усиливает переводческий потенциал наших исследований, поскольку заболеваемость, распространенность и тяжесть DIH выше у женщин17 лет. Мы рекомендуем, чтобы мыши были получены от одного поставщика; однако, если это невозможно, получите контроль над пометом или мышей дикого типа у того же поставщика, что и генетически измененные мыши.

протокол

Все процедуры были одобрены комитетом по уходу за животными и их использованию.

1. Трифторацетилирование печеночных цитозольных белков S-100 или эпитопа CYP2E1

ПРИМЕЧАНИЕ: Во-первых, подготовьте трифторацетилированный S100 (TFA-S100) и трифторацетилированный эпитоп CYP2E1 (TFA-JHDN5). Потому что для иммунизации необходимы сингенные белки S100, а мыши BALB/c необходимы для производства иммуногена. Препарат дает большое количество иммуногена; Таким образом, ожидайте выполнения этой части около четырех раз в год. Идентичный метод будет использоваться для изготовления TFA-JHDN5. Эпитоп CYP2E1 (JHDN5), GII / FNN / GPT / WKD / IRR / FSL / TTL, может быть секвенирован или приобретен.

  1. Выделение фракции S100 печени.
    1. После седации 5-10 БАЛБ/с мышей с 40-60 мг/кг кетамина, смешанного с 4 - 6 мг/кг ксилазина, подтверждают надлежащую глубину анестезии, наблюдая снижение мышечного тонуса и отсутствие реакции на болезненные раздражители, такие как защемление пальца ноги (рефлекс отмены), в дополнение к потере корректирующих рефлексов и потере пальпебральных рефлексов.
    2. Используя микрохирургические ножницы, обнажите внутрибрюшное содержимое с помощью разреза средней линии и сделайте небольшой разрез в нижней полой вене для удаления крови.
    3. Поместите ангиокатетер 24-го калибра в воротную вену и перфьминируйте печень 10 мл/мин 40 мл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS) pH 7,4 на водяной бане при 4 °C. Снимите и взвесьте слитую печень и нарежьте ее небольшими кусочками (10 – 15 мм).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эвтаназия индуцируется внутрибрюшинной инъекцией дополнительного кетамина / ксилазина (80 мг / кг: 8 мг / кг), с последующим вывихом шейки матки и открытием грудной полости для коллапса легких. Этот метод обеспечивает наименьшую боль и дискомфорт животным. Этот метод согласуется с рекомендациями Группы по эвтаназии Американской ветеринарной медицинской ассоциации.
    4. Добавьте в 4 раза больше массы сахарозы (250 мМ) -TRIS (10 мМ)-буфера гомогенизации ЭДТА (1 мМ) (рН 7,4), дополненного таблетками полного ингибитора протеазы Коктейля (см. Таблицу материалов) в соответствии с рекомендациями производителя. Гомогенизируйте в полипропиленовой трубке объемом 15 мл, используя общий лабораторный гомогенизатор тканей на средней скорости на льду до однородной массы. Гомогенизируйте на льду, чтобы предотвратить потепление ткани во время гомогенизации.
    5. Центрифугируют гомогенаты печени при 1500 х г в течение 10 мин, а затем выливают супернатант. Центрифугировать супернатант в течение 1 ч при 100 000 х г. Заморозьте супернатант и храните при температуре -80 °C. Супернатантом является цитозольный S-100.
  2. Трифторацетилирование S100 и JHDN5
    ПРИМЕЧАНИЕ: Трифторацетилирование ε-аминогрупп остатков лизина S-100 будет осуществляться по методике Satoh18. Все части этого эксперимента, за исключением последних дней диализа, выполняются в вытяжном шкафу.
    1. Определить общую концентрацию белка цитозольного S-100 с помощью анализа бицинхониновой кислоты (BCA-анализ)7. Разбавить 20 мг BALB/c мыши S100 или JHDN5 до 10 мл с dH2O в колбе Эрленмейера объемом 50 мл. Отрегулируйте pH до 10 с 1N KOH.
    2. Добавьте в раствор 4,7 ммоль S-этилтрифтортиоацетата (S-ETFA). Поддерживайте рН между 9,9 – 10,0 с 1N KOH путем введения KOH капельным способом в течение примерно 1 ч. Запишите общий объем KOH для каждой реакции.
    3. Переложите растворы в отдельные диализные кассеты (не переливайте). Диализуйте кассеты в течение 72 ч против 4 л dH2Oс тремя изменениями в день. После диализа запишите окончательный объем TFA-S100 или TFA-JHDN5, а затем аликвотируйте в меченые трубки. Заморозить и хранить при температуре –80 °C.
    4. Расчетную концентрацию определяют путем деления начального количества S100 или JHDN5 (в мг) на конечный объем после диализа (мл). Для определения процентной модификации нативного белка19 разводят 1,0 мг каждого нативного и измененного TFA белка (если конечная концентрация превышает 1,0 мг) до 1,0 мл с dH2O в отдельных пулевых трубках и готовят заготовку с использованием 1,0 мл dH2O. Если концентрация TFA-измененного белка составляет менее 1,0 мг, не разбавляйте
      1. Чтобы отделить лунки от плиты из 96 скважин, добавьте 50 мкл заготовки, нативные и измененные белки. Добавьте 50 мкл 4% NaHCO3 с последующим 50 мкл 0,1% 2,4,6-тринитробензолсульфоновой кислоты в каждую лунку.
      2. Инкубировать пластину при 40 °C в течение 2 ч. После инкубации добавляют 50 мкл 10% SDS в каждую скважину, а затем 25 мкл 1N HCl.
      3. Считывается при OD 334 нм, а затем регистрируется абсорбция каждого соединения от 200 до 600 нм, чтобы подтвердить характерное падение абсорбции при 334 нм. Рассчитайте процент модификации остатков лизина по TFA, используя следующую формулу:
        figure-protocol-5092

