Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
Method Article
Интегрин напряженности играет важную роль в различных функций клеток. С датчиком интегративной напряженности Интегрин напряженности калибруется с чувствительностью picoNewton (pN) и образы на субмикронном резолюции.
Молекулярные напряженности, переданные Интегрин лиганд облигаций — основных механических сигнал в Интегрин путь, который играет важную роль во многих функций клеток и поведения. Для калибровки и изображения Интегрин напряженности с высокой силой чувствительность и пространственным разрешением, мы разработали интегративной напряжение датчик (СТС), на основе ДНК флуоресцентные напряженности. ЕЕ активируется для флуоресцировать если поддержания молекулярной напряжение, таким образом преобразование силы в флуоресцентного сигнала на молекулярном уровне. Порог напряжения для ее активации перестраиваемой в диапазоне pN 10-60, который также охватывает весь динамический диапазон Интегрин напряженности в клетках. На подложке, привитый с СТС Интегрин напряженности адэрентных клеток визуализированное флуоресценции и отражаться на субмикронном резолюции. ЕЕ также совместим с структурных изображений клеток в живых клеток и фиксированные клетки. ЕЕ успешно применяется для изучения миграции клеток и тромбоцитов сужением. Этот документ подробно описывает процедуры для синтеза и применения ее в исследовании Интегрин передаются сотовый силы.
Клетки полагаются на интегринов присоединиться и оказывают сотовой силы внеклеточного матрикса. При посредничестве Интегрин клеток адгезии и силы передачи имеют решающее значение для ячейки, распространение1,2,3,миграции4и выживания5,6,7. В долгосрочной перспективе Интегрин биомеханических сигнализации также влияет на клетки распространения8,9,10 и дифференциации11,12. Исследователи разработали различные методы для измерения и карта Интегрин передаются сотовый сил в интерфейсе ячейки матрицы. Эти методы основаны на упругие субстрат13, массив micropost14, или атомных сил микроскопии (АСМ)15,16. Эластичные субстрат и micropost методы полагаются на деформации субстратов сообщать клеточного стресса и имеют ограничения с точки зрения пространственного разрешения и заставить чувствительность. AFM имеет чувствительность высокой силы, но он не может обнаружить силы в нескольких местах одновременно, что затрудняет карта сотовой силы передано интегринов.
В последние годы были разработаны несколько методик для изучения клеточных силы на молекулярном уровне. Коллекция молекулярных напряжение датчиков на основе полиэтиленгликоля17,18, паук Шелковый пептид19и ДНК-20,-21,-22,-23 были разработаны для визуализации и мониторинга напряжения, передано низкомолекулярных белков. Среди этих методов ДНК был впервые принят как синтез материала в напряжение датчика троса (TGT), rupturable компоновщик, который модулирует верхний предел Интегрин напряженности в живые клетки22,24. Позже ДНК и флуоресценции техника передачи резонанса были объединены для создания шпильки на основе ДНК флуоресцентные напряжение датчиков сначала Чэня группы23 и Salaita в группы20. Шпилька напряженности на основе ДНК датчик сообщает Интегрин напряженность в режиме реального времени и успешно применяется для изучения ряда клеточных функций21. Потом Ван лаборатории комбинированный TGT с парой Флюорофор утоления доклад Интегрин напряженность. Этот датчик с именем его25,26. Основан на двойной спирали ДНК (dsDNA) и имеет более широкий динамический диапазон (pN 10-60) для калибровки Интегрин напряженности. В отличие от шпильки на основе ДНК датчики ее не сообщают сотовой силы в режиме реального времени, но записывает все события исторического Интегрин как след клеточных сил; Этот процесс накопления сигнала улучшает чувствительность для сотовых силу визуализации, что делает его возможным сотовой силам изображения даже с low-end флуоресцентным микроскопом. Синтез его относительно более удобным, как она создается гибридизировать двух одноцепочечной ДНК (ssDNA).
ЕЕ это 18-base паре dsDNA, конъюгированных с биотин, Флюорофор, утоления (черная дыра утоления 2 [BHQ2])27и циклических Аргинилглициласпарагиновая кислота (РГД) пептида28 как Интегрин пептидных лигандов (рис. 1). Нижняя нить проспряганное с Флюорофор (Cy3 используется в этой рукописи, в то время как другие красители, например Cy5 или Alexa серии, также оказались в нашей лаборатории) и биотин тега, с которым ее это иммобилизованные на подложке биотин авидин Бонд. Верхние пряди проспряганное с пептидной РСЗ и утоления черная дыра, которая утоляет Cy3 с приблизительно 98% тушения эффективности26,27. С протоколом, представленных в настоящем документе плотность покрытия ее на подложке составляет около 1100/мкм2. Это плотность, которую мы ранее калиброванные для 18 bp биотинилированным dsDNA покрытием на подложке neutrAvidin функционализированных следуя то же покрытие протокол29. Когда клетки присоединиться к подложке, с покрытием с ее, Интегрин привязывает ее через РСЗ и передает напряженность для ее. ЕЕ имеет конкретные напряженности терпимости (ТолT), который определяется как порог напряжения, который механически отделяет dsDNA ее в течение 2 s22. ЕГО разрыв Интегрин напряженности приводит к разделение утоления от красителя, который впоследствии испускает флуоресценции. В результате невидимый Интегрин напряжения преобразуется в сигнал флуоресценции и клеточных силы могут быть сопоставлены с флуоресцентным изображений.
Чтобы продемонстрировать применение ее, мы используем рыбы Кератоцит здесь, широко используемых ячеечная модель для клеток миграции исследование30,,3132, Чо-K1 ячеек, часто используемых аэробны клеточной линии и низ 3T3 фибробластов. Также проводится coimaging Интегрин напряженности и клеток структур.
Все методы, описанные здесь были одобрены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC, 8-16-8333-я) из университета штата Айова.
1. синтез интегративной напряжение датчика
2. Подготовка поверхностей, фиксирующий ее на прозрачным дном Петри
Примечание: Реагентов, используемых являются биотинилированным бычьим сывороточным альбумином (БСА биотин), белок авидин и ее. Холод все реагенты и PBS буфера до 0 ° C на льду с ведро льда.
3. ячейки покрытия на его поверхности
4. изображения, запись видео и в реальном времени Интегрин напряженности сопоставления
С ее был захвачен Интегрин напряженности карта рыбы кератиноцитах. Он показывает, что Кератоцит переносит и генерирует Интегрин напряжение на две силы треков (рисунок 2A). Разрешение карты силы был калиброванные быть 0,4 мкм (рис. 2B). Интег?...
ЕЕ является весьма доступным, но мощный метод для сотовых силу сопоставление с точки зрения синтез и применение. Со всеми материалами готова ее может быть синтезирован в течение 1 дня. Во время экспериментов необходимы только три шага поверхности покрытия до ячейки покрытия. Недавно мы ...
Авторы не имеют ничего сообщать.
Эта работа была поддержана Фондом запуска, Университет штата Айова и от национального института Генеральной медицинских наук (R35GM128747).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
BSA-biotin | Sigma-Aldrich | A8549 | |
Neutravidin | Thermo Fisher Scientific | 31000 | |
Streptavidin | Thermo Fisher Scientific | 434301 | |
upper strand DNA | Integrated DNA Technologies | N/A | Customer designed. DNA sequence is shown in PROTOCOL section |
lower strand DNA | Integrated DNA Technologies | N/A | Customer designed. DNA sequences are shown in PROTOCOL section. |
sulfo-SMCC | Thermo Fisher Scientific | A39268 | |
Cyclic peptide RGD with an amine group | Peptides International | PCI-3696-PI | |
IMDM | ATCC | 62996227 | |
FBS | ATCC | 302020 | |
Penicillin | gibco | 15140122 | |
TCEP | Sigma-Aldrich | C4706 | |
200 uL petri dish | Cellvis | D29-14-1.5-N | |
NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | N/A | spectrometer |
SE410 Tall Air-Cooled Vertical Protein Electrophoresis Unit | Hoefer | SE410-15-1.5 | Device for electroporesis |
CHO-K1 cell line | ATCC | CCL-61 | |
NIH/3T3 cell line | ATCC | CRL-1658 | |
Anti-Vinculin Antibody | EMD Millipore | 90227 | Primary antibody for vinculin immunostaining |
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Superclonal Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A28175 | Secondary antibody for vinculin immunostaining |
Alexa Fluor 647 Phalloidin | Invitrogen | A22287 | |
Eclipse Ti | Nikon | N/A | microscope |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены