Induzione dell'epatite autoimmune indotta da farmaci in topi BALB / c per lo studio dei suoi meccanismi patogenetici

Riepilogo

Descriviamo un modello di epatite traslazionale di immunizzazione in vivo nei topi BALB / c che può essere utilizzato per studiare la patogenesi dell'epatite autoimmune indotta da farmaci, comprese le differenze di sesso osservate in questa malattia. Descriveremo come questo modello dimostra analisi riproducibili utilizzando tecniche sperimentali in vivo e in vitro.

Abstract

L'epatite autoimmune indotta da farmaci (DIH) è il più comune processo di ipersensibilizzazione indotta da farmaci epatici osservato in circa il 9-12% dei pazienti con epatite autoimmune. La stragrande maggioranza dei pazienti con DIH sono donne. I meccanismi alla base di queste differenze sessuali nella prevalenza non sono chiari a causa della scarsità di modelli animali che imitano la malattia umana. Anche così, i meccanismi sottostanti sono ampiamente ritenuti associati agli aplotipi dell'antigene leucocitario umano e agli ormoni sessuali. Al contrario, utilizzando un modello murino DIH, abbiamo scoperto che le cellule T CD4+ avviate da IL-4 dirette contro un epitopo del citocromo P450 2E1 inducono l'afflusso di neutrofili, macrofagi e mastociti nel fegato di topi BALB/ c femminili. Utilizzando questo modello, abbiamo anche dimostrato che le cellule T regolatorie FoxP3+ indotte da IL-33 conferiscono protezione contro il DIH nei topi femmina e maschio. Questo modello di DIH è indotto immunizzando i topi con un epitopo del CYP2E1 che è stato alterato covalentemente con un metabolita del farmaco che è stato associato al DIH. Questo epitopo è riconosciuto dai pazienti con DIH. Il nostro metodo induce epatite e autoanticorpi robusti e riproducibili che possono essere utilizzati per studiare la patogenesi della DIH. Mentre gli studi in vivo possono causare dolore e angoscia indebiti nei topi se eseguiti in modo improprio, il vantaggio di un modello in vivo è la capacità di valutare la patogenesi della malattia in un gran numero di topi. Inoltre, gli effetti biologici delle proteine epatiche alterate possono essere studiati utilizzando procedure invasive. L'aggiunta di studi in vitro al disegno sperimentale consente una rapida ripetizione e analisi meccanicistica a livello cellulare. Pertanto, dimostreremo il nostro protocollo modello e come può essere utilizzato per studiare i meccanismi in vivo e in vitro del DIH.

Introduzione

Lo scopo di questo metodo è quello di descrivere un modello murino di epatite autoimmune indotta da farmaci che si sviluppa in vivo e dimostrare come può essere utilizzato per indagare le basi molecolari, immunologiche e genetiche di questa malattia. L'obiettivo a lungo termine dei nostri studi è quello di scoprire i meccanismi responsabili dello sviluppo di infiammazione e lesioni epatiche croniche studiando la DIH in pazienti sensibili. Le malattie del fegato e la cirrosi costituiscono la sesta causa più comune di morte negli adulti di età compresa tra 25 e 64 anni. La DILI idiosincratica, a volte indicata come epatite autoimmune indotta da farmaci (DIH), è la terza causa più comune di insufficienza epatica acuta negli Stati Uniti. La DIH è il più comune processo di ipersensibilizzazione indotta da farmaci epatici osservato in circa il 9-12% dei pazienti con epatite^{autoimmune 1}. La stragrande maggioranza dei pazienti con DIH sono donne ^2,3,4. Un tipo di DIH si sviluppa in individui sensibili dopo la somministrazione di anestetici volatili alogenati come isoflurano, sevoflurano, desflurano o alotano. Questi anestetici si legano covalentemente alle proteine del fegato con prodotti reattivi del loro metabolismo, creando così nuovi autoantigeni in grado di suscitare risposte allergiche o autoimmuni⁵.

