Анализ РНК-блотов для обнаружения и количественной оценки микроРНК растений

Резюме

Этот метод демонстрирует использование метода северной гибридизации для обнаружения miRNAs от общего экстракта РНК.

Аннотация

МикроРНК (miRNAs) являются классом эндогенно выраженных некодирующих, 21 nt малых РНК, участвующих в регуляции экспрессии генов как у растений, так и у животных. Большинство миРНК действуют как отрицательные переключатели экспрессии генов, нацеленные на ключевые гены. В растениях первичные миРНК (pri-miRNAs) транскрипты генерируются РНК-полимеразой II, и они образуют различную длину стабильных структур стволовых циклов, называемых премиРНА. Эндонуклеазы, Dicer-like1, обрабатывает премиРНК в дуплексы миРН-миРНАЗ. Одна из нитей из дуплекса miRNA-miRNA выбирается и загружается на белок Argonaute 1 или его омологи, чтобы остеклеть расщепление мРНК. Хотя миРНК являются ключевыми сигнальными молекулами, их обнаружение часто осуществляется менее оптимальными методами на основе ПЦР вместо чувствительного северного анализа помарки. Мы описываем простой, надежный и чрезвычайно чувствительный северный метод, который идеально подходит для количественной оценки уровней миРНК с очень высокой чувствительностью, буквально из любой ткани растений. Кроме того, этот метод может быть использован для подтверждения размера, стабильности и обилия miRNAs и их предшественников.

Введение

Недавнее открытие небольших регуляторных РНК, микроРНК, привело исследования в понимании их и их роль в растениях и животных¹. Длинные прекурсоры miRNAs обрабатываются в 21 до 24 nt зрелых miRNAs HYL1 и конкретных dicer-как белки^2,3. 22 nt miRNA может инициировать каскадное заглушение, генерируя вторичные siRNAs^4. Исследования показали роль miRNAs и вторичных siRNAs в развитии, судьба клеток и стресс ответы^5,6.

Северная гибридизация является экспериментальным методом, обычно используемым для обнаружения конкретных молекул РНК. Этот метод настраивает его использование в обнаружении примерно 19 -24 nt длинных малых РНК из пула общего RNAs⁷. В этой демонстрации мы иллюстрируем использование этого метода для обнаружения и количественной оценки миРНК. Этот метод использует маркировку зондов с использованием радиоизотопов; таким образом, уровни миРНК в образце могут быть обнаружены с повышенной чувствительностью. В отличие от методов на основе ПЦР, этот метод обеспечивает количественную оценку экспрессии, а также определение размера miRNAs. В этом протоколе мы показываем важные шаги, которые улучшают обнаружение miRNA. Мы модифицировали шаги в blotting и гибридизации для получения высокого разрешения обнаружения сигнала miRNAs. Этот метод также может быть использован для обнаружения других эндогенных малых РНК, таких как siRNAs, tasi-вторичных РНК и snoRNAs.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Приготовление 15% денатурированного полиакриламида гель

1. Взвешивать и добавлять 4,8 г мочевины, добавить 3,75 мл 40% акриламида: бисакриламид (19:1) раствор и 1 mL 10x TBE pH 8.2 в стерильную трубку 50 мл.
2. Растворите мочевину с помощью водяной ванны, установленной при 60 градусов по Цельсию, в четкий раствор.
3. Макияж объема до 10 мЛ с использованием свежеавтонатуренной стерильной воды и охладить гель смесь до комнатной температуры.
4. Приготовьте свежий 10% (w/v) раствор аммония персульфата.

2. Сборка стеклянных пластин и электрофорезного блока

1. Вымойте весь аппарат, необходимый для геля электрофорез и электро-blotting с моющим средством. Аккуратно скраб их с помощью мягкой губкой, чтобы удалить остаточный буфер и акриламид, промыть водой и дать им высохнуть.
2. Соберите оба стеклянные пластины вместе и поместите их твердо на губку. Используйте 1 мм толщиной пластины для этой установки. Убедитесь, что пластины находятся на том же уровне, чтобы избежать утечки.
3. К 10 мл геля смеси добавьте 8 МЛ TEMED и 80 мл свежеприготовленного 10% (w/v) раствор аммония.
4. Без промедления, аккуратно перемешать и залить это между собранными стеклянными пластинами. Поместите гребень тщательно. Избегайте генерации пузырьков воздуха на этом этапе.
5. Разрешить гель полимеризировать в течение примерно 45 мин.
6. Вымойте полимеризованный гель с стерильной водой, прежде чем поместить внутри гель работает установки.
7. Соберите пластины внутри бегущей кассеты и аккуратно снимите гребень.
8. Налейте свежеприготовленные стерильные 1x TBE, рН 8.2 в бак.
9. Тщательно вымойте колодцы, трубив буфер для удаления кристаллов соли. Этот шаг помогает образцу РНК работать равномерно через гель.
10. Выполните предварительный запуск на 80 V в течение 30 минут.

3. Подготовка погрузочного красителя и образцов

1. Для 10 мл гель нагрузки красителя, весить 5 мг бромофено голубого, 5 мг ксилен цианола, добавить 10 мл деионированного формамида тщательно и хорошо перемешать их.
2. Aliquot 10 мкг общей РНК в стерильную трубку 1,5 мл и высушите образцы с помощью speedvac. Не переувяхайте образцы.
3. Повторное увеличение образцов РНК в 8 мл загрузки.
4. Нагрейте образцы при температуре 98 градусов по Цельсию в течение 2 минут, охладите в течение 1 мин на RT, вихрь и спина образцов, в течение 3 раз. Этот шаг необходим для правильной резусения и, в свою очередь, это помогает в равной загрузке образцов.

4. Гель электрофорез

1. Остановить предварительное запуск и вымыть скважины перед загрузкой образца.
2. Нагрейте образцы при температуре 98 градусов по Цельсию в течение 1 мин и загрузите образцы горячими в колодец с помощью капиллярных наконечников. Вставьте кончик на дно колодца, чтобы образец занимал один тонкий слой в колодце.
3. Полная загрузка всех образцов. Включите для загрузки маркера десятилетия РНК.
4. Выполнить гель на 80 В до бромофенола синий краситель работает почти полностью. Бромофенол синий работает на 10 bp в 15% денатурации акриламид гель.

5. Подготовка к электро-размыву

1. Вырежьте НЗюлоновую мембрану до размеров стеклянной пластины и отметьте мембрану в правом верхнем углу карандашом HB.
2. Аккуратно поместите мембрану на поверхность стерильной воды, обращенной к обозначенной стороне к поверхности воды. Предварительно замочите мембрану в течение 15 мин.
3. Вырезать 4 куска промокания бумаги я в размерах волокна площадку.
4. Приготовьте сэндвич с гелем для размещения серой стороны кассеты в чистый лоток.
5. Предварительно промокнуть волокна площадку и поместите его на кассету. Удалите пузырьки воздуха.
6. Предварительно мокрый один кусок пятно бумаги в 1x TBE и место над волокна площадку. Удалите пузырьки воздуха, прокатки пластиковый пипетки над бумагой. Положите еще один кусок предварительно мокрой промокальной бумаги и удалить пузырьки воздуха.
7. Тщательно удалите гель из беговой кассеты и поместите его над сэндвич установки, таким образом, что первый загруженный образец РНК вправо.
8. Аккуратно окуните предварительно пропитанную мембрану в 1x TBE и поместите ее на гель, стоящие перед маркированной стороной вниз. Раскатать, чтобы удалить пузырьки воздуха.
9. Опустите кусок промокания бумаги, положите его на мембрану и удалите пузырьки воздуха. Dip еще один кусок blotting бумаги, поместите его на сэндвич установки и удалить пузырьки воздуха.
10. Заполните сэндвич, поместив предварительно мокрый волокна площадку над установкой и твердо закрыть кассету.
11. Поместите трансблот кассету в модуль и заполните 1x TBE, рН 8.2 до знака промокания.
12. Трансфер при 10 В, ночь при 4 градусах Цельсия.
13. После передачи поместите влажную мембрану на бумажный лист и немедленно перекрещиваем РНК к мембране путем облучения 254-нм УФ-излучением (120 000 юулов/см2). Кросс-связанные помарки, возможно, хранятся при 4 градусов по Цельсию для дальнейшей гибридизации.

6. Подготовка радиомаркированного зонда

1. Дизайн зонда, который полностью дополняет небольшой РНК, которая должна быть обнаружена.
2. Конец этикетки зонда с использованием ƳP³²ATP (получено из BRIT) в конце 5' путем объединения компонентов в соответствии с рецептом, представленным в таблице 1.
3. Инкубировать вышеупомянутую реакцию смеси при 37 градусов по Цельсию в течение 30 мин.
4. Отдельные немаркированные ƳP³²АТФ от зонда с помощью колонки Sephadex G-25 в соответствии с протоколом производителя.

7. Гибридизация помарки

1. Поместите скрещенные связаны пятно, РНК стороны перед верхней внутри бутылки гибридизации.
2. Энергично смешайте сверхчувствительный буфер гибридизации, добавьте 10 мл и инкубировать пятно внутри печи гибридизации, поддерживаемой при температуре 35 градусов по Цельсию, с вращением.
3. Выполните до гибридизацию в течение 20 мин.
4. Выньте бутылку из духовки и аккуратно добавьте маркированный зонд в буфер гибридизации.
5. Гибридизируйте помарку при 35 градусов по Цельсию, с вращением на 12 ч.
6. После гибридизации тщательно перенесите раствор гибридизации в 15-мл-трубу. Это решение может храниться при 4 градусах цельсия до повторного использования.
7. Выполните быструю стирку помарки в течение 2 минут, чтобы удалить избыток решения гибридизации, добавив 2x буфер SSC плюс 0,5% SDS. Откажитесь от решения.
8. Инкубировать пятно с 2x буфером SSC плюс 0,5% SDS для 35 градусов по Цельсию, с вращением в течение 30 мин.
9. Вымойте пятно снова с 0,5x SSC буфер плюс 0,5% SDS для 35 "C, с вращением в течение 30 мин.
10. Поместите пятно внутри крышки гибридизации, удалите избыточный буфер и запечатайте его.
11. Подвергнуть его радиации свободного фосфора изображения экрана на ночь внутри кассеты.
12. Обнаружить сигнал гибридизации с помощью биомолекулярного изображения и проанализировать результаты с помощью подходящего программного обеспечения.
13. Полоса пятно путем инкубации его при 80 градусов по Цельсию, с вращением в течение 30 мин с 0,5 X SSC буфер плюс 0,1% SDS и 0,1 X SSC буфер плюс 0,1% SDS в течение 30 мин.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

В этой демонстрации, мы обнаружили и количественно выражение miR397 в различных тканях риса Indica var whiteponni (Рисунок 1). miR397 является 22 nt miRNA и сохраненной миРНК. Выражение miR397 можно обнаружить во всех проверенных образцах. Согласно данным секвенирования следующего по?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Этот метод может широко использоваться для обнаружения и количественной оценки малых РНК, включая менее обильные миРНК. Протокол в основном описывает шаги для денатурации общей РНК в погрузочном буфере, разделение размера гелевым электрофорезом, перенос РНК к мембране, перекрестная с...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
40% Acrylamide-bisacrylamide solution	Sigma	A9926
Ammonium persulphate (APS)	BioRad	1610700
Blotting paper	whatmann blotting paper I	1001-125
Bromophenol blue	Sigma	B5525-5G
Capillary loading tips	BioRad	2239915
Deionized formamide	Ambion	AM9342
Heating block	Eppendorff	5350
Hybond N+nylon membrane	GE	RPN203B
Hybridization bottle	Sigma	Z374792-1EA
Hybridization Oven	Thermo Scientific	1211V79
N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Sigma	T7024-25ml
PhosphorImager	GE- Typhoon scanner	29187194
PhosphorImager screen and cassette	GE healthcare	GE28-9564-75
Pipettes	Gilson, models: P20 and P10	FA10002M, FA10003M
Plastic pipette	Falcon	357550
Polyacrylamide gel apparatus	BioRad	1658003EDU
Sephadex G-25 column	GE healthcare	27532501
Speed Vac Concentrator	Thermo Scientific	20-548-130
Spinwin	Tarsons	1010
T4 Polynucleotide Kinase (PNK)	NEB	M0201S
Transblot apparatus	BioRad	1703946
ULTRAHyb hybridization buffer	Ambion	AM8670
Urea	Fischer Scientific	15985
UV-crosslinker	UVP	CL-1000L
Vortex	Tarsons	3020
Water bath	NEOLAB	D-8810
Xylene cyanol	Sigma	X4126-10G