Размораживание, культивирования и Cryopreserving дрозофила клеточных линий

Резюме

Линии клетки дрозофилы являются важными реагенты для фундаментальных и биомедицинских исследований. Эта статья обеспечивает протоколы для оттаивания, subculturing и криоконсервации часто используемых дрозофилы клеточных линий для оказания помощи исследователям в посредством использования этих реагентов в их исследованиях.

Аннотация

В настоящее время насчитывается более 160 различных клеточных линий дрозофилы , распределены по дрозофилы центр ресурсов геномики (НАУЧНЫМ). С инженерной генома, количество новых клеточных линий ожидается увеличение. НАУЧНЫМ призвана ознакомить исследователей с использованием дрозофилы клеточных линий как экспериментальный инструмент для дополнения и управлять их исследований. Предоставляются процедуры для работы с различными дрозофилы клеточных линий с отличительные особенности, включая протоколы для оттаивания, культивирования и cryopreserving клеточных линий. Важно отметить, что эта публикация демонстрирует лучшие практики, необходимые для работы с дрозофилы клеточных линий для сведения к минимуму риска загрязнений от случайного микроорганизмов или других клеточных линий. Исследователи, которые стали знакомы с этими процедурами будут иметь возможность углубиться в многих приложений, использующих дрозофилы культивируемых клеток, включая биохимии, клеточной биологии и функциональной геномики.

Введение

Использование дрозофилы культивируемых клеток дополняет в естественных условиях летать генетического анализа и служит в качестве первичного расследования инструмент для решения многих основных биологических вопросов^1,2,3. Дрозофилы клеточных линий предлагают уникальные однородной популяции клеток, полученных из источников различных тканей с различных генетических стола. Клеточные линии подходят для многих приложений, включая выражение трансгенных гена, геномики, transcriptomics, протеомики, метаболомики, высокая пропускная способность РНК интерференции (RNAi) экранов, клеточной биологии и микроскопии. Важно отметить, что использование дрозофилы клеточной культуры облегчает характеристику немедленного временного ответы на известных раздражителей. Кроме того культура клетки дрозофилы поддается ТРИФОСФАТЫ-Cas9 генома редактирования, что делает его относительно легко создать новые линии клетки с конкретным геном модификации^{4,5,6, 7}.

Центр ресурсов дрозофилы геномики (НАУЧНЫМ) выступает в качестве репозитория и распределительный центр для дрозофилы клеточных линий. Одна из целей НАУЧНЫМ заключается в оказании помощи членам научно-исследовательского сообщества в использовании ресурсов культуры клеток дрозофилы . В статье представлены основные протоколы для обработки дрозофилы клеточных линий. Она дополняет существующие ресурсы, чтобы помочь исследователей стать комфортно с обработкой дрозофилы клеточных культур и достичь уровня независимости в их экспериментов^{1,2,8,9 ,10}.

Наиболее часто используемые линии клетки дрозофилы являются: Шнайдер линии¹¹, Kc167¹², Mitsubishi/Мияке имагинальных дисков и центральной нервной системы (ЦНС) линии^13,14, Милнер Лаборатория имагинальных дисков линии ¹⁵,^16,линии клеток взрослого яичников¹⁷и Ras линии¹⁸ (Таблица 1). Шнайдер и Kc167 линии являются общие универсальные клеточные линии для использования в биохимии, экспрессии рекомбинантных трансгенных генов и обратного генетического экраны. Mitsubishi/Мияке лаборатории (мл) линии были получены от личиночных имагинальных дисков или центральной нервной системы (ЦНС), и они были полезны для исследования связанных с нейросекрета, правилам транскрипции и обработки РНК. Милнер (CME) диск линии были важными для изучения сигнала. ФГС/OSS клеточных линий, производный от мутантов взрослых яичники остаются важным реагентов для изучения влияния некодирующих небольшой биологии РНК в клетки семенозачатка содержание и дифференцирования^17,19. И наконец Ras линии являются уникальными, потому что эти клеточных линий, полученных эмбрионов, ectopically выражая онкогена ран. Они имеют transcriptional подпись мышечных клеток-предшественников и выражает активную piRNA машины²⁰. Последние обзорных статей и глав книг охватывают применение этих популярных клеточных линий с более детали^2,,3-⁹.

Все эти линии клетки может быть subcultured и заморожены. Есть небольшие, но важные различные требования к как каждой ячейки строки поддерживается и подготовлен для криоконсервации. Например различные клеточные линии требуют различных средств массовой информации и добавки (Таблица 1). Строки также различаются по поверхности присоединения свойства, морфологии (рис. 1 и рис. 2), генотип и удвоение времени (Таблица 2). Мы представляем основные протоколы и подчеркнуть уникальные различия для обработки различных широко используемых дрозофилы клеточных линий.

протокол

1. оттаивания и возрождение замороженных дрозофилы клеточных линий

1. Стерилизуйте капот, вытирая рабочей поверхности с 70% этиловом спирте. Отказаться от 5 мл соответствующей среды (Таблица 1) в 25 см² T-колбу (T-25).
2. Удалите cryovial/ампулы из жидкости N₂ или сухого льда. Протрите cryovial с 70% этанола, тщательно ослабить и распечатывания ампулы.
3. С помощью пипетки Пастера, 1 мл комнатной температуры (RT) средств массовой информации покинуть T-25 колбу. Медленно добавьте СМИ в cryovial и осторожно перемешать таять замороженных клеток, обеспечивая, что суспензию клеток не переполнения.
4. Перевести весь объем суспензии клеток талой из ампулы в T-25 колбу. Повторите, чтобы убедиться, что суспензию клеток были переданы полностью.
5. Фляга в инкубаторе 25 ° C, позволяя клеток урегулировать и придерживаться для по крайней мере 2 h. изучить клетки под микроскопом, чтобы обеспечить, что большинство клеток поселились на поверхности растущего. Аккуратно удалите старые средства массовой информации и замените 5 мл свежего средств массовой информации. Вернуть настой в инкубаторе.
6. На следующий день аккуратно удалить старые средства массовой информации и заменить с 5 мл свежего средств массовой информации. Возвращение культуры в инкубаторе.

2. оттаивания и возрождение замороженных дрозофилы клеточных линий (альтернатива)

1. В стерильные капот оттепель клетки, resuspending замороженных лепешка с 1 мл раствора RT СМИ. Передача всех суспензию талой клеток в коническую пробирку 15 мл.
2. Пелле клетки центрифугированием на 1000 x g для 5 минут удалить супернатант и Ресуспензируйте Пелле клеток в 5 мл свежего средств массовой информации.
3. Перевести весь объем суспензии клеток в T-25 колбу и инкубировать культуры при 25 ° C.
4. 1-2 h позже, изучить клетки под микроскопом, чтобы обеспечить, что большинство клеток поселились на поверхности растущего. На следующий день заменить старые средства массовой информации с 5 мл свежего СМИ и возвращение культуры в инкубаторе.

3. subculturing полу адэрентных клеток, выращенных в 100 мм культуры пластин

1. Стерилизуйте капот, вытирая с 70% этиловом спирте. Принесите стерильных материалов для subculturing в капот, включая СМИ бутылки, пипетки, помощи пипетки и культуры пластин.
2. Изучения морфологии и слияния культуры под микроскопом. Ищите признаки microorganismal загрязнений в культуре. Определить, готовы ли клетки к пассированной, основываясь на характеристиках культуры: сотовый плотности и удвоение времени, в том числе в последний раз, они были subcultured.
3. Если культура очень притока (рис. 1), определить плотность клеток. В стерильные капот выбить клетки с поверхности растущего дозирование до 10 мл среды от плиты и дозирования над клетки. Повторите несколько раз, обеспечивая не для создания пены, до тех пор, пока рост поверхности становится ясно. Определите плотность клеток с помощью Горяева или счетчик автоматический частиц (раздел 5, рис. 3). Субкультура клетки, если плотность ячеек между 5 x 10-⁶ и 1 x 10-⁷ кл/мл.
   Примечание: Сделать не субкультура дрозофилы клеточных линий клеток плотности менее 1 x 10⁶ клеток/мл.
4. Разбавления суспензии клеток, соответственно с использованием соответствующих средств для окончательного заполнения концентрации по крайней мере 1 x 10⁶ клеток/мл.
   1. Для обычной пассированый и техническое обслуживание добавьте соответствующий объем суспензии клеток предопределенного объема среды в новой культуры пластины для достижения желаемого плотность посева клеток.
   2. Для расширения масштабов культуры, перевести все суспензию клеток в большой колбу. Разбавления суспензии клеток для нужной ячейки плотности с Томом соответствующей среды. Распространите равных объемах подвеска разреженных ячейки для новых плит. Этот метод минимизирует вариации в плотность ячеек между пластинами.
5. Обложка и этикетке плиты с инициалами оператора, Дата, Сплит соотношение, плотность посева клеток, клеток линии идентификатор, СМИ, номер прохода и любые дополнения СМИ, такие как антибиотики.
6. Поместите пластины в пластиковый контейнер и вернуть окно в инкубаторе.
   Примечание: таблица 3 списки судов культуры, часто используемые для культивирования дрозофилы клеточных линий и связанные рабочие объемы.