Lo studio dei meccanismi patogenetici coinvolti nello sviluppo dell'anestetico e di qualsiasi forma di DIH è stato precedentemente ostacolato dalla mancanza di un modello animale che imiti da vicino l'induzione della malattia umana. Abbiamo sviluppato un modello murino sperimentale di DIH con caratteristiche simili al DILI immuno-mediato nei pazienti. L'epatite è indotta dall'immunizzazione con uno dei due autoantigeni che sono stati modificati covalentemente dal metabolita del cloruro di trifluoroacetile (TFA) che si forma in seguito al metabolismo ossidativo dell'anestetico dall'enzima citocromo P450 2E1 (CYP2E1)⁵. Un autoantigene è la frazione epatica citosolica S100 epatica, che è una miscela di diverse proteine⁶, e il secondo autoantigene è un epitopo del CYP2E1 che viene riconosciuto dai sieri di pazienti con DILI⁷ immuno-mediato anestetico. Utilizzando topi BALB/c, che sono relativamente resistenti all'epatite autoimmune sperimentale, distinguiamo il nostro modello dal modello di immunizzazione indotta da S100 dell'epatite autoimmune nei topi C57Bl/ 6J⁸.

A causa delle sue diverse presentazioni cliniche, DIH è difficile da studiare nei pazienti. Modelli sperimentali traslazionali offrono la capacità di valutare la patogenesi della malattia in vivo e in vitro. Allo stato attuale, non ci sono altri metodi alternativi per indurre DIH che esaminano completamente in vivo o in vitro risposte immunitarie adattive o innate senza l'uso di animali. Inoltre, poiché la trifluoroacetilazione di S-100 o dell'epitopo cyp2E1 non sembra produrre un immunogeno irritante e stiamo inducendo DIH mediante immunizzazione con proteine alterate da TFA, questi animali non riceveranno etere, alcun anestetico alogenato, barbiturico o alcol prima dell'immunizzazione o di altre procedure, considerando che questi agenti possono alterare i parametri che stiamo studiando. Anche così, abbiamo ridotto il nostro utilizzo del mouse utilizzando la simulazione al computer per confermare le preferenze di legame del nostro epitopo^{CYP2E1 9} scoperto e abbiamo rispecchiato il DIH umano che implica il sesso femminile dimostrando che i topi BALB / c femminili sviluppano un DIH¹⁰ più grave.

Nonostante le diverse presentazioni di DIH nei pazienti e le sfide nello studio della malattia clinica, la modifica post-traduzionale delle proteine native da parte dei metaboliti reattivi dei farmaci è un meccanismo chiave accettato nella patogenesi DIH che segue gli anestetici alogenati¹¹. Gli investigatori accettano anche che il CYP2E1 è un autoantigene importante in questo processo^12,13. Il ruolo delle cellule CD4+T interleuchinate (IL)-upregolate che riconoscono un CYP2E1 post-traduzionalmente modificato e altre proteine epatiche è un iniziatore accettato del DIH anestetico attirando neutrofili, eosinofili e mastociti nel fegato¹⁴, e questo meccanismo è stato confermato in molte forme di DIH ^15,16. Le cellule CD4+CD25+T indotte che esprimono FoxP3 (Tregs) riducono la gravità del DIH e le carenze relative di queste cellule nella milza peggiorano il DIH ^10,7. Pertanto, la maggior parte dei progressi nella comprensione del DIH sono stati resi possibili utilizzando modelli murini in vivo per valutare i meccanismi genetici, metabolici e immunologici del DIH sia in vivo che in vitro.

Poiché noi e altri ricercatori abbiamo scoperto ruoli per IL-4, neutrofili ed eosinofili nell'inizio della DIH utilizzando diversi modelli murini, riteniamo che questa osservazione supporti la nostra tesi che, indipendentemente dal modello DIH utilizzato, l'epatite e le lesioni sono indotte da IL-4. La forza del nostro protocollo risiede nell'utilizzo della metodologia in vivo, sia maschi che femmine, e nella ripetizione di istologia, saggi di proliferazione delle cellule T CD4 + e citochine. Il punto di forza del nostro uso di studi in vitro è che riducono il numero di topi necessari fornendo al contempo la metodologia per isolare le interazioni cellulari che guidano il DIH. Raccomandiamo l'uso di topi maschi e femmine perché questo riduce la possibilità di pregiudizi inconsci nell'interpretazione dei risultati e rafforza il potenziale di traduzione dei nostri studi poiché l'incidenza, la prevalenza e la gravità della DIH sono più elevate nelle donne¹⁷. Raccomandiamo che i topi siano ottenuti da un unico fornitore; tuttavia, se ciò non è possibile, ottenere controlli di cucciolata o topi selvatici dallo stesso fornitore dei topi geneticamente modificati.

Protocollo

Tutte le procedure sono state approvate dal comitato per la cura e l'uso degli animali.

1. Trifluoroacetilazione di proteine citosoliche epatiche S-100 o di un epitopo del CYP2E1

NOTA: In primo luogo, preparare l'epitopo trifluoroacetilato S100 (TFA-S100) e trifluoroacetilato CYP2E1 (TFA-JHDN5). Perché le proteine S100 singeniche sono necessarie per le vaccinazioni e i topi BALB / c sono necessari per produrre l'immunogeno. La preparazione produce una grande quantità di immunogeno; quindi, anticipa di eseguire questa porzione circa quattro volte l'anno. Un metodo identico sarà utilizzato per realizzare il TFA-JHDN5. L'epitopo CYP2E1 (JHDN5), GII/ FNN/ GPT/ WKD/ IRR/ FSL/ TTL, può essere sequenziato o acquistato.

1. Isolamento della frazione S100 del fegato.
   1. A seguito della sedazione di 5 – 10 topi BALB/c con 40-60 mg/kg di ketamina miscelata con 4 - 6 mg/kg di xilazina, confermare la corretta profondità dell'anestesia osservando una riduzione del tono muscolare e nessuna risposta a stimoli dolorosi, come un pizzico di punta (riflesso di astinenza), oltre alla perdita dei riflessi di raddrizzamento e alla perdita dei riflessi palpebrali.
   2. Usando le forbici microchirurgiche, esporre il contenuto intra-addominale usando un'incisione della linea mediana e fare un piccolo taglio nella vena cava inferiore per rimuovere il sangue.
   3. Posizionare un angiocatetere calibro 24 nella vena porta e perfondere il fegato di 10 ml/min con 40 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) pH 7,4 a bagnomaria a 4 °C. Rimuovere e pesare i fegatini raggruppati e tagliarli a pezzetti (10 – 15 mm).
      NOTA: L'eutanasia è indotta dall'iniezione intraperitoneale di ketamina/xilazina aggiuntiva (80 mg/kg: 8 mg/kg), seguita da lussazione cervicale e apertura della cavità toracica per collassare i polmoni. Questo metodo fornisce il minimo dolore e disagio agli animali. Questo metodo è coerente con le raccomandazioni del gruppo di esperti scientifici sull'eutanasia dell'American Veterinary Medical Association.
   4. Aggiungere 4 volte il peso del tampone di omogeneizzazione del saccarosio (250 mM) -TRIS (10 mM)- EDTA (1 mM) (pH 7,4) integrato con compresse cocktail con inibitore completo della proteasi (vedere Tabella dei materiali) secondo le raccomandazioni dei produttori. Omogeneizzare in un tubo di polipropilene da 15 mL, utilizzando un omogeneizzatore tissutale di laboratorio generale a media velocità su ghiaccio fino a che liscio. Omogeneizzare sul ghiaccio per evitare che il tessuto si scaldi durante l'omogeneizzazione.
   5. Centrifugare gli omogeneizzati epatici a 1500 x g per 10 minuti e poi versare il surnatante. Centrifugare il surnatante per 1 ora a 100.000 x g. Congelare a scatto il surnatante e conservare a -80 °C. Il surnatante è il citosolico S-100.
2. Trifluoroacetilazione di S100 e JHDN5
   NOTA: La trifluoroacetilazione dei gruppi ε-amminici dei residui di lisina di S-100 verrà eseguita secondo la procedura di Satoh¹⁸. Tutte le parti di questo esperimento, ad eccezione degli ultimi giorni di dialisi, vengono eseguite nella cappa aspirante.
   1. Determinare la concentrazione proteica totale del citosolico S-100 utilizzando il test dell'acido bicinchoninico (bcA assay)⁷. Diluire 20 mg di BALB/c mouse S100 o JHDN5 a 10 mL con dH₂O in un matraccio Erlenmeyer da 50 mL. Regolare il pH a 10 con 1N KOH.
   2. Aggiungere 4,7 mmolo di S-etiltrifluorotioacetato (S-ETFA) alla soluzione. Mantenere il pH tra 9,9 – 10,0 con 1N KOH somministrando KOH in goccioline per circa 1 ora. Registrare il volume totale di KOH per ogni reazione.
   3. Trasferire le soluzioni in cassette di dialisi separate (non riempire eccessivamente). Dializzare le cassette per 72 h contro 4 L di dH₂O con tre cambi al giorno. Dopo la dialisi, registrare il volume finale di TFA-S100 o TFA-JHDN5 e quindi aliquota in tubi etichettati. Surgelare e conservare a –80 °C.
   4. Una concentrazione stimata è determinata dividendo la quantità iniziale di S100 o JHDN5 (in mg) per il volume finale dopo dialisi (mL). Per determinare la modifica percentuale della proteina nativa¹⁹, diluire 1,0 mg di ciascuna proteina nativa e alterata da TFA (se la concentrazione finale è superiore a 1,0 mg) a 1,0 ml con dH₂O in provette separate e preparare un bianco usando 1,0 ml di dH₂O. Se la concentrazione della proteina alterata dal TFA è inferiore a 1,0 mg, non diluire
      1. Per separare i pozzetti di una piastra da 96 pozzi, aggiungere 50 μL delle proteine vuote, native e alterate. Aggiungere 50 μL di NaHCO_{3 al} 4% seguito da 50 μL di acido solfonico 2,4,6-trinitrobenzene allo 0,1% di acido solfonico a ciascun pozzetto.
      2. Incubare la piastra a 40 °C per 2 ore. Dopo l'incubazione, aggiungere 50 μL di 10 % SDS a ciascun pozzetto seguito da 25 μL di 1N HCl.
      3. Leggere a OD di 334 nm e quindi registrare l'assorbanza di ciascun composto da 200 – 600 nm per confermare il calo caratteristico dell'assorbanza a 334 nm. Calcola la modifica percentuale dei residui di lisina da parte del TFA, usando la seguente formula:
         

2. Immunizzazione dei topi per indurre l'epatite

NOTA: DIH è modellato in topi BALB/c mediante vaccinazioni con proteine citosoliche epatiche che sono state alterate covalentemente dal cloruro di trifluoracetile (TFA), un farmaco-metabolita modello, TFA-S100⁶ o un epitopo del CYP2E1 alterato covalentemente da TFA⁹, TFA-JHDN5 che induce epatite, cellule T autoreattive e autoanticorpi CYP2E1. I topi mostrano una fase di attivazione splenica 2 settimane dopo l'immunizzazione iniziale e una fase epatica di 3 settimane caratterizzata da infiammazione granulocitica. I topi FEMMINA BALB / c sono più suscettibili dei maschi all'epatite in questo modello.

1. Il giorno 0, immunizzare per via sottocutanea topi BALB/c di 6-8 settimane alla base del collo con 200 μg di TFA-S100 o 100 μg di TFA-JHDN5 emulsionati in volumi uguali di coadiuvante di Freund completo (CFA). Il giorno 0, immunizzare i topi con 50 ng di tossina pertosse, per via intramuscolare in una delle zampe posteriori. Il giorno 7, immunizzare i topi per via sottocutanea alla base della coda con 200 μg di TFA-S100 o 100 μg di TFA-JHDN5 emulsionati in volumi uguali di CFA per garantire che ogni topo riceva due iniezioni dello stesso immunogeno.
   NOTA: I topi vengono monitorati ogni ora per le prime 6 ore successive all'immunizzazione e poi almeno due volte al giorno per una settimana. Se i topi mostrano segni di dolore o angoscia, come postura curva o pelliccia arruffata, gli analgesici devono essere somministrati in conformità con l'ACUC locale. Se si nota dolore o angoscia significativi, i topi devono essere valutati da un veterinario per determinare se l'eutanasia è necessaria.
2. Determinazione delle risposte immunitarie delle cellule T CD4+ a intere autoproteine, epitopi di autoproteine o TFA hapten utilizzando la citometria a flusso
   1. Dopo la sedazione dei topi con 40-60 mg/kg di ketamina miscelata con 4-6 mg/kg di xilazina tramite iniezione intraperitoneale, confermare la corretta profondità di anestesia come descritto nel punto 1.1.1 e quindi identificare la milza dopo aver esposto la cavità intra-addominale utilizzando forbici microchirurgiche. Tagliare la milza al peduncolo e metterla in una capsula di Petri con PBS/2% siero fetale di vitello (FCS).
      NOTA: L'eutanasia sarà indotta nei topi mediante iniezione intraperitoneale di ketamina/xilazina aggiuntiva (80 mg/kg: 8 mg/kg), seguita da lussazione cervicale e apertura della cavità toracica per collassare i polmoni. Questo metodo fornisce il minimo dolore e disagio agli animali. Questo metodo è coerente con le raccomandazioni del gruppo di esperti scientifici sull'eutanasia dell'American Veterinary Medical Association.
   2. Rilasciare le celle utilizzando vetrini di vetro smerigliato e trasferirle in un tubo conico in polipropilene da 50 ml. Lavare con PBS/2% FCS portando il volume fino a 50 ml e centrifugando a 335 x g utilizzando una centrifuga refrigerata da banco. Versare il surnatante e ripetere questo passaggio.
   3. Rimuovere i globuli rossi utilizzando 1 mL di tampone di lisatura ACK per 1 minuto e portare il volume fino a 50 ml con PBS/2% FCS. Centrifugare a 335 x g e versare il surnatante.
   4. Contare le celle. Etichettare le celle con CFSE per 30 minuti sul ghiaccio al buio, secondo le istruzioni del produttore. Sospendere le sospensioni a cella singola in 6 piastre di pozzetto da 3x10⁶ celle/mL per pozzetto in PBS/2% FCS.
   5. Stimolare le cellule marcate con CYP2E1, JHDN5 o TFA-OVA (10 μg/mL) per 72 ore a 37 °C in 5% CO₂, 95% aria (umidificata). Dopo l'incubazione, colorare le cellule con CD4-APC (1:100) per 30 minuti sul ghiaccio e analizzarle mediante citometria a flusso entro 3 giorni.
   6. Utilizzare la seguente strategia di gating per identificare le cellule CD4 + CFSE +: le cellule CD4 + CFSE + saranno identificate dalle cellule vive gated e visualizzate come istogrammi di cellule proliferanti.
3. Isolamento di cellule immunitarie infiltrate da topi immunizzati.
   1. Per isolare le cellule immunitarie infiltrate nel fegato il giorno 14 o il giorno 21, anestetizzare i topi mediante iniezione intraperitoneale con 40-60 mg/kg di ketamina miscelata con 4-6 mg/kg di xilazina e confermare la corretta profondità dell'anestesia come descritto nel punto 1.1.1. Dopo la laparotomia utilizzando un'incisione della linea mediana fatta con micro forbici chirurgiche come descritto al punto 1.1.2, cannulare la vena porta con un ago calibro 25 e quindi tagliare la vena cava inferiore sotto le vene renali.
   2. Perfondere ciascun fegato ad una portata di 10 ml/min con 40 mL di PBS a bagnomaria a 37 °C. Dopo la perfusione, usando le forbici microchirurgiche, tagliare il fegato al peduncolo epatico, rimuovere la cistifellea e quindi tagliare il fegato al laccio.
   3. Interrompere il fegato su un setaccio in acciaio inossidabile a rete utilizzando un pestello di siringa sterile da 20 ml e PBS freddo. Filtrare la sospensione cellulare risultante in tubi centrifughi pre-sterilizzati da 50 mL utilizzando uno schermo a 300 maglie. Portare ogni sospensione a 50 ml utilizzando PBS freddo e quindi lavare la sospensione mediante centrifugazione per 10 minuti a 370 x g.
   4. Scartare il surnatante e quindi raggruppare ogni pellet mediante trattamento in nuovi tubi da 50 ml (si consiglia un tubo per topo; tuttavia, se i campioni vengono raggruppati, si consigliano 2-4 pellet / tubo). Sospendere il pellet aggregato in 45 mL Percoll 35% (in PBS) e 100 UI/ mL di eparina.
   5. Ruotare ogni tubo a 500 x g per 10 minuti a 20 °C. Scartare il surnatante e sospendere il pellet in 5 mL di PBS e quindi aggiungere 1 mL di tampone di lisi ACK a ciascun pellet per 10 minuti su ghiaccio.
   6. Portare ogni tubo a 50 ml con PBS e lavare per centrifugazione per 10 minuti a 370 x g. Scartare il surnatante e quindi lavare le cellule con PBS/2% FCS mediante centrifugazione per 10 minuti a 370 x g. Contare le celle.
   7. Analisi del tipo di cellula mediante citometria a flusso
      NOTA: Ecco un esempio di come è possibile rilevare Foxp3+Tregs indotti.
      1. Incubare 1x10⁶ cellule con reagente bloccante FcR e colorazione con 1:100 diluizioni di CD4-FITC, CD25-PE e CD45-PerCP per 30 minuti su ghiaccio. Quindi, macchiare le cellule intracellulari con FoxP3-APC.
      2. Fissare le cellule con 250 μL di tampone di fissazione (vedere Tabella dei materiali) e conservare a 4 °C fino all'analisi mediante citometria a flusso entro 3 giorni.
      3. La seguente strategia di gating è raccomandata al fine di rilevare Foxp3 + Tregs indotti in sospensioni monocellulari da fegato, milza o linfonodi utilizzando la citometria a flusso: Identificare le cellule vive utilizzando il kit di macchie Di cellule morte Aqua Fixable Live / Dead. Successivamente, gate sulle cellule epatiche che sono CD45 + (PerCP, clone RA3-6B2) e gate cd4 + cellule (FITC, cloneGK1.5) dal gate CD45 +. Dalle celle CD4+, identificare le percentuali di cellule CD25+(PE, clone 7D4) e FoxP3+ (APC, clone 3G3).
4. Analisi istologica dei tessuti epatici per l'epatite
   1. Il giorno 21, fissare le sezioni epatiche (5 μm di spessore) in formalina tamponata neutra al 10% e macchiare con ematossilina ed eosina.
   2. Determinare i punteggi istologici prima a bassa potenza (40X) in una media di 2 visualizzazioni e confermare a 64X. Segna le sezioni tissutali come segue: Grado 0 = nessuna infiammazione o necrosi; Grado 1= infiammazione lobulare minore senza necrosi; Grado 2 = infiammazione lobulare che coinvolge <50% della sezione; Grado 3 = infiammazione lobulare che coinvolge ≥ 50% della sezione; e Grado 4 = infiammazione con necrosi.
5. Determinazione dei livelli di citochine tissutali nella milza e nel fegato.
   1. Il giorno 14 o il giorno 21, omogeneizzare i campioni di fegato o milza (1 g) di ciascun topo in 1 ml di RPMI/2% FCS fino a che liscio utilizzando un omogeneizzatore di laboratorio generale su impostazione media. Mantenere il campione freddo sul ghiaccio.
   2. Centrifugare l'omogeneizzato per 15 min a 1455 x g a 4 °C utilizzando una centrifuga desktop refrigerata. Congelare a scatto il surnatante e conservare a -80 °C fino al momento dell'uso. I livelli di citochine e chemochine possono essere misurati con kit ELISA commerciali, secondo le istruzioni del kit. Standardizzare i livelli di citochine convertendo i livelli (in mL o μL) in pg/g di tessuto.
6. Rilevazione di anticorpi sierici contro il CYP2E1, l'epitopo DEL CYP2E1 JHDN5 e il metabolita del farmaco TFA.
   1. Nei giorni 14 o 21, sedare i topi con 40-60 mg / kg di ketamina mescolata con 4-6 mg / kg di xilazina. Confermare la corretta profondità dell'anestesia osservando una riduzione del tono muscolare e nessuna risposta a stimoli dolorosi, come un pizzico della punta (riflesso di astinenza), oltre alla perdita dei riflessi di raddrizzamento e alla perdita dei riflessi palpebrali. Utilizzare un ago da 25 G attaccato a una siringa di tubercolina e avvicinarsi al cuore facendo avanzare lentamente l'ago nella cavità toracica sotto le costole e immediatamente lateralmente al processo xifoide. Raccogliere il sangue usando la puntura intracardiaca.
   2. Una volta raccolto il sangue, lasciarlo coagulare a temperatura ambiente. Centrifugare i campioni di sangue a 295 x g per 20 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere con cautela i sieri, aliquotare i sieri e congelare a scatto a -20 °C.
   3. Applicare 100 μL di antigeni di prova CYP2E1, JHDN5 o TFA-ovalbumina (OVA) (5 μg/mL in PBS) a 96 piastre di pozzetto per almeno 18 ore a 4 °C durante la notte. Il giorno successivo, lavare le piastre con tampone di lavaggio (PBS / 2% FCS), 2 cicli (4 lavaggi ciascuno).
   4. Applicare 100 μL di sieri di topo (1:100) in PBS/2% FCS in triplice copia sulle piastre e incubare a temperatura ambiente per 2 ore. Dopo 2 ore, lavare le piastre con tampone di lavaggio come descritto al punto 2.6.2.
   5. Aggiungere 100 μL di anticorpi secondari alcalini fosfatasi (AKP)-capra anti-topo IgG, AKP-rat anti-topo IgG1 o AKP-rat anti-topo IgG2a (1:1000) per 2 ore seguita da una fase di lavaggio di 1 ciclo con tampone di lavaggio e 1 ciclo con PBS. Rileva gli anticorpi utilizzando un kit di substrato AKP e misura a OD 405 nm ogni 15 minuti con uno spettrofotometro. Il TFA di solito si sviluppa completamente in 15 minuti mentre il CYP2E1 e l'epitopo CYP2E1 possono svilupparsi da 30 a 60 minuti⁷.
7. Studi sullo sviluppo dello stress ossidativo indotto da JHDN5 IgG in vitro.
   1. Utilizzando 12 piastre di pozzetto, incubare 10⁶ cellule epatiche differenziate terminalmente per pozzetto su scivoli di copertura ricoperti di fibronectina in 1000 μL di mezzi Williams E integrati con glutammina e integratore generale (vedere Tabella dei materiali) a 37 °C, 5% CO₂, 95% di umidità per 7 giorni come raccomandato per massimizzare l'attività del CYP2E1.
   2. Aggiungere JHDN5 IgG (1:40) o mouse IgG (1:1000) per separare i pozzetti e incubare per 2 ore a 37 °C, 5% CO₂, 95% di umidità. Hybridoma sera era molto diluito. Aggiungere un rilevatore di anticorpi fluorescenti rosso intenso (vedere Tabella dei materiali) per altri 30 minuti a tutti i pozzi.
   3. Lavare i pozzetti 3x con 1 mL di PBS al buio. Fissare le cellule in formaldeide al 3,7% per 10 minuti. Esaminare al microscopio confocale entro 24 ore.
8. Studi di co-localizzazione di JHDN5 IgG con organelli intracellulari come i mitocondri in vitro.
   1. Per dimostrare la co-localizzazione di JHDN5 IgG con mitocondri, cellule epatiche differenziate terminalmente scarsamente coltivate (~ 30%) su scivoli di copertura ricoperti di fibronectina per 7 giorni in mezzi E di Williams privi di coloranti integrati come descritto nel passaggio 2.7.
   2. Dopo aver determinato le corrette lunghezze d'onda di assorbimento, aggiungere la fluorescenza verde, 488 nm -coniugato mouse IgG o JHDN-5 (1:100) e la fluorescenza rossa, 594-coniugata Mito-tracker Red (1:100) per 2 ore (37 °C), 5% CO₂, 95% di umidità.
   3. Montare i coperchi con fibronectina etichettati con il reagente anti-dissolvenza con DAPI ed esaminare al microscopio confocale.

3. Note generali del protocollo

1. Utilizzare strumenti di grado non farmaceutico quando i composti non sono disponibili in una formulazione per uso clinico. Tuttavia, ottenere ciascuno di questi strumenti da fornitori commerciali affidabili identificati in questo metodo. Utilizzare sempre sostanze chimiche conformi alle specifiche definite dal Comitato sui reagenti analitici dell'American Chemical Society di almeno il livello di grado reagente. Per i nostri metodi, utilizzare reagenti di livello analitico quando possibile.
2. Seguire una rigorosa tecnica asettica per la formulazione delle proteine alterate dal TFA al fine di prevenire contaminazioni che potrebbero influire negativamente sul benessere degli animali o sull'interpretazione dei dati.
3. Conservare e utilizzare formulazioni di grado non farmaceutico a durate per le quali la formulazione rimarrà potente, secondo le informazioni tecniche disponibili. Conservare CFA a temperatura ambiente, CYP2E1 e i suoi epitopi a -20 o -80 °C. Conservare le proteine alterate dal TFA a -80 °C e lasciare arrivare a 4 °C prima dell'emulsione con CFA. Conservare le proteine alterate dal TFA a -80 °C e conservare in aliquote per evitare cicli ripetuti di congelamento-disgelo.

Risultati

Il programma di immunizzazione utilizzato per indurre la DIH mostrato nella Figura 1 rappresenta le due vaccinazioni richieste alla base del collo (giorno 0) e alla base della coda (giorno 7). La Figura 2 mostra i dati rappresentativi di proliferazione ottenuti il giorno 14 utilizzando CFSE in risposta al CYP2E1, JHDN5, all'epitopo CYP2E1 e al metabolita trifluoroacetile (TFA) degli anestetici. La Figura 3 mostra la strategia di gat...

Discussione

La forza di questo protocollo risiede nella sua riproducibilità; quindi, è fondamentale aderire ai passaggi suggeriti. La formulazione dell'immunogeno può essere una barriera per alcuni; tuttavia, abbiamo riprodotto il nostro modello utilizzando l'epitopo descritto nel nostro documento, che elimina la necessità di isolare la frazione S100 del fegato. È probabile che ulteriori epitopi o proteine possano essere alterati e indurre l'epatite dopo le vaccinazioni; tuttavia, descriviamo quelle proteine che abbiamo usato c...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1% 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS)	ThermoFisher	28997
AKP Substrate Kit	BioRad	172-1063
BALB/c mice	Jackson
CellTrace™ CFSE Cell Proliferation Kit	ThermoFisher	C34554
CFA H37Ra	Becton Dickinson (Difco Bacto)	231131
FcR Blocking reagent	Milteyi	130-092-575
General supplement	ThermoFisher	HPRG770
HepaRG™ cells cryopreserved	ThermoFisher	HPR GC10
Live/Dead Fixable Aqua Dead Cell stain kit	ThermoFisher	L34965
NaHC03	Millipore Sigma	S5761
Percoll®	Millipore Sigma	P1644-1L
Pertussis Toxin	List Biologicals	180
Phosphate Buffered Saline pH 7.4	Various
Pierce™ Protease Inhibitor Mini Tablets, EDTA Free	ThermoFisher	88666
Potassium Hydroxide	JT Baker	3140-01
S-ethyltrifluorothioacetate (S-ETFA)	Millipore Sigma	177474
Slide-a-lyzer dialysis cassettes (10 K, 12 ml)	ThermoFisher	66810
UltraPure™ SDS Solution, 10%	ThermoFisher	24730020
Williams Media E, no phenol red	ThermoFisher	A1217601