JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Фильтрация по диагностическим фрагментация, внедрен в МНА, представляет собой элегантный подход после приобретения для проверки наборов данных LC-MS/MS для целых классов как известных, так и неизвестных натуральных продуктов. Этот инструмент ищет MS/MS спектры для ионов продуктов и/или нейтральных потерь, которые аналитик определил как диагностические для всего класса соединений.

Аннотация

Натуральные продукты часто биосинтиразмерные как смеси структурно аналогичных соединений, а не одного соединения. Из-за их общих структурных особенностей, многие соединения в пределах одного класса проходят аналогичную фрагментация MS/MS и имеют несколько идентичных ионов продукта и/или нейтральных потерь. Целью диагностической фильтрации фрагментации (ДФФ) является эффективное обнаружение всех соединений данного класса в сложном экстракте путем скрининга нецелевых наборов данных LC-MS/MS для спектров MS/MS, содержащих специфические ионы продукта и/или нейтральные потери. Этот метод основан на модуле ДФФ, реализуем в рамках платформы с открытым исходным кодом ммпо, которая требует, чтобы образцы проб анализировались с помощью приобретения, зависимого от данных, от масс-спектрометра высокого разрешения, таких как четырехполюсный Орбитрапа или четырехполюсный период времени полета Анализаторы. Основным ограничением этого подхода является аналитик должен сначала определить, какие ионы продукта и/или нейтральных потерь являются специфическими для целевого класса натуральных продуктов. ДФФ допускает последующее обнаружение всех сопутствующих натуральных продуктов в рамках сложного образца, включая новые соединения. В этой работе мы демонстрируем эффективность ДФФ путем скрининга экстрактов aeruginosa, видного вредного цветения водорослей, вызывающего цианобактерии, для производства микроцистинов.

Введение

Тандем масс-спектрометрия (МС/МС) является широко используемым методом масс-спектрометрии, который включает изолирование ионного прекурсора и индуцирование фрагментации через применение энергии активации, например, индуцированной столкновением ДИССОЦИАЦИИ (СИД)1. Манера, в которой фрагменты ионов тесно связана с его молекулярной структурой. Натуральные продукты часто биосинтиразмерные как смеси структурно аналогичных соединений, а не как единое уникальное химическое вещество2. Таким образом, структурно связанные соединения, которые являются частью одного и того же биосинетического класса, часто разделяют основные характеристики фрагментации MS/MS, включая общие ионы продукта и/или нейтральные потери. Способность экрана сложных образцов для соединений, которые обладают класса конкретных ионов продукта и/или нейтральных потерь является мощной стратегией для выявления целых классов соединений, что потенциально приводит к открытию новых натуральных продуктов3, 4 , 5 , 6. на протяжении десятилетий массовые спектрометрии, такие как сканирование нейтральных потерь и сканирование ионов-прекурсоров на аппаратурах с низким разрешением, позволили обнаружить ионы с одинаковой нейтральной потерей или ионами продукта. Однако, специфические ионы или переходы необходимо определить до выполнять эксперименты. Как масс-спектрометры с высоким разрешением стали более популярными в исследовательских лабораториях, сложные образцы теперь обычно проверяются с использованием нецелевых, зависимых от данных методов приобретения (ДВР). В отличие от традиционных нейтральных потерь и сканирования ионов-прекурсоров, структурно связанные соединения могут быть идентифицированы по послеприобретному анализу7. В этой работе, мы демонстрируем стратегию, которую мы разработали называется диагностическая фрагментация фильтрации (ДФФ)5,6, прямой и удобный подход, чтобы обнаружить целые классы соединений в сложных матриц. Этот модуль ДФФ был реализован на платформе с открытым исходным кодом, Мммин 2 и доступен, загрузив 2,38 мин или новых релизов. ДФФ позволяет пользователям эффективно экран DDA наборы для MS/MS спектры, которые содержат продукт Ион (ы) и/или нейтральных потерь (ES), которые являются диагностическими для целых классов соединений. Ограничением ДФФ являются характерные ионы продукта и/или нейтральные потери для класса соединений, которые должны определяться аналитиком.