4. выбивании адэрентных клеток, выращенных в 100 мм культуры пластин

1. Передать все средства от пластины новую стерильную колбу. Сохраните средства.
2. Промойте клетки, медленно добавляя 1 мл 0,05% трипсина-ЭДТА к пластине. Вихревой мягко, чтобы убедиться, что решение трипсина охватывает весь рост поверхности. Слейте раствор трипсина.
3. Аккуратно добавьте 1 мл 0,05% трипсина-ЭДТА к пластине. Инкубируйте пластины при 25 ° C между 3−10 мин хотя мониторинг для видимых признаков отсоединение слой клеток и скольжения с растущей поверхности.
4. Добавьте 9 мл сохраненных среды к пластине, чтобы остановить активность трипсина. Перемешайте суспензию клеток не присоединяться скопления клеток. После того, как были выбиты все клетки, растущей поверхность будет ясно.
   Примечание: Использование пищеварительных ферментов, таких как СПИД трипсина в пассированый линии сильно адэрентных клеток. Трипсин представляет собой смесь протеазы, часто выведены из поджелудочной железы свиней и коммерчески доступна в различных классов чистоты.

5. ручной клеток подсчета с помощью ячейки Нойбауэр, считая слайд

1. Подготовьте Горяева слайд и coverslip, вытирая поверхность с 70% спирта.
2. Перемешать суспензию клеток и лунки 15 мкл суспензии клеток в рифленый край Горяева (Рисунок 3А), чтобы заполнить в первой камере Горяева. Заполните второй камеры Горяева. Суспензию клеток будет отрисован в Счетной палате действием капилляров.
3. С помощью 10 x микроскопом цель, подсчитать количество ячеек в пределах области² 1 мм в середине сетки, связанные с параллельными линиями (рис. 3 c,D). Чтобы избежать дублирования подсчета, граф клетки, которые накладываются верхней и левой границ, но не те клетки, которые пересекают правой и нижней границ 200 µm² квадратов. Граф между 100−200 клетки. Повторите граф с второй камеры.
4. Вычислить среднее по двум пунктам и определить плотность ячеек по следующей формуле: клетки (клеток/мл) плотность = средний клеток count (n₁ + n₂/2) х 10⁴.
   Примечание: Жизнеспособность клеток выражается в виде процента жизнеспособных клеток над общей клетки. Чтобы определить жизнеспособность клеток, перемешать суспензию клеток с равным объемом Трипановый синий (0.4%) решение до ручного или автоматического клеток подсчета. Живые клетки не займет краситель, в то время как мертвые клетки будет окрашенных в синий.

6. криоконсервирования клеточных линий дрозофилы

1. Проверьте культуры здорового морфологии, роста и отсутствие загрязнения. Урожай культур от середины к фазе роста конца журнала (шаг 3.3, или раздел 4). Для многих дрозофилы клеточных линий это примерно между 4 х 10⁶ клеток/мл до 8 х 10⁶ клеток/мл.
2. Перенесите всю ячейку подвеска в 15 мл или 50 мл Конические трубки. Собирать клетки центрифугированием на 1000 x g 5 минут и удалить супернатант.
3. Ресуспензируйте Пелле клеток в объеме замораживания среды (Таблица 4), которая приведет к плотность окончательный клеток, по крайней мере 4 x 10⁷ клеток/мл.
4. Добавьте каплям соответствующее количество криопротектора диметилсульфоксида (ДМСО) в суспензию клеток таким образом, что конечная концентрация ДМСО составляет 10%. Аккуратно перемешайте суспензию клеток.
5. Тщательно распределять 0,5 мл суспензии клеток на аликвоты предварительно помечены криопробирки (~ 2 x 10-⁷ клеток/флакон). Поместите ампулы в замораживания контейнер заполнен изопропиловый спирт (рис. 4A). Перевести заморозки контейнера в морозильник-80 ° C ночь чтобы температура криопробирки медленно падать (-1 ° C/мин) до температуры морозильной камеры.
6. Возьмите замороженные криовалы и быстро прикрепить их к трости (рис. 4В). Вставьте трости, содержащие криопробирки в фильтр (рис. 4 c). Кроме того место замороженные криовалы внутри предварительно охлажденным замораживания коробки (рис. 4 d). Храните замороженные криовалы в жидкой фазе N₂ морозильных камер (Рисунок 4E,F).
   Примечание: При использовании замораживания средств массовой информации содержащей ДМСО, задержка до 30 мин на RT не вредно для ячейки.

Результаты

Важно быстро разморозить замороженные клетки дрозофилы и культуры их на плотность клеток, который приносит культуры обратно в фазе роста. Если соблюдаются процедуры замораживание и оттаивание, плотность клеток в T-25 колбу будет по меньшей мере равна 4 х 10⁶ клеток/мл. Один-два часа после оттаивания, приложить к поверхности растущего начнет большинство дрозофилы клеточных линий. При обстоятельствах, в которых большинство клеток не приложил на поверхности растущего в течение двух часов после оттаивания рекомендуется для инкубации клеток на ночь перед изменением средств массовой информации.

Целью subculturing является поддержание клеток в здоровых экспоненциального лаг фаза роста кривой. Критерии для subculturing зависят от видимым отсутствием microorganismal загрязнения, плотность ячеек и необходимость создания расписания регулярного обслуживания. Важно, чтобы сначала оценить здоровье клеток и определить отсутствие случайного загрязнения до замораживания. Большинство бактериальных и грибковых загрязнителей легко обнаружить просто путем визуальной инспекции. Загрязненных культур может быть идентифицирован увеличение в СМИ мутность. Под микроскопом загрязнители могут появиться как бактериальный стержней, кокки, многообещающий дрожжевых клеток или строка как грибные гифы. Другие источники загрязнения, такие как не цитопатического микоплазмы нельзя обнаружить визуально и регулярно проверяться на основе ПЦР анализов²¹.

Слияния клеток линии можно определить визуально (рис. 1). Быстро растущей линии клеток достичь слияния и нужно быть пассированной регулярно. Такие линии subcultured до два раза в неделю. В отличие от этого медленный рост клетки, пассированный по крайней мере один раз каждые две недели или более. Однако клетки нужно кормить свежей СМИ каждую неделю. Это для предотвращения исчерпания средств массовой информации и разбавить метаболические отходы из клеток. Линии клетки происходит от различных тканях, которые источники расходятся в их морфологии (рис. 2), присоединение свойства, СМИ требования (Таблица 1) и удвоение время (Таблица 2). Таблица 5, Таблица 6, Таблица 7и таблице 8 перечислены рецепты для различных средств массовой культуры клеток дрозофилы .

Подсчет клеток обеспечивает точного высева плотности и предсказуемой рутиной для subculturing. Для количественных экспериментов подсчет клеток имеет важное значение. Ячейки учитываются с помощью Горяева (Рисунок 3А) или счетчик автоматизированных частиц (рисунок 3B). При использовании автоматизированных счетчика, следуйте инструкциям производителя. Подсчет ячеек вручную с помощью Горяева является экономичным и легким. Количество клеток, заключены в середине сетки Нойбауэр, учитываются и вычисляется плотность клеток; Например, n = 214 клетки, что приводит к ячейке плотность 2.14 х 10⁶ клеток/мл (рис. 3D).

Суспензию клеток от двух 100 мм пластин, каждый содержащий 10 мл суспензии клеток в 4 х 10⁶ клеток/мл собираются и высокомобильна в 2 мл замораживания средств массовой информации для достижения плотности 4 x 10⁷ кл/мл. Каждый замороженных cryovial с 0,5 мл суспензии клеток содержит ячейки 2 x 10-⁷ . Это приведет к культуре с 4 х 10⁶ клеток/мл при разморозить согласно протоколу раздела 1.

Рисунок 1 : Представитель образы трех различных Дрозофилы мобильных линий при различных плотностях слияния и ячеек. (A) S2-НАУЧНЫМ культура в 1 x 10⁶ клеток/мл. (A') S2-НАУЧНЫМ культура 4.5 x 10⁶ клеток/мл. (B) мл-BG2-c2 культуры в 2 х 10⁶ клеток/мл. (B) ML-BG2-c2 культура 8 х 10⁶ клеток/мл в котором клетки свай и агрегирование как очаги. (C) OSS культура 1 х 10⁶ клеток/мл. (C') Культура в OSS в 4 х 10⁶ клеток/мл. Клеток в суспензии не регистрируются в одной фокальной плоскости. Шкалы бар = 100 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. 

Рисунок 2 : Представитель изображения восьми различных клеточных линий дрозофилы . (A) раунд эмбриона производные S2-НАУЧНЫМ. (B) раунд эмбриона производные Kc167. (C) раунд личиночной ЦНС производные мл-BG2-c2. (D) личинок шпинделя круглой ML-BG3-c2. (E) CME L1, линия клетки, полученные от личинок ноги имагинальных дисков, меньше и раунд/веретенообразной морфологии. (F) OSS, линия клетки, полученные от взрослых яичников, отображает веретеновидной формы морфологии. (G) линия клетки веретеновидной формы РАН^V12 выразив активированного ран. (H) РАН^V12; wts^{интерференции} (WRR1), линия клетки, выразив активированного ран и двуцепочечные РНК, ориентация опухоли подавитель бородавки (СВХ), отображает эпителиальных характеристики. Шкалы бар = 50 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3 : Плотность клеток могут быть подсчитаны вручную с помощью Горяева или автоматически с помощью автоматизированных частиц счетчик. (A) A Горяева с двумя камерами. (B) Счетчик автоматизированных клеток, выводя результаты подсчета клеток. (C) улучшение Нойбауэр клеток подсчета сетки Просмотрели под объектив 10 x. Подсчет количества ячеек, обязательность 0,1 мм³ Центральный сетке (красная пунктирная линия площадь). (D) Центральный сетки на Горяева заполнены с ячейками для подсчета. Шкалы бар = 1 мм (C); 0,2 мм (D). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4 : Оборудование для криоконсервирования. (A) A магазины заморозки контейнера ампулы в вертикальном положении для медленного замораживания. (B) металла тростника для проведения замороженных ампулы. (C) A канистру для проведения трости. (D) A морозильное кейсом (cryobox). (E) A канистру Холдинг несколько трости, вставляется в жидкости N₂ резервуара. (F) жидкого N₂ резервуара. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Штамм ячейки	Средства массовой информации	Присоединение	Трипсин
Шнайдер линии	М3 + BPYE + 10% плода телячьей сыворотки (FCS), рН 6,6	Полуфинал сторонник	Нет
(S2R +, S2-DRSC, S2-НАУЧНЫМ, Ш4) 11
	Шнайдер СМИ+ + 10% FCS
KC линии (Kc167, Kc7E10)21,22	М3 + BPYE + 5% FCS, рН 6,6	Полуфинал сторонник	Нет
	Hyclone-CCM3, рН 6,2
Имагинальных дисков и ЦНС (мл-линии)13,14	М3 + BPYE + 10% FCS, рН 6,6	Полуфинал сторонник	Нет
	10 мкг/мл инсулина
Мильнер имагинальных дисков линии (CME-линии)15	М3 + 2% FCS	Полуфинал сторонник	Нет
	5 мкг/мл инсулина
	2,5% летать экстракт
ФГС/OSS16	М3 + 10% FCS, pH 6.8	Сторонник	*
	10 мкг/мл инсулина
	1 мг/мл C5H8KNO4
	0.5 мг/мл KHCO3
	Глутатион 0,6 мг/мл
	10% летать экстракт
РАНV12 линии18	М3 + BPYE + 10% FCS, рН 6,6	Сторонник	Да

Таблица 1: Свойства и СМИ требования различных Дрозофилы мобильных линий. Различные изолятах полу адэрентных Шнайдер линий, включая S2R +, центр скрининга RNAi дрозофилы S2 (DRSC), центр ресурсов S2-дрозофилы геномики (НАУЧНЫМ) и Ш4 являются часто используемым клеточных линий, которые размножаются энергично когда культивировали в СМИ м3 + Bactopetone экстракт дрожжей (BPYE) с 10% плода телячьей сыворотки (FCS). Кроме того СМИ Шнайдер (рН 6,7-6,8) часто используется вместо м3 + BPYE. Kc линии размножаться в м3 + BPYE (5% FCS) или сыворотки свободных средств массовой информации CCM3. МЛ имагинальных дисков и центральной нервной системы (ЦНС) линии требуют инсулина добавок для распространения. Мильнер имагинальных дисков линии требуют что инсулин и летать экстракт добавок. Адгезивная ФГС/OSS клеточных линий требуется инсулин, более высокую концентрацию летать экстракта, а также глутатиона для роста. Адгезивная РАН^V12 линии хорошо растут в м3 + BPYE (10% FCS). Трипсин используется выбить адэрентных клеток линии от поверхности роста.

Ячейки строки (Stock #)	Генотип	Удвоение время (ч) *	Источник ткани
S2R + (150)	Орер	39	Конце эмбрионов
S2-НАУЧНЫМ (6)	Орер	23	Конце эмбрионов
S2-DRSC (181)	Орер	46	Конце эмбрионов
Kc167 (1)	e/se	22	6−12 h эмбрионов
ML-BG2-c2 (53)	y v f mal	48	3rd Инстар личиночной ЦНС
ML-BG3-c2 (68)	y v f mal	104	3rd Инстар личиночной ЦНС
ML-DmD8 (92)	y v f mal	66	3rd возраста личиночной крыла диск
CME W1 Cl.8+ (151)	Орер	46	3rd возраста личиночной крыла диск
CME L1 (156)	Орер	47	3rd возраста личиночной ногу диск
ОСС (190)	bamD86	45	Взрослый bam мутант яичников
РАНV12 линии	УАН GFP; P(UAS-Ras85D.V12) / P (Act5C-GAL4) 17bFO1	41−65	Эмбрион

Таблица 2: Генотип, удвоение время и источники ткани широко используется Дрозофилы мобильных линий. Представлены ткани генотип, источник и населения, удвоение время часто используемых клеточных линий. Время удвоения на основе роста в Рекомендуемые СМИ при 25 ° C.

Культуры судно	Объем средств (мл)
12,5 см2 T-колба	2.5
25 см2 T-колба	5
75 см2 T-колба	15
35 мм пластина	1
60 мм	4
100 мм	10
384-ну пластина *	0.04/хорошо
96-луночных пластина *	0,1/хорошо
48-ну пластина *	0,3/хорошо
24-ну пластина *	0.5/хорошо
12-ну пластина	1.0/хорошо
6-ну пластина	2.0/хорошо

Таблица 3: Культура судов и рекомендуемая СМИ томов. Культура судов различных размеров доступны для культивирования клеток дрозофилы . Соответствующие средства массовой информации тома (мл) рекомендуется для каждого судна. Печать нескольких хорошо пластины, содержащие менее 0,5 мл суспензии клеток с парафином фильм для уменьшения потерь средств массовой информации за счет испарения.

	Объем
М3 + BPYE, рН 6,6	70 мл
Тепла инактивированная FCS	20 мл
Стерильного отфильтрованного ДМСО *	10 мл

Таблица 4: рецепт для приготовления 100 мл замораживания среды (м3 + BPYE, 20% FCS, 10% ДМСО). Подготовить замораживания средств массовой информации, при необходимости и избегать хранения замораживания средств массовой информации, содержащие ДМСО для длительного периода времени.

М3 + BPYE средний	Сумма
Щиты и пел в23 м3	1 бутылка
KHCO3	0.5 g
Выберите дрожжевой экстракт	1.0 g
Bactopeptone	2.5 g
Стерильная вода очищенная	1000 мл

Таблица 5: Рецепт для приготовления 1 Л м3 + BPYE тканевой культуры среднего. Отрегулируйте пэ-аш до 6.6. Стерилизуйте, передавая средство через фильтр 0,22 мкм.

Базовый м3 средний для линии клетки ФГС/OSS	Сумма
Щиты и пел м3	1 бутылка
KHCO3	0.5 g
C5H8KNO4	1.0 g
Стерильная вода очищенная	1000 мл

Таблица 6: Рецепт 1 Л базовый средний ФГС/OSS м3. Отрегулируйте пэ-аш до 6,8. Стерилизуйте, передавая средство через фильтр 0,22 мкм.

Hyclone-CCM3	Сумма
CCM3 порошок	28.6 g
NaHCO3	0,35 г
10 N NaOH	2,5 мл
CaCl2	0.5 g
Стерильная вода очищенная	1000 мл

Таблица 7: Рецепт 1 Л Hyclone-CCM3 ткани культуры среднего. Отрегулируйте пэ-аш до 6.2. Стерилизуйте, передавая средство через фильтр 0,22 мкм.

	М3 + BPYE + 10% FCS	Мияке диск и средней линии ЦНС	Мильнер диск линии среднего	ФГС/OSS полный средний
М3 + BPYE, рН 6,6	90 мл	90 мл	-	-
Тепла инактивированная FCS *	10 мл	10 мл	2 мл	10 мл
Инсулин (10 мг/мл)	-	100 МКЛ	50 МКЛ	100 МКЛ
Муха экстракт	-	-	2,5 мл	10 мл
Глутатион (60 мг/мл)	-	-		1 мл
М3, рН 6,6	-	-	97,5 мл	-
ФГС/OSS м3, pH 6.8	-	-		79 мл

Таблица 8: Рецепт для приготовления 100 мл различных общих Дрозофилы СМИ культуры клеток. Инкубируйте FCS на 56 ° C для 1 h и встряхнуть каждые пять минут, чтобы тепло инактивации белков комплемента.

Обсуждение

Дрозофилы клеточных культур являются первичной реагентов для высокой пропускной способности на основе ячеек экранов. Их использование также дополняет исследования in vivo генетических, предоставляя однородная популяция клеток для биохимии, быстрое тестирование трансгенных конструкций до впрыскивать в мух, клеточная биология, микроскопии и совсем недавно соматических клеток генетического манипуляции с геном редактирования^1,2,3,8,9,10.

Жизнеспособность и восстановление замороженных клеток дрозофилы чувствительна к резким колебаниям даже при низких температурах. НАУЧНЫМ магазины замороженные клеточные линии в жидкой фазе N₂ (-196 ° C) и перевозит их в сухого льда (-78.5 ° C). Замороженные ампулы, которые были перевезены в сухой лед не должны передаваться обратно в жидкость N₂ или морозильник-80 ° C для хранения. Вместо этого замороженные клетки следует разморозить, заполнения на плотность высокой клеток как можно скорее по прибытии (протокол раздел 1) и культивированный по назначению (протокол раздел 3). Если линии клетки не используются непосредственно для экспериментов, ячейки, строки должны быть криоконсервированных (раздел 6 протокол) до тех пор, пока они готовы для использования.

Некоторые клеточных линий, таких как линии ML-BG2-c2 и ран нужно несколько дней, чтобы оправиться от последствий возрождаются из криоконсервированных государства. Значительное количество сотовой мусора сопровождает эти клеточные линии в первые несколько дней после оттаивания. Покинул спокойно, клетки будет восстановить и размножаться. Многие дрозофилы клеточных линий на НАУЧНЫМ были адаптированы к расти в м3 на базе СМИ²². Для клеточных линий, которые медленно, чтобы оправиться от последствий таяния использование кондиционерами СМИ может быть полезным. Кондиционерами СМИ вероятно содержит факторы роста, выделяется клетками в средствах массовой информации, которые могут способствовать восстановлению и пролиферации клеток после оттаивания.

Клеточных линий, как правило, следуют кривая стереотипных роста, состоящий из участка запаздывания, экспоненциальная фаза, фаза плато и фазы обострения. Многие дрозофилы клеточных линий размножаться в лаг фазы роста, когда они выращиваются на плотность от 1 x 10-⁶ и 1 x 10⁷ кл/мл при 25 ° C. Важно, что клеточных линий пассированные таким образом, чтобы они находятся всегда в фазы экспоненциального роста.

Слияние культуры, выраженный в процентах, описывает рост площади поверхности, которая охватывается клеток. Слияния клеток для строки ячейки зависит от его клетки форму и размер. Различных клеточных линий имеют различные морфологии и присоединения свойства. В результате различных клеточных линий на приблизительно одинаковые слияния может иметь плотность значительно различных клеток (рис. 1). Слияние культуры не может быть идеальный показатель для пассированый дрозофилы клеточных культур, потому что дрозофилы клеточных линий продолжают распространяться либо путем укладки поверх друг друга как очагов или подвеска, даже после того, как был рост поверхности крытая (рис. 1). Однако пользователи опытных с конкретными клеточных линий может часто используют слияния как быстрым Путеводитель для когда для субкультуры.

Хотя это можно выращивать дрозофилы линии окружающего RT между 19−25 ° C, не рекомендуется, потому что колебания температуры окружающей среды может повлиять на скорость распространения. Рекомендуется использовать выделенный 25 ° C-инкубатора. Инкубатор для культур клеток дрозофилы не нужно облегчить обмен газа CO₂ , потому что дрозофилы клетки культуры СМИ не используйте CO₂ для буферизации. Влажность внутри инкубатора для культивирования клеток линии является важным фактором не следует упускать из виду при культивировании клеток в тарелках. В зависимости от типа инкубатора и рабочей среды может быть необходимо разместить стакан стерильной воды внутри инкубатора. Чтобы свести к минимуму испарения СМИ, использовать закрытые T-настой или хранить культуры пластин в плотно закрытом пластиковом контейнере внутри инкубатора.

Важно разработать график для subculturing дрозофила клеточных линий. Для оценки последовательности монитора и темпы роста, это удобно для субкультуры в даже геометрические пропорции (Сплит соотношение 1:2, 1:4, 1:8). Например 10 мл вырожденная плита Kc167 клеток в 8 х 10⁶ клеток/мл может быть разделен на соотношение 1:8 для достижения посева плотность 1 х 10⁶ клеток/мл (1,25 мл суспензии клеток, разбавляют в 8,75 мл свежего СМИ). В 72 h Kc167 культур, как ожидается, размножаться к плотности 8 х 10⁶ клеток/мл, учитывая его удвоения время 24 ч. Коэффициент разделения таким образом определяется для облегчения удобный субкультура рутинной до два раза в неделю, обеспечивая, что клетки всегда культивировали в фазе роста их экспоненциальный журнала. Это позволяет для регулярного расписания для subculturing клетки, так что время слияния является слишком коротким и не слишком долго. Если время слияния является слишком коротким, клетки subcultured на более низкую плотность клеток (высокий коэффициент разделения). Аналогично Если время достичь слияния является слишком длинным, клетки subcultured на более высокую плотность клеток (Нижняя Сплит соотношение). Важно отметить, что большинство дрозофилы клеточных линий очень чувствительны к низкой сотовый плотности (< 1 х 10⁵ клеток/мл), в котором клетки вряд ли размножаться и может в конечном итоге умрет.

Дрозофилы клеточных линий различаются характеристики роста и морфологии. В результате клеточных линий с различных свойств могут должны обрабатываться по-разному. Большинство линий клетки дрозофилы полу сторонником. На нижнем плотность клеток, они придерживаться сильнее поверхности роста и культуры становится вырожденная, клетки становятся менее сторонником и легко отсоединить. Это постепенное изменение в сотовый присоединению облегчает легко subculturing наиболее широко используемых дрозофилы клеточных линий (Шнайдер, Kc линий, имагинальных дисков и ЦНС линии), как это позволяет оператору просто обойтись СМИ над монослое клеток выбить их от роста поверхности при плотной культуры. Для линий, которые являются приверженцем поверхности, такие как женские зародышевой линии стволовых/яичников соматических оболочка (fGS/OSS) и Ras линии, важно для инкубации клеток в трипсина на короткий срок для помощи в отделение клетки с поверхности роста.

Средства массовой информации дополнения для большинства дрозофилы клеточных линий включают плода телячьей сыворотки (FCS). Инсулин и взрослых летать экстракт (ФЕКС) требуются для некоторых конкретных линий. ФЕКС содержит неопределенный компонентов необходимых для роста конкретных личиночных имагинальных дисков линий и линий клеток взрослого яичников. Готовит НАУЧНЫМ, и делает доступных взрослых ФЕКС производных от 1 неделя старый мух Орегон-R-modENCODE (RRID: BDSC_25211) в 2,5 мл и 10 мл аликвоты. НАУЧНЫМ также предоставляет инструкции для малого масштаба ФЕКС подготовку на своем веб-сайте < https://dgrc.bio.indiana.edu/include/file/additions_to_medium.pdf>. Подготовка ФЕКС, однако, много времени и требует большое количество взрослых мух.

Криоконсервирования клеточных линий дрозофилы экономит время и реагенты для поддержания клеточных линий не в немедленного использования. Криоконсервация достигается медленно замораживание клеток (-1 ° C/мин) до-80 ° C в среде, содержащей ДМСО, криозащитных агента. Медленное охлаждение шаг имеет решающее значение для успешного криоконсервирования. В морозильной камере-80 ° C ампулы клеток охлаждается в размере-1 ° C/мин при помещении в заморозки контейнера, заполненного изопропиловый спирт. Начиная с при окружающей температуре 25 ° C, он будет принимать до 2 ч для температуры в ампулах до-80 ° C. Рекомендуется оставить ампулы заморозить на ночь.

Замороженные ампулы должны быть быстро передано в жидкой фазы азота для длительного хранения. При температуре окружающего воздуха cryovial будет быстро разогреть примерно 10 ° C/мин и жизнеспособность будет ставиться на выше-50 ° C²³. Чтобы сохранить быстрой передачи, обработки ампул в небольших партий для сведения к минимуму воздействия температуры окружающей среды. Кроме того, место замороженные криовалы на сухой лед при подготовке к их передачи в жидкость N_2. Если жидкий азот не доступен, клетки могут храниться в морозильной камере-80 ° C, хотя с риском значительного ухудшения с течением времени.

Плотность клеток имеет решающее значение для успешного криоконсервирования и последующего возрождения клеточных линий. В целом новая ячейка, которую линии должны быть заморожены для создания первоначальной заморозить (1−3 ампулы) как только избыток клеток становится доступной. Как только линия клетки были далее культивировали стабильно, замороженные запас 10−20 ампулы должны быть созданы. Затем этот запас разморожен для проверки ее восстановления после заморозки клеток и жизнеспособности, после чего она распространяется для экспериментов или заменить акции, когда количество замороженных запасов ампулы падает ниже 5. Наконец важно проверить, что талой клетки сохраняют характеристики своих родителей акций как клеточные линии известны развиваться^3,24.

В заключение эта статья представляет грунтовка для работы с дрозофилы клеточных культур путем предоставления основной информации о различных линий, наилучшей практики и аудиовизуальных протоколы для базовой обработки дрозофилы клеточных линий. Этот доступный ресурс предназначен для плавно облегчить введение в работу с культивируемых клеток дрозофилы и дополнить существующие учебные руководства любой исследовательской лаборатории.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm tissue culture plates	Corning	430167	Subculturing
25 cm2 T-flask	Corning	430168	Subculturing
35HC Liquid Nitrogen Storage Tank	Taylor-Wharton	35HCB-11M	Cryopreservation
Automated Cell counter	BIO-RAD	TC20	Counting
Bactopeptone	BD BioSciences	211677	Medium additions
Counting Slides	BIO-RAD	145-0011	Counting
Cryovial 1 mL	Greiner	123263	Cryopreservation
DMSO	Sigma Aldrich	D5879	Cryopreservation
Freezing Box	Nalgene	5029-0909	Cryopreservation
Freezing Container	Fisher Scientific	15-350-50	Cryopreservation
Hematocytometer	Fisher Scientific	#0267110	Counting
Human Insulin	Millipore Sigma	I9278	Medium additions
Hyclone CCM3 media	GE Healthcare Life Sciences	SH30061.03	Medium
Hyclone Fetal Bovine Serum	GE Healthcare Life Sciences	SH30070.03	Medium additions
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate	Millipore Sigma	G1149	Medium additions
L-Glutathione reduced	Millipore Sigma	G6013	Medium additions
Potassium Bicarbonate	Millipore Sigma	237205	Medium additions
Select Yeast Extract	Millipore Sigma	Y1000	Medium additions
Shields and Sang's M3 Insect medium	Millipore Sigma	S8398	Medium
Trpsin-EDTA (0.05 %), phenol red	ThermoFisher Scientific	25300054	Subculturing
Trypan Blue (0.4%)	BIO-RAD	145-0013	Counting