2. Иммунизация мышей для индуцирования гепатита

ПРИМЕЧАНИЕ: DIH моделируется у мышей BALB/c путем иммунизации цитозольными белками печени, которые были ковалентно изменены трифторацетилхлоридом (TFA), модельным препаратом-метаболитом, TFA-S1006 или эпитопом ковалентно CYP2E1, измененным TFA9, TFA-JHDN5, который индуцирует гепатит, аутореактивные Т-клетки и аутоантитела CYP2E1. Мыши демонстрируют фазу активации селезенки через 2 недели после первоначальной иммунизации и печеночную фазу на 3 недели, которая характеризуется гранулоцитарным воспалением. Самки мышей BALB/c более восприимчивы к гепатиту, чем самцы в этой модели.

  1. На 0-й день иммунизируют 6-8-недельных мышей BALB/c подкожно у основания шеи 200 мкг TFA-S100 или 100 мкг TFA-JHDN5 эмульгированными в равных объемах полного адъюванта Фройнда (CFA). На 0 день иммунизируют мышей 50 нг коклюшного токсина, внутримышечно в одну из задних ног. На 7-й день иммунизируют мышей подкожно у основания хвоста либо 200 мкг TFA-S100, либо 100 мкг TFA-JHDN5 эмульгированными в равных объемах CFA, чтобы каждая мышь получала две инъекции одного и того же иммуногена.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши контролируются ежечасно в течение первых 6 часов после иммунизации, а затем, по крайней мере, два раза в день в течение одной недели. Если мыши демонстрируют признаки боли или дистресса, такие как сгорбленная осанка или взъерошенная шерсть, анальгетики следует вводить в соответствии с местным ACUC. Если отмечается значительная боль или дистресс, мыши должны быть оценены ветеринаром, чтобы определить, необходима ли эвтаназия.
  2. Определение иммунных реакций CD4+ Т-клеток на целые собственные белки, эпитопы собственных белков или гаптен TFA с помощью проточной цитометрии
    1. После седации мышей с 40-60 мг/кг кетамина, смешанного с 4-6 мг/кг ксилазина с помощью внутрибрюшинной инъекции, подтвердите надлежащую глубину анестезии, как описано на этапе 1.1.1, а затем идентифицируйте селезенку после обнажения внутрибрюшной полости с помощью микрохирургических ножниц. Вырежьте селезенку у ножки и поместите в чашку Петри с PBS/2% фетальной телячьей сывороткой (FCS).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эвтаназия будет вызвана у мышей внутрибрюшинной инъекцией дополнительного кетамина / ксилазина (80 мг / кг: 8 мг / кг), с последующим вывихом шейки матки и открытием грудной полости для коллапса легких. Этот метод обеспечивает наименьшую боль и дискомфорт животным. Этот метод согласуется с рекомендациями Группы по эвтаназии Американской ветеринарной медицинской ассоциации.
    2. Отпустите ячейки с помощью горок из матового стекла и переложите на коническую полипропиленовую трубку объемом 50 мл. Мойте с PBS/2% FCS, доводя объем до 50 мл и центрифугируя при 335 x g с помощью настольной охлажденной центрифуги. Вылейте супернатант и повторите этот шаг.
    3. Удалите эритроциты с помощью 1 мл буфера ACK Lysing в течение 1 мин и доведите объем до 50 мл с PBS/2% FCS. Центрифугу при 335 х г и вылить супернатант.
    4. Подсчитайте ячейки. Маркируйте ячейки CFSE в течение 30 минут на льду в темноте, в соответствии с инструкциями производителя. Суспендировать одноклеточные суспензии в 6 пластин скважин 3x106 ячеек/мл на скважину в PBS/2% FCS.
    5. Стимулируйте меченые клетки CYP2E1, JHDN5 или TFA-OVA (10 мкг/мл) в течение 72 ч при 37 °C в 5% CO2, 95% воздухе (увлажненном). После инкубации окрашивают клетки CD4-APC (1:100) в течение 30 мин на льду и анализируют методом проточной цитометрии в течение 3 дней.
    6. Используйте следующую стратегию гатинга для идентификации клеток CD4 + CFSE +: клетки CD4 + CFSE + будут идентифицированы из закрытых живых клеток и отображаться в виде гистограмм пролиферирующих клеток.
  3. Выделение инфильтрирующих иммунных клеток от иммунизированных мышей.
    1. Чтобы изолировать инфильтрирующие иммунные клетки в печени на 14-й или 21-й день, обезболить мышей внутрибрюшинной инъекцией 40-60 мг/кг кетамина, смешанного с 4-6 мг/кг ксилазина, и подтвердить надлежащую глубину анестезии, как описано в шаге 1.1.1. После лапаротомии с использованием разреза средней линии, сделанного микрохирургическими ножницами, как описано в 1.1.2, каннулируют воротную вену иглой 25 калибра, а затем разрезают нижнюю полую вену ниже почечных вен.
    2. Перфузируйте каждую печень со скоростью потока 10 мл/мин с 40 мл PBS на водяной бане при 37 °C. После перфузии с помощью микрохирургических ножниц разрезают печень на печеночной ножке, удаляют желчный пузырь и затем разрезают печень на хилуме.
    3. Разрушают работу печени на сетчатом сите из нержавеющей стали с помощью 20 мл стерильного шприцевого пестика и холодного PBS. Отфильтруйте полученную клеточную суспензию в 50 мл предварительно стерилизованных центрифужных трубок с помощью 300-сетчатого экрана. Доведите каждую суспензию до 50 мл, используя холодный PBS, а затем промыть суспензию центрифугированием в течение 10 мин при 370 х г.
    4. Выбросьте супернатант, а затем объедините каждую гранулу путем обработки в новые пробирки по 50 мл (рекомендуется одна трубка на мышь; однако, если образцы объединены, рекомендуется 2-4 гранулы / трубка). Суспендировать объединенные гранулы в 45 мл Percoll 35% (в PBS) и 100 МЕ/мл гепарина.
    5. Вращайте каждый тюбик при 500 х г в течение 10 мин при 20 °C. Откажитесь от супернатанта и суспендируйте гранулу в 5 мл PBS, а затем добавьте 1 мл буфера лизирования ACK к каждой грануле в течение 10 минут на льду.
    6. Доведите каждый тюбик до 50 мл с PBS и промывайте центрифугированием в течение 10 мин при 370 х г. Выбросьте супернатант и затем промывайте ячейки PBS/2% FCS центрифугированием в течение 10 мин при 370 х г. Подсчитайте ячейки.
    7. Анализ типа клеток с помощью проточной цитометрии
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вот пример того, как можно обнаружить индуцированный Foxp3+Tregs.
      1. Инкубировать 1x106 клеток с реагентом, блокирующим FcR, и окрашивать с 1:100 разведениями CD4-FITC, CD25-PE и CD45-PerCP в течение 30 мин на льду. Далее окрашивают клетки внутриклеточным путем с помощью FoxP3-APC.
      2. Зафиксируйте клетки 250 мкл буфера фиксации (см. Таблицу материалов) и храните при 4 °C до анализа методом проточной цитометрии в течение 3 дней.
      3. Для обнаружения индуцированных Foxp3 + Tregs в одноклеточных суспензиях из печени, селезенки или лимфатических узлов рекомендуется следующая стратегия гатинга с помощью проточной цитометрии: Идентификация живых клеток с помощью набора для окрашивания Живых / Мертвых Поправимых Aqua Dead Cell. Далее, затвор на клетках печени, которые являются CD45+ (PerCP, клон RA3-6B2), и затвор CD4+ клеток (FITC, cloneGK1.5) из затвора CD45+. Из клеток CD4+ определите процентное содержание клеток CD25+ (PE, клон 7D4) и FoxP3+ (APC, клон 3G3).
  4. Гистологический анализ тканей печени на гепатит
    1. На 21-й день зафиксируйте участки печени (толщиной 5 мкм) в 10% нейтральном буферизованном формалине и окрашивание гематоксилином и эозином.
    2. Определите оценки гистологии сначала при низком энергопотреблении (40X) в среднем в 2 просмотрах и подтвердите при 64X. Оцените участки тканей следующим образом: Степень 0 = отсутствие воспаления или некроза; Степень 1 = незначительное дольковое воспаление без некроза; Степень 2 = дольковое воспаление, охватывающее <50% участка; Степень 3 = дольковое воспаление, включающее ≥ 50% участка; и 4 степень = воспаление с некрозом.
  5. Определение уровня тканевых цитокинов в селезенке и печени.
    1. На 14-й или 21-й день гомогенизируют образцы печени или селезенки (1 г) от каждой мыши в 1 мл RPMI/2% FCS до однородной массы с использованием общего лабораторного гомогенизатора на средней среде. Держите образец холодным на льду.
    2. Центрифугируйте гомогенат в течение 15 мин при 1455 х г при 4 °C с помощью холодильной настольной центрифуги. Заморозьте супернатант и храните при температуре -80 °C до готовности к использованию. Уровни цитокинов и хемокинов могут быть измерены с помощью коммерческих наборов ИФА в соответствии с инструкциями по набору. Стандартизируйте уровни цитокинов путем преобразования уровней (в мл или мкл) в пг/г ткани.
  6. Обнаружение сывороточных антител к CYP2E1, эпитопу CYP2E1 JHDN5 и метаболиту препарата TFA.
    1. На 14 или 21 день успокаивайте мышей 40-60 мг/кг кетамина, смешанного с 4-6 мг/кг ксилазина. Подтвердите надлежащую глубину анестезии, наблюдая снижение мышечного тонуса и отсутствие реакции на болезненные раздражители, такие как защемление пальца ноги (рефлекс отмены), в дополнение к потере корректирующих рефлексов и потере пальпебральных рефлексов. Используйте иглу весом 25 г, прикрепленную к туберкулиновому шприцу, и подойдите к сердцу, медленно продвигая иглу в грудную полость под ребрами и сразу же в сторону к мечевидному отростку. Собирают кровь с помощью внутрисердечной пункции.
    2. Как только кровь собрана, дайте ей свернуться при комнатной температуре. Центрифугировать образцы крови при 295 х г в течение 20 мин при комнатной температуре. Осторожно удалите сыворотки, аликвотируйте сыворотки и заморозьте при -20 °C.
    3. Применяйте 100 мкл тестовых антигенов CYP2E1, JHDN5 или TFA-ovalbumin (OVA) (5 мкг/мл в PBS) на 96 пластин скважин в течение не менее 18 ч при 4 °C в течение ночи. На следующий день помойте тарелки с буфером для стирки (PBS/2%FCS), 2 цикла (по 4 промывки).
    4. Применяют 100 мкл мышиных сывороток (1:100) в PBS/2% FCS в трех экземплярах на пластинах и инкубируют при комнатной температуре в течение 2 ч. Через 2 ч промыть пластины с помощью промывочного буфера, как описано на этапе 2.6.2.
    5. Добавьте 100 мкл щелочной фосфатазы (AKP)-козьего антимышечного IgG, AKP-крысиного антимышечного IgG1 или AKP-крысиного антимышечного IgG2a вторичных антител (1:1000) в течение 2 ч с последующей стадией промывки 1 цикла с буфером промывки и 1 цикла с PBS. Обнаруживайте антитела с помощью набора субстратов AKP и измеряйте при OD 405 нм каждые 15 минут с помощью спектрофотометра. TFA обычно развивается полностью за 15 мин, в то время как CYP2E1 и эпитоп CYP2E1 могут развиваться от 30 до 60 мин7.
  7. Исследования развития JHDN5 IgG-индуцированного окислительного стресса in vitro.
    1. Используя 12 пластин скважины, инкубируйте 106 терминально дифференцированных печеночных клеток на лунку на покрытых фибронектином покровных скольжениях в 1000 мкл среды Williams E, дополненной глютамином и общей добавкой (см. Таблицу материалов) при 37 °C, 5% CO2, 95% влажности в течение 7 дней, как рекомендуется для максимизации активности CYP2E1.
    2. Добавьте JHDN5 IgG (1:40) или мышиный IgG (1:1000) в отдельные лунки и инкубируйте в течение 2 ч при 37 °C, 5% CO2, 95% влажности. Гибридома сывороток была очень разбавленной. Добавьте темно-красный флуоресцентный детектор антител (см. Таблицу материалов) еще на 30 мин во все скважины.
    3. Промывайте колодцы 3x с 1 мл PBS в темноте. Зафиксируйте клетки в 3,7% формальдегиде в течение 10 мин. Обследование методом конфокальной микроскопии в течение 24 ч.
  8. Исследования совместной локализации JHDN5 IgG с внутриклеточными органеллами, такими как митохондрии in vitro.
    1. Чтобы продемонстрировать колокализацию JHDN5 IgG с митохондриями, разреженно культивируют (~30% слияния) терминально дифференцированные печеночные клетки на покрытых фибронектином покровных слипах в течение 7 дней в свободной от красителей среде Уильямса E, дополненной, как описано на этапе 2.7.
    2. После определения правильных длин волн поглощения добавляют зеленый флуоресцентный, 488 нм-конъюгированный мышиный IgG или JHDN-5 (1:100) и красный флуоресцентный, 594-сопряженный мито-трекер красный (1:100) в течение 2 ч (37 °C), 5% CO2, 95% влажности.
    3. Установите помеченные фибронектином крышки с помощью антивядающего реагента с DAPI и исследуйте с помощью конфокальной микроскопии.

3. Общие протокольные примечания

  1. Используйте инструменты нефармацевтического класса, когда соединения недоступны в рецептуре для клинического применения. Однако получите каждый из этих инструментов от надежных коммерческих поставщиков, указанных в этом методе. Всегда используйте химические вещества, которые соответствуют спецификациям, определенным Комитетом по аналитическим реагентам Американского химического общества, по крайней мере, уровня реагента. Для наших методов по возможности используйте аналитические реагенты уровня класса.
  2. Следуйте строгой асептической технике для формулирования белков, измененных TFA, чтобы предотвратить загрязнение, которое может негативно повлиять на благополучие животных или интерпретацию данных.
  3. Храните и используйте нефармацевтические составы в течение времени, в течение которого состав будет оставаться мощным, в соответствии с имеющейся технической информацией. Хранить CFA при комнатной температуре CYP2E1 и его эпитопы при -20 или -80 °C. Хранить TFA-измененные белки при -80 °C и довести до 4 °C до эмульгирования CFA. Храните измененные белки TFA при -80 °C и храните в аликвотах, чтобы предотвратить повторные циклы замораживания-оттаивания.

Результаты

График иммунизации, используемый для индуцирования DIH, показанный на рисунке 1 , представляет собой две иммунизации, необходимые в основании шеи (день 0) и основании хвоста (день 7). На рисунке 2 показаны репрезентативные данные о пролиферации, полученные на...

Обсуждение

Сила этого протокола заключается в его воспроизводимости; поэтому крайне важно придерживаться предложенных шагов. Формула иммуногена может быть барьером для некоторых; однако мы воспроизвели нашу модель, используя эпитоп, описанный в нашем документе, который устраняет необходимость ...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Д-р Нджоку хотел бы поблагодарить д-ра Ноэля Р. Роуза, доктора медицинских наук, за его руководство и проницательные дискуссии, которые привели к формулированию этой модели.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
0.1% 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS)ThermoFisher28997
AKP Substrate KitBioRad172-1063
BALB/c miceJackson
CellTrace™ CFSE Cell Proliferation KitThermoFisherC34554
CFA H37RaBecton Dickinson (Difco Bacto)231131
FcR Blocking reagentMilteyi130-092-575
General supplementThermoFisherHPRG770
HepaRG™ cells cryopreservedThermoFisherHPR GC10
Live/Dead Fixable Aqua Dead Cell stain kit ThermoFisherL34965
NaHC03Millipore SigmaS5761
Percoll®Millipore SigmaP1644-1L
Pertussis ToxinList Biologicals180
Phosphate Buffered Saline pH 7.4Various
Pierce™ Protease Inhibitor Mini Tablets, EDTA FreeThermoFisher88666
Potassium HydroxideJT Baker3140-01
S-ethyltrifluorothioacetate (S-ETFA)Millipore Sigma177474
Slide-a-lyzer dialysis cassettes (10 K, 12 ml)ThermoFisher66810
UltraPure™ SDS Solution, 10%ThermoFisher24730020
Williams Media E, no phenol redThermoFisherA1217601

Ссылки

  1. Castiella, A., Zapata, E., Lucena, M. I., Andrade, R. J. Drug-induced autoimmune liver disease: A diagnostic dilemma of an increasingly reported disease. World J. Hepatology. 6 (4), 160-168 (2014).
  2. Bjornsson, E. S., Bergmann, O. M., Bjornsson, H. K., Kvaran, R. B., Olafsson, S. Incidence, presentation, and outcomes in patients with drug-induced liver injury in the general population of Iceland. Gastroenterology. 144 (7), 1419-1425 (2013).
  3. Castiella, A., Lucena, M. I., Zapata, E. M., Otazua, P., Andrade, R. J. Drug-induced autoimmune-like hepatitis: a diagnostic challenge. Digestive Diseases and Sciences. 56 (8), 2501-2502 (2011).
  4. Czaja, A. J. Drug-induced autoimmune-like hepatitis. Digestive Diseases and Sciences. 56 (4), 958-976 (2011).
  5. Pohl, L. R., Thomassen, D., Pumford, N. R., Butler, L. E., Satoh, H., Ferrans, V. J., Perrone, A., et al. Hapten carrier conjugates associated with halothane hepatitis. Advances in Experimental Medicine and Biology. 283, 111-120 (1991).
  6. Njoku, D. B., Talor, M. V., Fairweather, D., Frisancho-Kiss, S., Odumade, O. A., Rose, N. R. A novel model of drug hapten-induced hepatitis with increased mast cells in the BALB/c mouse. Experimental and Molecular Pathology. 78 (2), 87-100 (2005).
  7. Cottagiri, M., Nyandjo, M., Stephens, M., Mantilla, J., Saito, H., Mackay, I. R., et al. In drug-induced, immune-mediated hepatitis, interleukin-33 reduces hepatitis and improves survival independently and as a consequence of FoxP3+ T-cell activity. Cellular and Molecular Immunology. , (2018).
  8. Lohse, A. W., Manns, M., Dienes, H. P., Meyer zum Buschenfelde, K. H., Cohen, I. R. Experimental autoimmune hepatitis: disease induction, time course and T-cell reactivity. Hepatology. 11 (1), 24-30 (1991).
  9. McCarthy, E. K., Vakos, A., Cottagiri, M., Mantilla, J. J., Santhanam, L., Thomas, D. L., et al. Identification of a Shared Cytochrome p4502E1 Epitope Found in Anesthetic Drug-Induced and Viral Hepatitis. mSphere. 3 (5), (2018).
  10. Cho, J., Kim, L., Li, Z., Rose, N. R., Talor, M. V., Njoku, D. B. Sex bias in experimental immune-mediated, drug-induced liver injury in BALB/c mice: suggested roles for Tregs, estrogen, and IL-6. PLoS. One. 8 (4), 61186 (2013).
  11. Satoh, H., Gillette, J. R., Takemura, T., Ferrans, V. J., Jelenich, S. E., Kenna, J. G., et al. Investigation of the immunological basis of halothane-induced hepatotoxicity. Advances in Experimental Medicine and Biology. 197, 657-673 (1986).
  12. Eliasson, E., Kenna, J. G. Cytochrome P450 2E1 is a cell surface autoantigen in halothane hepatitis. Molecular Pharmacology. 50 (3), 573-582 (1996).
  13. Bourdi, M., Chen, W., Peter, R. M., Martin, J. L., Buters, J. T., Nelson, S. D., et al. Human cytochrome P450 2E1 is a major autoantigen associated with halothane hepatitis. Chemical Research in Toxicology. 9 (7), 1159-1166 (1996).
  14. Njoku, D. B., Li, Z., Washington, N. D., Mellerson, J. L., Talor, M. V., Sharma, R., et al. Suppressive and pro-inflammatory roles for IL-4 in the pathogenesis of experimental drug-induced liver injury. European Journal of Immunology. 39 (6), 1652-1663 (2009).
  15. Aithal, G. P., Ramsay, L., Daly, A. K., Sonchit, N., Leathart, J. B., Alexander, G., et al. Hepatic adducts, circulating antibodies, and cytokine polymorphisms in patients with diclofenac hepatotoxicity. Hepatology. 39 (5), 1430-1440 (2004).
  16. Higuchi, S., Kobayashi, M., Yoshikawa, Y., Tsuneyama, K., Fukami, T., Nakajima, M., et al. IL-4 mediates dicloxacillin-induced liver injury in mice. Toxicology Letters. 200 (3), 139-145 (2011).
  17. Rubtsova, K., Marrack, P., Rubtsov, A. V. Sexual dimorphism in autoimmunity. Journal of Clinical Investigation. 125 (6), 2187-2193 (2015).
  18. Satoh, H., Fukuda, Y., Anderson, D. K., Ferrans, V. J., Gillette, J. R., Pohl, L. R. Immunological studies on the mechanism of halothane-induced hepatotoxicity: immunohistochemical evidence of trifluoroacetylated hepatocytes. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 233 (3), 857-862 (1985).
  19. Habeeb, A. F. Determination of free amino groups in proteins by trinitrobenzenesulfonic acid. Analytical Biochemistry. 14 (3), 328-336 (1966).
  20. Christen, U., Burgin, M., Gut, J. Halothane metabolism: immunochemical evidence for molecular mimicry of trifluoroacetylated liver protein adducts by constitutive polypeptides. Molecular Pharmacology. 40 (3), 390-400 (1991).
  21. Christen, U., Quinn, J., Yeaman, S. J., Kenna, J. G., Clarke, J. B., Gandolfi, A. J., et al. Identification of the dihydrolipoamide acetyltransferase subunit of the human pyruvate dehydrogenase complex as an autoantigen in halothane hepatitis. Molecular mimicry of trifluoroacetyl-lysine by lipoic acid. European Journal of Biochemistry. 223 (3), 1035-1047 (1994).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

159P450 2EFoxp3 Tregs

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены