Coincubation Асссе для количественной оценки конкурентных взаимодействий между Vibrio fischeri Изоляты

Резюме

Бактерии кодируют различные механизмы для участия в межбактериальной конкуренции. Здесь мы представляем культурный протокол для характеристики конкурентных взаимодействий между бактериальными изолятами и того, как они влияют на пространственную структуру смешанной популяции.

Аннотация

Данная рукопись описывает культурный, монетный опрос для обнаружения и характеристики конкурентных взаимодействий между двумя бактериальными популяциями. Этот метод использует стабильные плазмиды, которые позволяют каждой популяции быть дифференимно помечены с различными возможностями устойчивости к антибиотикам и флуоресцентные белки для отбора и визуальной дискриминации каждой популяции, соответственно. Здесь мы описываем подготовку и coincubation конкурирующих штаммов Vibrio fischeri, флуоресцентную микроскопию изображений и количественный анализ данных. Этот подход прост, дает быстрые результаты, и может быть использован для определения того, одна популяция убивает или подавляет рост другой популяции, и является ли конкуренция опосредована через диффузионную молекулу или требует прямого контакта клеток. Поскольку каждая бактериальная популяция выражает различные флуоресцентные белки, анализ позволяет пространственной дискриминации конкурирующих групп населения в смешанной колонии. Хотя описанные методы выполняются с помощью симбиотической бактерии V. fischeri с использованием условий, оптимизированных для этого вида, протокол может быть адаптирован для большинства виновных бактериальных изолятов.

Введение

В этой рукописи излагается культурный метод определения того, способны ли два бактериальных изолята к конкурентным взаимодействиям. При изучении смешанных популяций важно оценить, в какой степени бактериальные изоляты взаимодействуют, особенно в том, что изоляты непосредственно конкурируют с помощью механизмов помех. Интерференция конкуренции относится к взаимодействиям, где одна популяция непосредственно препятствует росту или убивает конкурента населения¹. Эти взаимодействия имеют важное значение для выявления, поскольку они могут иметь глубокое воздействие на структуру микробного сообщества и функции^2,3.

Механизмы микробной конкуренции были широко обнаружены в геномах бактерий из различных сред, включая как хос-ассоциированных и свободно живущих бактерий^{4,5,6,7, 8,9}. Различные стратегии конкуренции были описаны^10,11 в том числе диффузивные механизмы, такие как бактерицидные химические вещества^1,12 и секретированные антимикробные пептиды¹³ , а также контактно-зависимые механизмы, которые требуют контакта клетокдля передачи ингибирующего эффектора в клетки-мишени 9,^{14,15,16,17 ,18}.

Хотя культурные монеты обычно используются вмикробиологии 5,^8,19, эта рукопись описывает, как использовать анализ для характеристики механизма конкуренции, а также предложения по адаптации протокол для использования с другими бактериальными видами. Кроме того, этот метод описывает несколько подходов к анализу и представлению данных для ответа на различные вопросы о характере конкурентных взаимодействий. Хотя методы, описанные здесь были использованы ранее для выявления межбактериального механизма убийства, лежащего в основе внутриспецифической конкуренции между симбиотических штаммов coisolated Vibrio fischeri бактерий¹⁹, они подходят для многие бактериальные виды, включая экологические изоляты и патогены человека, и могут быть использованы для оценки как контакт-зависимых, так и диффузионных конкурентных механизмов. Шаги в протоколе могут потребовать оптимизации для других видов бактерий. Учитывая, что все больше модельных систем расширяют свои исследования за пределы использования изогенных организмов, чтобы включить различные генотипы^10,16,20,21, этот метод будет ценным ресурсом для исследователей, стремящихся понять, как конкуренция влияет на многослойные или многовидовые системы.