Например, каждый из более чем 60 различных микотоксина идентифицировали8,9 обладают трикарбаллиевой боковой цепью, которая генерирует m/z 157,0142 (C6H5O5-) продукт Ион на Фрагментация [M-H]- Ion4. Таким образом, все предполагаемые фумонилины в образце могут быть обнаружены с помощью ДФФ путем скрининга всех спектров MS/MS в наборе данных ДВР, которые содержат видный m/z 157,0142 продукт Ион. Аналогичным образом, Сульфированный соединений могут быть обнаружены путем скрининга наборов данных ДВР для MS/MS спектры, которые содержат диагностические нейтральной потери 79,9574 Da (SO3)3. Этот подход также был успешно применен для обнаружения новых циклических пептидов5 и натуральных продуктов, содержащих триптофан или фенилаланин остатков6.

Для того чтобы продемонстрировать эффективность ДФФ и его простоту использования в рамках платформы Ммммин10, мы применили этот подход к анализу микроцистинов (МС); класс из более чем 240 структурно связанных токсинов, производимых пресноводной цианобактерий11,12,13.

Наиболее часто сообщаемых цианотоксинов являются МС, с MC-LR (лейцин [L]/аргинин [R]) конгенер чаще всего изучал (рис. 1). МС-Моноцикл, не-рибосомальных гептапептиды, биосинтроразмерный многочисленными цианобактерий, включая Микроциды, Анабаена, Nostoc, и Планктотрикс12,13. МС состоят из пяти распространенных остатков и двух переменных позиций, занимаемых L-аминокислотами. Почти все МС обладают характерной b-аминокислотой 3-амино-9-метокси-2, 6, 8-триметил-10-фенилдека-4, 6-диеновая кислота (Адда) остаток в положении 511.  МС/МС фрагментация пути МС хорошо описаны14,15; остаток Adda ответственн для видно MS/MS продукт Ион, m/z 135,0803+ (C9H11O+) также, как другие ионы продукта включая m/z 163,1114+ (C11H15 O+) (рис. 2). Нецелевые наборы данных ДВР aeruginosa клеточных экстрактов могут быть проверены на все микроцистины, присутствующие с помощью этих диагностических ионов, предоставляемые микроцистины имеют остаток Adda.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Подготовка нецелевых жидкостных хроматографии (LC)-МС/МС наборы данных

Примечание: ДФФ может быть выполнена с использованием любого высокого разрешения масс-спектрометра и аналитического метода, оптимизированного для целевого класса анализатов. MC оптимизированы условия LC-MS/MS на Спектрометрафовый масс, перечислены в таблице материалов.

  1. Загрузка Мммин 2 (http://mzmine.github.io/)
    Примечание: пример данных CPCC300. RAW можно найти на https://drive.google.com/open?id=1HHbLdvxCMycSasyNXPRqIe5pkaSqQoS0.
    1. В соответствии с методами необработанных данных , напишите меню, выберите параметр импорта необработанных данных .
    2. Выберите файл данных (ы) для анализа. Можно импортировать одиночные или несколько файлов.
  2. Дополнительный Если формат данных поставщика не поддерживается Мммой, используйте Протеомастер16 для создания центроированного файла данных МММЛ.
    1. Выберите пиковый фильтр выбора для применения поставщика, поставляемого в центройдинг-алгоритм.

2. диагностическая фрагментация фильтрации импортируемых файлов ДВР

  1. При помощи курсора выберите и выделите файл данных (ы) в столбце файлов необработанных данных основного экрана ММСО.
  2. В соответствии с визуализацией напишите меню, выберите параметр фильтрации фрагментации диагностики .
  3. В диалоговое окно ДФФ, которое появляется (рис. 3), введите следующие опции:
    1. Время удержания-используйте Автоматический диапазон или определите диапазон времени удержания в течение нескольких минут, когда целевой класс анализатор будет эюту.
    2. Прекурсор m/z -используйте Автоматический диапазон или определите диапазон m/z целевого класса анализатов, включая возможность использования нескольких заряженных соединений при необходимости.
    3. m/z толерантность -ввод достижимости MS/MS массовой точности MSinstrument; 0,01 m/z или 3,0 стр/мин подходит для платформы Орбитпа. Если только ионы диагностического продукта будут расследованы, то входной 0,0 в диагностическое нейтральное значение значения потери (Da) . И наоборот, если будут исследованы только диагностические нейтральные потери, ввод 0,0 в диагностический продукт ионов (m/z) вариант.
    4. Диагностические ионы продукта (m/z) -введите тип специфический Ион продукта (s) m/z. Отделить несколько ионов продукта с запятой.
      Примечание: ввод нескольких ионов продукта визуализирует спектры, содержащие все перечисленные ионы продукта.
    5. Диагностическое нейтральное значение потери (Da) -ввод класса специфическая нейтральная потеря (ES). Отделить множественные нейтральные потери с запятой.
      Примечание: ввод нескольких нейтральных потерь визуализирует спектры, содержащие все перечисленные нейтральные потери. Ввод обоих диагностических продуктов ионов и нейтральных потерь будет визуализировать спектры, которые удовлетворяют всем критериям.
    6. Минимальная диагностическая интенсивность Иона (% базовый пик) – как% от базового пика МС/МС определяют минимальную интенсивность для диагностических ионов продукта и/или нейтральные потери, которые необходимо учитывать.
    7. Peaklist выходной файл -выберите путь и имя файла для вывода результатов.
    8. Нажмите кнопку OK , чтобы начать анализ ДФФ. Участок ДФФ появится после успешного завершения вышеуказанных шагов
      Примечание: два. CCV файлы данных будут генерироваться. {Выходной файл Peaklist}. КС содержит прекурсор m/z, Номера сканирования и время удержания сканирования. Это может быть использовано в существующих модулях Мзмин, включая необработанные методы ≫ пиковое обнаружение > целевое пиковое обнаружение для создания добытых ионов хроматограмм прекурсоров, которые отвечают определенным критериям ДФФ. {Puaklist выходной файл} _data. КС содержит прекурсоры m/z, продукт Ion m/z и время удержания, чтобы позволить генерации участков ДФФ за пределами МЗМ.

3. Пример использования ДФФ для анализа микроцистина

  1. Подготовка образцов
    1. Стерилизовать 250 mL Эрленмейер фляги, содержащие 30 мл стерильных Ма средств массовой информации17 или других бактерий, рост средств массовой информации (BG-11) оснащены пены пробки.
    2. Инокуляции стерилизованных рост СМИ с цианобактерий культуры примерно 5 × 105 клеток мл-1 при асехтических условиях. Монитор плотность клеток с хемоцитометер. В этом примере вырастите M. aeruginosa штамм CPCC300 при температуре 27 °c, освещенный холодным белым люминесцентным светом (30 МКС M-2 s-1) с использованием 12 ч света: 12 ч темного режима. Закружить клетки один раз в день.
    3. Отделить клетки от культуры среды после 26 дней с помощью вакуумной фильтрации с использованием 47 мм диаметром GF/C стекла микрофибры фильтра бумаги.
    4. Добавьте 3 мл 80% метанола (АК) в заготовленных клетках в 14 мл пробирке (ы).
    5. Вихревые и затем sonicate пробирке (ы), содержащие клетки цианобактерий для 30 с каждый. Храните пробирку (ы) при температуре-20 °C для 1 ч. Верните пробирку до комнатной температуры и дайте образцу (ы) оттепель на 15 мин.
    6. Повторите шаг 3.1.5 два дополнительных раза, чтобы эффективно Lyse клетки.
    7. Фильтр полученный экстракт цианобактерий (s) через 0,22 мкм ПТФ шприц фильтр (ы).
    8. Сухой экстракт (ы) с испаритель при температуре 30 °C с использованием мягкого потока азотного газа. Храните экстракт сухим при температуре-20 ° с до анализа LC-MS/MS.
    9. Воссоздать сушеный остаток с 500 мкл 90% метанола (АК) и вихря для 30 s в Янтарный ФЛАКОН HPLC до анализа.
  2. Проанализируйте экстракт цианобактерий с помощью метода приобретения ДВР на масс-спектрометке высокого разрешения.
    Примечание: оптимизированные условия LC-MS для анализа MC, используемые здесь, перечислены в таблице материалов.
  3. Подготовьте данные ДДВР (ы) и импорт в Мммин следующие шаги 1,1 и 1,2.
  4. Выберите файлы данных и запустите модули ДФФ после этапов 2.1-2.2.
  5. Для анализа MC используйте следующие настройки модуля ДФФ (рис. 3).
    1. Время удержания -введите диапазон от 2,00 до 6,00 min.
    2. Прекурсор m/z -входной диапазон m/z 430,00 к 1200,00.
    3. m/z толерантность -применение m/z допуск 0,01 m/z или 3,0 промилле.
    4. Диагностические ионы продукта (m/z) -входной m/z 135,0803, 163,1114 как диагностические ионы продукта
    5. Диагностическое нейтральное значение потери (Da) -ввод 0,0 для определения, что не используются диагностические нейтральные потери.
    6. Минимальная диагностическая интенсивность Иона (% базовый пик) -использование 15,00 как минимальный порог интенсивности
    7. Выходной файл Peaklist -определите выходной файл, как путативе_мкс.КС.
  6. Нажмите кнопку OK , чтобы начать анализ ДФФ. Участок ДФФ (рис. 4) будет отображаться при успешном завершении вышеуказанных этапов

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Участок ДФФ, созданный после анализа M. aeruginosa CPCC300, показан на рисунке 4. X-ось этого участка- m/z ионов-прекурсоров, которые УДОВЛЕТВОРЯЮТ определенным критериям ДФФ, в то время как y-ось показывает m/z всех ионов продукта в спектрах М?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

ДФФ является прямым и быстрая стратегия для обнаружения целых классов соединений, особенно актуально для природного продукта соединения открытия. Наиболее важным аспектом ДФФ является определение конкретных критериев фрагментации МС/МС для целевого класса соединений. В этом репрезе...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать

Благодарности

Авторы благодарят Хизер Рошон (Канадский центр Фитологических культур, Университет Ватерлоо за предоставление изучаемых цианобактерий и Сасан Абушарх (Карлтонский университет) за техническую помощь.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Cyanobacteria
Microcystis aeruginosaCPCC300CANADIAN PHYCOLOGICAL CULTURE CENTRECPCC300https://uwaterloo.ca/canadian-phycological-culture-centre/
Software
Proteowizard (software)softwarehttp://proteowizard.sourceforge.net/
Mzmine 2softwarehttp://mzmine.github.io/
LC-MS
Q-Exactive OrbitrapThermo-Equipped with HESI ionization source
1290 UHPLCAgilentEquipped with binary pump, autosampler, column compartment
C18 columnAgilent959757-902Eclipse Plus C18 RRHD column (2.1 × 100 mm, 1.8 μm)
Solvents
Optima LC-MS grade MethanolFisherA456-4
OptimaLC-MS grade AcetonitrileFisherA955-4
OptimaLC-MS grade WaterFisherW6-4
LC-MS grade Formic AcidFisherA11710X1-AMP
Vortex-Genie 2Scientific IndustriesSI-0236
Centrifuge Sorvall Micro 21Thermo Scientific75-772-436
Other
Amber HPLC vials 2 mL/capsAgilent5182-0716/5182-0717
0.2-μm PTFE syringe filtersPall Corp.4521
Whatman 47mm GF/A glass microfiber filtersSigma-AldrichWHA1820047
Media
MA media (pH 8.6) ( quantity / L)Watanabe, M. F. & Oishi, S. Effects of environmental factors on toxicity of a cyanobacterium (Microcystis aeruginosa) under culture conditions. Applied and Environmental microbiology. 49 (5), 1342-1344 (1985).
Ca(NO3)·4H2O, 50 mgSigma-AldrichC2786
KNO3, 100 mgSigma-AldrichP8291
NaNO3, 50 mgSigma-AldrichS5022
Na2SO4, 40 mgSigma-AldrichS5640
MgCl2·6H20, 50 mgSigma-AldrichM2393
Sodium glycerophosphate, 100 mgSigma-AldrichG9422
H3BO3, 20 mgSigma-AldrichB6768
Bicine, 500 mgSigma-AldrichRES1151B-B7
P(IV) metal solution, 5 mL
Bring the following to 1 L with ddH2O
NaEDTA·2HOSigma-AldrichE6635
FeCl3 ·6H2OSigma-Aldrich236489
MnCl2·4H2OBaker2540
ZnCl2Sigma-AldrichZ0152
CoCl2·6H2OSigma-AldrichC8661
Na2MoO4·2H2OBaker3764
Cyanobacteria BG-11 50X Freshwater SolutionSigma-AldrichC3061-500mL