протокол

1. Подготовка штаммов для Coincubation

1. Выберите соответствующий эталонный штамм, который будет служить мишенью для бактериальной конкуренции во время проверки coincubation. Ознакомьтесь с рекомендациями при выборе эталонного штамма и как эталонный штамм повлияет на результаты. В этом протоколе штамм V. fischeri ES114 будет служить эталонным штаммом.
2. Определение методов отбора и скрининга будет использоваться для разграничения изолятов в монетокубации
   1. Как правило, для выбора для каждого штамма трансформируются штаммы со стабильными плазмидами, содержащими различные гены устойчивости к антибиотикам (например, канамицин или хлорамфеникол), а также гены, кодирующие различные флуоресцентные белки (например, GFP или RFP) различать типы штаммов в кокультуре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Использование стабильных плазмидов необходимо, потому что если штамм теряет плазмид в отсутствие отбора, то номера этого штамма будут занижены при количественном количественном, и не будет визуально обнаруженс с помощью флуоресценционной микроскопии.
   2. Тег coincubated V. fischeri штаммов диффереченно так, что один штамм содержит плазмид pVSV102, который выражает зеленый флуоресцентный белок (GFP) и устойчивость к антибиотику канамицин (Kan^R), и второй штамм содержит плазмид pVSV208, который выражает красный флуоресцентный белок (dsRed) и устойчивость к антибиотику хлорамфеникол (Cm^R)²².
      ПРИМЕЧАНИЕ: Другие различные выборы могут быть использованы для различения coincubating штаммов. Смотрите Обсуждение дополнительных методов.
   3. Включите следующий контроль во время первоначальной оптимизации проверки coincubation, чтобы убедиться, что выбор является надежным. Плита каждого штамма, который диффереденциально помечены на агар пластин, содержащих антибиотик, который должен выбрать против него (т.е., пластины штамм 1 на носителях, что выбирает для штамма 2, и наоборот).
3. За два дня до coincubation асссе, полоса ссылка штамм pVSV102, эталонный штамм pVSV208, и каждый конкурент штамм pVSV208 от -80 КС запасов на LBS агар пластин, содержащих соответствующие антибиотики (например, 100 мкг /мл канамицин или 2 мкг /мл хлорамфеникол) и инкубировать на ночь при 24 градусах Цельсия. Выбор антибиотиков необходим для обеспечения того, чтобы все клетки содержали плазмид в начале эксперимента.
4. За день до проведения асссе, выбрать и restreak четыре отдельных колоний на штамм типа (биологические репликации) на свежие пластины агар LBS с соответствующими антибиотиками и инкубируется на ночь при 24 градусов по Цельсию.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг может потребовать оптимизации для других видов бактерий, так как для получения достаточного количества клеток может потребоваться более длительное или короткое время инкубации в зависимости от темпов роста интересующего организма организма.

2. Кубибет Бактериальные штаммы

1. Подготовка каждого бактериального штамма для инкубации(рисунок 1A)
   1. Используя стерильную зубочистку, соскребите клетки из агаровой пластины (размером с рисовое зерно) и повторно приостановите клетки в микроцентрифуговой трубке объемом 1,5 мл, содержащей 1 мл бульона LBS. Разбейте ячейки сгустки, нажав их в сторону трубки и пипетки вверх и вниз энергично.
   2. Крышка трубки и вихря для 1-2 с. Если ячейки сгустки все еще видны, продолжайте вихрь или пипетка вверх и вниз, пока образец визуально однородный.
   3. Повторите шаги 2.1.1-2.1.2 для всех образцов.
2. Измерьте и запишите оптическую плотность на уровне 600 нм (OD₆₀₀) для всех образцов. Образцы, вероятно, должны быть разбавлены до десяти раз с помощью бульона LBS для получения точного измерения OD. Нормализовать каждый образец до желаемого OD₆₀₀. Штаммы, как правило, нормализованы до OD₆₀₀ й1.0, что переводится как 10⁶ бактерий / мл для V. fischeri.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг может потребовать оптимизации для различных видов бактерий, так как плотность клеток инокулума влияет на результаты coincubation в зависимости от механизма конкуренции. Смотрите обсуждение для оптимизации.
3. Кукуинпромтинг штаммов(рисунок 1B, C)
   1. Смешайте эталонный штамм и напряжение конкурентов в соотношении 1:1 (v/v), добавив 100 мл каждого штамма (нормализованного до OD 1.0) к помеченной 1,5 мл центрифуги трубки. В качестве элемента управления смешайте эталонный штамм с дифференциально помеченной версией самого себя (справочный штамм pVSV102 - эталонный штамм pVSV208). Этот контроль необходим для последующего статистического анализа, чтобы определить, влияет ли наличие штамма конкурентов на рост эталонного штамма. Вихрь смешанной деформации культуры для 1-2 с.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг может потребовать оптимизации, поскольку стартовое соотношение может существенно повлиять на результаты и, возможно, потребуется скорректировать. Смотрите обсуждение для оптимизации.
   2. Повторите шаг 2.3.1 для каждой биологической репликации. После завершения этого шага, должно быть в общей сложности восемь смешанных штаммов трубки: четыре биологических репликации с дифференциально-тегами эталонных штаммов (контроль), и четыре биологических репликации с дифференимно помечены ссылки и конкурент штаммов ( экспериментальных).
   3. Пятно 10 мл каждой контрольной и экспериментальной смеси на пластины Петри, содержащие агар LBS; эти культурные пятна будут использоваться для флуоресценции микроскопии после инкубации.
   4. Разрешить пятна полностью высохнуть на скамейке, пока вся жидкость была поглощена в агар и инкубировать Петри пластин при 24 градусах по 24 ч. Минимум 15 ч требуется для Штаммов V. fischeri, помеченных pVSV102 и pVSV208, чтобы вырасти до достаточно высокой плотности клеток, чтобы визуализировать GFP и RFP, соответственно, на уровне населения с помощью флуоресцентного рассекающего микроскопа. Здесь мы используем 24 ч инкубации для визуализации смешанных пятен.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно использовать пластины, которые не слишком влажные или слишком сухие. Если пластины слишком влажные, пятна для монетней не будут впитываться в агаровую пластину; избегать использования пластин наливают в тот же день. Если пластины слишком сухие, небольшие волны или трещины могут образовываться на поверхности агара, делая пятна монеты нерегулярной формы.
   5. Используя те же бактериальные суспензии, что и в шаге 2.3.3, разместите 10 мл каждой контрольной и экспериментальной смеси в 24-колодские пластины, содержащие 1 мл агара LBS на скважину. Как и в шаге 2.3.3, обеспечить агар в 24-колодцепластинах имеет соответствующую влагу. Разрешить пятна, чтобы высохнуть полностью и инкубировать при 24 градусах по Цельсию в течение 5 ч. Эти культурные пятна будут использоваться для количественной оценки подразделений, формирующих колонии (CfUs) для каждого штамма в конце эксперимента.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обнаружение бактериальных суспензий для роста в отдельных скважинах позволяет легче повторного вконечном времени. Этот шаг может быть выполнен с помощью квадратных стерильных частей фильтра в качестве более экономичный подход к использованию 24-коловидной пластины. Квадратные стерильные кусочки фильтра могут быть размещены на агарпластинке, и 10 мл каждой экспериментальной смеси могут быть замечены на этих фильтрах, а не на 24-колодцах. После чеканки фильтры могут быть перенесены в 1,5 мл центрифуги трубки и coincubation пятно может быть resuspended путем вихря или пипетки вверх и вниз. 5 ч инкубационного времени достаточно для обнаружения межбактериальных убийств между V. fischeri изолирует¹⁹, однако, это время coincubation, возможно, потребуется короче или дольше для других видов или конкурентных механизмов. Более подробную информацию можно узнать из обсуждения.
4. Серийное разбавление для начала инокулума
   1. Для выполнения серийного разбавления стартовых монетокубационных смесей, поверните 96-колодцовную пластину 90 ", так что есть восемь колонн и двенадцать рядов. Каждая строка будет содержать образец неразбавленной смеси в первой колонке, а затем семь десятикратных серийных разбавлений через оставшиеся скважины в строке(рисунок 2A).
   2. Наметьте каждую строку идентификатором деформации, номером репликации и временем (начиная инокулум и T0). Этикетка LBS агар пластины дополнены соответствующим антибиотиком, на котором обнаружить разбавления серии. Не забудьте определить, какой штамм каждая пластина антибиотиков выбирает для.
   3. Используя многоканальную пипетку, добавьте 180 мл бульона LBS к каждой скважине, оставляя первую колонку пустой для неразбавленной смеси coincubation.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Исследователи могут выбрать для использования фосфата буферного солевой раствор (PBS) для повторного coincubation пятна и выполнять серийное разбавление при работе с особенно быстро растущих бактериальных видов или последовательно выполняя крупные эксперименты, где серийные разбавления могут занять долгое время, чтобы выполнить. Использование PBS в этих случаях предотвратит значительный рост бактерий в процессе выполнения серийных разбавлений. Однако важно соответствовать тому, какое решение используется (например, PBS или LBS) во всех экспериментах, независимо от их размера или продолжительности.
   4. Используя 200 мл одноканального пипетки, перенесите 100 мл смеси монеты из трубки в первую колонку. Отбросьте кончик и повторите для всех монетокубационных смесей.
   5. Используя многоканальный пипетки, перенесите 20 мл от столбца 1 на 2 и смешайте, прокладывая вверх и вниз. Откажитесь от кончиков и повторите для каждого столбца так, чтобы к концу каждого ряда было десятикратное серийное разбавление первоначальной смеси coincubation.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте в соответствии с количеством раз раз разбавления трубчатые вверх и вниз. Например, угнение ручки пипетки пять раз для каждого разбавления, чтобы быть последовательным по всей серии разбавления.
   6. Используя многоканальный пипетка, оснащенный восемью наконечниками, аспир 5 мл от каждой скважины в серии разбавления (т.е. один ряд из восьми скважин) и наместите его на агарную пластину LBS, которая выбирает для эталонного штамма (дополненный канамицином). Повторите этот шаг пятнистость на пластине выбора для конкурента штамма (дополнены хлорамфеникол)(рисунок 2B). Разрешить пятна полностью высохнуть до размещения в инкубаторе.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Те же советы могут быть использованы для обнаружения репликации разбавления серии на пластинах выбора для ссылки и конкурента штамма, но должны быть изменены между репликациями. Избегайте прикосновения к концу пипетки наконечник агар пластины, как это может создать депрессию, которая может напоминать бактериальной колонии и перекос результаты во время пластины рассчитывает. Если наконечник действительно касается пластины, сделать заметку и не включать депрессию в колонии рассчитывает.
5. Проведение окончательных измерений T
   1. После coincubation пятна в 24-колодце пластин были инкубированы в течение 5 ч при 24 градусах Цельсия, добавить 1 мл бульона LBS к каждой скважине и resuspend монеты пятна пайпеттинг вверх и вниз, пока все клетки повторно. Будьте в соответствии с силой, в которой клетки переприкиваются во всех репликациях. Например, угнетайте ручку пипетки восемь раз, чтобы полностью восстановить каждый образец.
   2. После того, как каждое место coincubation resuspended, подготовить 96-ну хорошо пластины для серийного разбавления и LBS агар пластины с соответствующими антибиотиками, на которых обнаружить разбавления таким же образом, как шаг 2.4.1.
   3. Выполните шаги 2.4.2-2.4.6 для завершения серийного разбавления для окончательных измерений T.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важный контроль должен быть включен в ходе первоначальной оптимизации проверки coincubation. В конце периода coincubation, пластины смешанных штаммов на средства массовой информации, которая включает в себя оба антибиотика. Ни один из штаммов не должен расти, если 1) спонтанная мутация происходит, или 2) выбираемые маркеры обмениваются между штаммами.

3. Визуализация Coincubations использованием флуоресценции микроскопии

1. Изображение каждого пятна coincubation на пластинах lbS agar Petri со ступеней 2.3.3 и 2.3.4 с помощью стерео микроскопа, оборудованного для обнаружения зеленой и красной флуоресценции, которые соответствуют белкам флуоресценции, выраженным на стабильных плазмидах.
2. Начните с изображения контрольного пятна монеты (ссылка штамм pVSV102 - эталонный штамм pVSV208).
   1. Отрегулируйте увеличение так, чтобы пятно находится в фокусе.
   2. Используя соответствующий свет возбуждения и фильтр для наблюдения GFP, отрегулируйте время экспозиции, чтобы обнаружить только флуоресценцию от пятна coincubation и любой фоновой флуоресценции от средств массовой информации является низким или не видимым.
   3. Измените свет возбуждения и фильтр для наблюдения RFP, регулируя время экспозиции, чтобы свести к минимуму фон от среды.
3. Для каждого пятна coincubation от экспериментальных методов лечения, изображение для эталонного штамма с помощью фильтра GFP и время экспозиции определяется в шаге 3.2.2.
4. Изображение штамма конкурента с помощью фильтра RFP, регулируя время экспозиции так, что флуоресценция наблюдается только от пятна coincubation и фоновая флуоресценция от среды минимальна. Сохранить оба изображения и назвать их, чтобы включить оба идентизации штамма, номер репликации, время инкубации, когда изображение было принято (например, 24 ч). Повторите для всех репликатов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Время coincubation может быть отрегулировано для по-разному плазмидов или бактериальных видов. Смотрите обсуждение для оптимизации.

4. Анализ данных

1. Расчет CfUS для каждого контрольного и экспериментального лечения в каждый временной момент (T старт и T final)
   1. После того, как колонии видны на серийных разбавления пластин (например, 24 ч при 24 градусах По Цельсия для V. fischeri),определить фактор разбавления, где отдельные колонии могут быть подсчитаны и не выросли вместе в большие, многоколониальные кластеры(рисунок 2B). Для каждого репликации, подсчитайте и запишите количество отдельных колоний для данного разбавления. Это число представляет cfUs для этой репликации.
   2. Преобразуйте CfUs для разбавления в общую сумму CFUs для каждого штамма в coincubation с помощью формулы ниже:
      - CFUS (фактор разбавления x vol. места разбавления) х vol. неразбавленного образца - общий CFUs
      Пример: T0: (6 CFUs)
      T5: (4 CFUs) ( (10 х-3 х 0,005 мл) х 1,0 мл-
      Значения CFU для каждого штамма в каждой точке времени являются необработанными данными, которые могут быть использованы для нескольких различных анализов и статистических тестов (см. раздел 4.2 ниже).
2. Выполните следующие преобразования данных, чтобы определить, является ли штамм конкурента outcompetes эталонного штамма: (i) определение того, уменьшается доля эталонного штамма в присутствии штамма конкурента, или (ii) расчет относительного конкурентного индекса (RCI). Эти анализы преобразуют исходные данные в соотношения и могут быть полезны для определения конкурентного результата взаимодействия, но не могут определить механизм конкуренции (т.е. убийство против ингибирования роста).
   1. Расчет доли каждого штамма для каждого момента во время чеканки
      1. Преобразуйте данные CFU в долю каждого штамма в лечении. Для эталонного штамма (RS) на T0 разделите общий CFUs для эталонного штамма на T0 на сумму общего CFUs для эталонного штамма и конкурента (CS) на T0:
         RS_T0 CFUs (RS_T0 CFUs - CS_T0 CFUs) - Пропорция эталонного штамма на T0.
         Выполните тот же расчет, чтобы определить долю штамма конкурента на T0:
         CS_T0 CFUs (RS_T0 CFUs - CS_T0 CFUs) - Пропорция эталонного штамма при T0
         Повторите этот процесс для каждого момента и реплицировать для экспериментального лечения и контроля лечения (дифференциально помечены ссылка штамм coincubation).
      2. График средняя доля каждого типа штамма на T0 и T5 в сложенный график бар(рисунок 3A).
      3. Обеспечить получение желаемого стартового соотношения штаммов. Для coincubations, где штаммы были первоначально смешаны 1:1, каждый тип штамма должен составлять 0,5 от населения на T0 и не должны статистически отличаться друг от друга с помощью T-тест студента (P Если доля одного штамма значительно больше, чем у другого штамма на T0, то повторяйте эксперимент до достижения стартового коэффициента 1:1.
      4. Определите, состоит ли штамм конкурента значительно большую долю населения после 5 ч. Выполните t-тест студента, сравнивая долю каждого штамма в экспериментальном лечении на T0 и T5. Если доля штамма конкурентов значительно отличается от эталонного штамма на T5 (P qlt; 0.05), этот результат предполагает, что конкуренция штамма, возможно, имели место. Переход к шагу 4.2.1.5.
      5. Чтобы определить, уменьшило ли наличие штамма конкурента пропорцию эталонного штамма после 5 ч, выполните T-тест студента, сравнивая пропорцию эталонного штамма в контроле с долей эталонного штамма в экспериментальное лечение (справочный штамм против напряжения конкурента).
         ПРИМЕЧАНИЕ: Если доля эталонного штамма статистически ниже в экспериментальном лечении по отношению к контролю (P qlt; 0.05), то напряжение конкурента значительно уменьшило пропорцию эталонного штамма после 5 ч и вне себя эталонного штамма.
   2. Расчет значения RCI журнала для каждого лечения (включая контроль)
      ПРИМЕЧАНИЕ: Относительный конкурентный индекс, или RCI, представляет собой единое значение, которое сравнивает, как конечное соотношение типов деформации отличается от исходного коэффициента. Значение RCI преобразуется таким образом, что значение rcI журнала больше нуля указывает на напряжение конкурента (CS), превысив референтное значение (RS), значение журнала RCI менее нуля указывает на то, что эталонный штамм превысился напряжение конкурентов, а журнал RCI значение нуля указывает на то, что ни один из штаммов не был перебором.
      1. Рассчитайте значения RCI журнала для каждого управления и экспериментального лечения с помощью следующего уравнения:
         Войти в журнал (CS_T5 CFU и RS _T5 CFUs)
      2. Значение журнала RCI с помощью разделенной коробки и усов, где данные отображаются в горизонтальном направлении(рисунок 3B).
      3. Определите, значительно ли отличается каждая обработка от нуля, выполняя t-тест студента, сравнивая значения RCI журнала каждого лечения (включая элемент управления) с набором данных, сравнивая одинаковое количество репликаций с нулевым значением. Если значения журнала RCI для экспериментального лечения статистически больше нуля (P qlt; 0.05), то штамм конкурента превалировал эталонный штамм.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Контроль не должен статистически отличаться от нуля (P 0.05), потому что дифференциально помеченные эталонные штаммы являются изогенными.
      4. Выполните T-тест студента, чтобы определить, были ли значения RCI журнала для экспериментального лечения значительно больше, чем контроль (P qlt; 0.05). Если значения RCI журнала от экспериментального лечения статистически больше, чем контрольная обработка, то штамм конкурента переоценил эталонный штамм.
3. Выполните следующий статистический анализ, чтобы определить механизм, с помощью которого штамм конкурента превосходит эталонный штамм: (i) анализ необработанных общих данных CFU, или (ii) изучить процентное восстановление эталонного штамма. Эти анализы могут быть более громоздкими для просмотра по отношению к тем, от шага 4.2, но будет определить, является ли конкурент штамм outcompetes эталонный штамм, перерастая его, препятствуя росту эталонного штамма, или активно устраняя эталонный штамм.
   1. Анализ необработанных общих данных CFU
      1. График сырья общие данные CFU для обоих штаммов с помощью переплетенного рассеяния участок, где репликации показаны в виде отдельных точек данных (Рисунок 4A). Отображение данных в масштабе журнала и добавление горизонтальной линии, указывающей на средние CФУ T0 для обоих штаммов.
      2. Чтобы определить, влияет ли наличие штамма конкурента негативно ещивающее референтное напряжение, выполните t-тест студента, сравнивая референтный штамм CFUs для контроля и экспериментального лечения на T5. Если эталонный штамм CFUs в экспериментальном лечении статистически ниже, чем в контрольном (Pqlt; 0.05), то наличие штамма конкурента значительно повлияло на эталонный штамм.
      3. Чтобы определить, является ли наличие штамма конкурента либо ингибирует рост или устранены ссылка штамма, выполнить T-тест студента сравнения эталонного штамма CFUs на T0 и T5 для контроля и экспериментального лечения.
         ПРИМЕЧАНИЕ: В отсутствие конкурента, эталонный штамм должен показать значительное увеличение CFU при сравнении T0 и T5 для контрольного лечения. При анализе экспериментального лечения, если эталонный штамм CFUs на T5 статистически не отличаются по сравнению с T0 (P 0,05), то штамм конкурента тормозил рост эталонного штамма. Если эталонный штамм T5 CFUs значительно ниже, чем T0 CFUs (Pqlt; 0.05), то штамм конкурента убил эталонный штамм.
   2. Расчет процентного восстановления эталонного штамма
      1. Преобразование общих данных CFU для эталонного штамма (RS) в данные о процентном восстановлении с помощью ниже приведенного уравнения:
      2. (RS_T5 CFUs - RS_T0 CFUs) x 100 - % восстановление эталонного штамма
      3. Отображение процентного восстановления эталонного штамма с помощью разделенного графика бара, где каждый бар представляет либо контроль или экспериментальное лечение(рисунок 4B). Добавьте пунктирную линию на уровне y 100, чтобы указать 100% восстановление эталонного штамма (без увеличения или уменьшения референтного штамма CFUs с 0 ч до 5 ч).
      4. Чтобы определить, является ли напряжение конкурента негативно повлияло на эталонный штамм, выполните T-тест студента, сравнивая восстановление эталонного штамма для контрольного лечения с экспериментальным лечением. Если процентное восстановление значительно меньше, чем контроль (Pqlt; 0.05), то напряжение конкурента негативно повлияло на эталонный штамм.
      5. Чтобы определить, является ли штамм конкурента тормозил рост или устранить эталонный штамм, выполнить T-тест студента сравнения эталонного штамма процент восстановления для экспериментального лечения и набор данных с тем же количеством репликаций все с значение 100.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Если экспериментальное лечение статистически не отличается от 100 (P 0.05), то штамм конкурента тормозил рост эталонного штамма. Если эталонный штамм процент восстановления в экспериментальном лечении значительно ниже, чем 100 (P lt; 0,05), то конкурент штамм убил эталонный штамм.
   3. Интерпретация флуоресцентных микроскопических изображений
      1. После того, как флуоресцентные микроскопии изображения принимаются, определить, является ли каждый штамм заметно обнаружить в месте coincubation. Для контрольной монеты (справочный штамм pVSV102 - эталонный штамм pVSV208) как GFP, так и RFP должны быть видны с одного места монетопоиска. Если это не так, назначьте эксперимент снова обеспечения штаммов должным образом помечены и придуманы на безантибиотиков пластин.
      2. Для каждого экспериментального пятна coincubation, проверьте возможные результаты.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Если штамм конкурента виден, но эталонный штамм не обнаружен, это говорит о том, что штамм конкурента погибает или тормозит рост эталонного штамма. Если оба штамма присутствуют и равномерно смешаны (GFP и RFP присутствуют на протяжении всего пятна coincubation), эти данные свидетельствуют о том, что штамм конкурента не конкурирует с эталонным напряжением, и оба штамма сосуществуют. Если оба штамма присутствуют, но пространственно разделены (микроколонии либо GFP или RFP присутствуют по всему пятну coincubation), что предполагает, что эталонный штамм и напряжение конкурентов могут участвовать в конкурентных взаимодействиях и модификациях может потребоваться эталонный штамм или начальное соотношение монеток. Более подробную информацию можно узнать из обсуждения.

5. Определение того, зависит ли взаимодействие от контактов

ПРИМЕЧАНИЕ: Если вы обнаружите, что один штамм убивает или подавляет эталонный штамм, взаимодействие может быть диффузионным или контактным. Чтобы определить, зависит ли взаимодействие от контакта клеток, выполните проверку чеканки, как описано выше, для шагов 1-2 со следующими изменениями.

1. Выполните шаги 1.1-2.2.
2. После нормализации штаммов физически отдельные штаммы с помощью фильтра нитроцеллюлозы с размером пор0,22 мм. Этот размер пор позволяет диффузии противомикробных препаратов и малых молекул, но предотвращает физический контакт между клетками V. fischeri.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если взаимодействие зависит от контакта клеток, разделение эталонного штамма от штамма конкурента с фильтром должно аннулировать убийство или ингибиторфесвоего фенотипа и эталонный штамм не должен был уменьшить CFUS. Если взаимодействие не зависит от контакта клеток, и является диффузионным механизмом, разделение штаммов не должно препятствовать штамму конкурента убить эталонный штамм.
   1. Найдите 5 мл эталонной деформации на центр фильтра и напрягите 5 мл напряжения конкурента на центр другого фильтра. Поместите фильтр, содержащий эталонную деформацию, на поверхность агарной пластины LBS. Поместите фильтр, содержащий напряжение конкурента непосредственно на верхней части фильтра с эталонным напряжением.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый штамм пятнистый на фильтры, а не нижней деформации пятнистый непосредственно на агар пластины так штаммы могут быть более легко размещены непосредственно друг на друга.
   2. Если есть опасения, что штаммы не укладываются непосредственно друг на друга, уменьшить объем эталонного штамма inoculum пятнистый на фильтр. Это обеспечит площадь эталонного места штамма меньше и полностью выше или ниже напряжения конкурента. Альтернативные, какие штаммы сверху и на дне, чтобы объяснить различия в диффузии питательных веществ из агар среды.
   3. Для обеспечения фильтр ампипулы позволяет диффузии малых молекул, включают контрольную обработку, где эталонный штамм пятнистый на фильтр и антибиотик, что он чувствителен к (хлорамфеникол) пятнистый на другой. Стек фильтры непосредственно друг на друга и место на пластине агар LBS. Антибиотик должен быть в состоянии распространяться через фильтр и должен убить эталонный штамм.
3. Инкубировать пластины с фильтрами при 24 градусах по 5 ч. Не инвертировать агар пластины при инкубации, чтобы избежать перемещения фильтров.
4. Выполните серийные разбавления для стартового инокулума в соответствии с шагом 2.4.
5. Проведение окончательных измерений T
   1. Используя стерильные пинцеты, перенесите каждый набор фильтров в трубку Falcon мощностью 50 мл, содержащую 5 мл бульона LBS. Убедитесь, что фильтры физически разделены внутри трубки, чтобы обеспечить полную перезагрузку каждого типа штамма.
   2. Resuspend штаммов из фильтров путем pipetting вверх и вниз, пока фильтры не будут очищены от всех клеток. Используйте пинцет для поворота фильтров и прозрачного клеточного материала с обеих сторон. Стерилизовать пинцет с этанолом между образцами.
   3. Выполните серийное разбавление для T финала в соответствии с шагом 2.5. При расчете общего CFUs для T final отрегулируйте "общий объем неразбавленной выборки" с 1 мл до 5 мл.

Результаты

Для оценки конкурентного взаимодействия между бактериальными популяциями был разработан и оптимизирован протокол проверки монеток для V. fischeri. Этот метод использует стабильные плазмиды, которые кодируют гены устойчивости к антибиотикам и флуоресцентные белки, ...

Обсуждение

Анализ монетокубации, описанный выше, представляет собой мощный метод обнаружения межбактериальной конкуренции. Такой подход позволил выявить внутривидовую конкуренцию среди изолятов V. fischeri и характеристику конкурентного механизма^19. Хотя описанный метод был оптим...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Microcentrifuge Tubes	Fisher	05-408-129
10 μL multichannel pipette
100 μL multichannel pipette
300 μL multichannel pipette
10 μL single channel pipette
20 μL single channel pipette
200 μL single channel pipette
1000 μL single channel pipette
24-well plates	Fisher	07-200-84	sterile with lid
96-well plates	VWR	10062-900	sterile with lid
Calculator
Chloramphenicol	Sigma	C0378	stock (20 mg/mL in Ethanol); final concentration in media (2 μg /mL LBS)
Fluorescence dissecting microscope with camera and imaging software
forceps	Fisher	08-880
Kanamycin Sulfate	Fisher	BP906-5	stock (100 mg/mL in water, filter sterilize); final concentration in media (1 μg/mL LBS)
Nitrocellulose membrane (FS MCE, 25MM, NS)	Fisher	SA1J788H5	0.22 μm nitrocellulose membrane (pk of 100)
petri plates	Fisher	FB0875713	sterile with lid
Spectrophotometer
Semi-micro cuvettes	VWR	97000-586
TipOne 0.1-10 μL starter system	USA Scientific	1111-3500	10 racks
TipOne 200 μL starter system	USA Scientific	1111-500	10 racks
TipOne 1000 μL starter system	USA Scientific	1111-2520	10 racks
Vortex
Name	Company	Catalog Number	Comments
LBS media
1M Tris Buffer (pH ~7.5)			50 mL 1 M stock buffer (62 mL HCl, 938 mL DI water, 121 g Trizma Base)
Agar Technical	Fisher	DF0812-17-9	15 g (Add only for plates)
DI water			950 mL
Sodium Chloride	Fisher	S640-3	20 g
Tryptone	Fisher	BP97265	10 g
Yeast Extract	Fisher	BP9727-2	5 g