Ссылки

  1. Mayer, P. M., Poon, C. The mechanisms of collisional activation of ions in mass spectrometry. Mass Spectrometry Reviews. 28 (4), 608-639 (2009).
  2. Fisch, K. M. Biosynthesis of natural products by microbial iterative hybrid PKS–NRPS. RSC Advances. 3 (40), 18228-18247 (2013).
  3. Kelman, M. J., et al. Identification of six new Alternaria sulfoconjugated metabolites by high-resolution neutral loss filtering. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 29 (19), 1805-1810 (2015).
  4. Renaud, J. B., Kelman, M. J., Qi, T. F., Seifert, K. A., Sumarah, M. W. Product ion filtering with rapid polarity switching for the detection of all fumonisins and AAL-toxins. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 29 (22), 2131-2139 (2015).
  5. Renaud, J. B., Kelman, M. J., McMullin, D. R., Yeung, K. K. -C., Sumarah, M. W. Application of C8 liquid chromatography-tandem mass spectrometry for the analysis of enniatins and bassianolides. Journal of Chromatography A. 1508, 65-72 (2017).
  6. Walsh, J. P., et al. Diagnostic Fragmentation Filtering for the Discovery of New Chaetoglobosins and Cytochalasins. Rapid Communications in Mass Spectrometry. , (2018).
  7. Wang, M., et al. Sharing and community curation of mass spectrometry data with Global Natural Products Social Molecular Networking. Nature biotechnology. 34 (8), 828(2016).
  8. Bartók, T., Szécsi, Á, Szekeres, A., Mesterházy, Á, Bartók, M. Detection of new fumonisin mycotoxins and fumonisin-like compounds by reversed-phase high-performance liquid chromatography/electrospray ionization ion trap mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry: An International Journal Devoted to the Rapid Dissemination of Up-to-the-Minute Research in Mass Spectrometry. 20 (16), 2447-2462 (2006).
  9. Bartók, T., et al. Detection and characterization of twenty-eight isomers of fumonisin B1 (FB1) mycotoxin in a solid rice culture infected with Fusarium verticillioides by reversed-phase high-performance liquid chromatography/electrospray ionization time-of-flight and ion trap mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 24 (1), 35-42 (2010).
  10. Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Orešič, M. MZmine 2: modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data. BMC bioinformatics. 11 (1), 395(2010).
  11. Spoof, L., Catherine, A. Appendix 3: tables of microcystins and nodularins. Handbook of cyanobacterial monitoring and cyanotoxin analysis. , 526-537 (2016).
  12. Pick, F. R. Blooming algae: a Canadian perspective on the rise of toxic cyanobacteria. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 73 (7), 1149-1158 (2016).
  13. Carmichael, W. W., Boyer, G. L. Health impacts from cyanobacteria harmful algae blooms: Implications for the North American Great Lakes. Harmful algae. 54, 194-212 (2016).
  14. Mayumi, T., et al. Structural characterization of microcystins by LC/MS/MS under ion trap conditions. The Journal of antibiotics. 59 (11), 710(2006).
  15. Frias, H. V., et al. Use of electrospray tandem mass spectrometry for identification of microcystins during a cyanobacterial bloom event. Biochemical and biophysical research communications. 344 (3), 741-746 (2006).
  16. Kessner, D., Chambers, M., Burke, R., Agus, D., Mallick, P. ProteoWizard: open source software for rapid proteomics tools development. Bioinformatics. 24 (21), 2534-2536 (2008).
  17. Watanabe, M. F., Oishi, S. Effects of environmental factors on toxicity of a cyanobacterium (Microcystis aeruginosa) under culture conditions. Applied and Environmental microbiology. 49 (5), 1342-1344 (1985).
  18. Hollingdale, C., et al. Feasibility study on production of a matrix reference material for cyanobacterial toxins. Analytical and bioanalytical chemistry. 407 (18), 5353-5363 (2015).
  19. Yuan, M., Namikoshi, M., Otsuki, A., Sivonen, K. Effect of amino acid side-chain on fragmentation of cyclic peptide ions: differences of electrospray ionization/collision-induced decomposition mass spectra of toxic heptapeptide microcystins containing ADMAdda instead of Adda. European Mass Spectrometry. 4 (4), 287-298 (1998).
  20. Schymanski, E., et al. Identifying small molecules via high resolution mass spectrometry: communicating confidence. Environmental science & technology. 48 (4), 2097(2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

147LC MS MS

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены