Выделение экзосом после ударно-волновой терапии in vitro

Резюме

Экзосомы высвобождаются при воздействии ударных волн in vitro. В этой статье мы описываем, как применять ударные волны к культивируемым эндотелиальным клеткам и впоследствии выделять экзосомы для дальнейшего исследования.

Аннотация

Ударно-волновая терапия обычно применяется при ортопедических показаниях, включая тендинопатии, такие как латеральный эпикондилит (теннисный локоть) и тендинит ахиллова сухожилия (пяточная шпора), а также при незаживающих ранах и костях. Несмотря на разные патологии, сочетание ангиогенного и противовоспалительного эффекта ударно-волновой терапии приводит к регенерации в мягких тканях и костях. За более чем 30 лет клинического применения не наблюдалось никаких побочных эффектов. Более того, фундаментальные исследования даже выявили регенеративное воздействие на ишемизированный миокард.

В предыдущей работе мы смогли показать, что механический стимул культивируемых клеток транслируется через высвобождение экзосом в биологическую реакцию. Тем не менее, точный механизм еще предстоит выяснить. Механическая муфта имеет решающее значение при применении ударно-волновой терапии, так как даже небольшие пузырьки воздуха могут поглощать ударные волны. Ранее описанный метод водяной бани является действенным методом, гарантирующим адекватное и воспроизводимое применение ударной волны in vitro.

Нам удалось разработать осуществимый и воспроизводимый протокол для выделения экзосом из культивируемых клеток после применения ударной волны. Тем самым мы демонстрируем возможность изучения основных механизмов механотрансдукции, а также регенеративного и ангиогенного потенциала экзосом, высвобождаемых ударной волной.

Введение

Ударные волны (УВ) — это звуковые волны давления, которые появляются в природе при высвобождении большого количества энергии за короткий промежуток времени (например, гром с молнией). В клинической практике ударные волны используются в литотрипсии для разрушения камней в почках без соответствующих побочных эффектов в течение более 30^лет. По происшествиям, на рентгенограммах наблюдалось утолщение подвздошной кости после распада камней в почках. Это наблюдение послужило основой для исследований нарушений заживления костей и привело к лечению несращения длинных костей ^3,4,5.

Показания к проведению ударно-волновой терапии были расширены, и в настоящее время метод находится в рутинном клиническом применении при ортопедических показаниях, включая тендинопатии, такие как латеральный эпикондилит (локоть теннисиста) и тендинит ахиллова сухожилия (пяточная шпора)^6,7. Кроме того, фундаментальные исследования продемонстрировали высокий ангиогенный потенциал ударно-волновой терапии (УВТ). В нем исследование показало увеличение ангиогенных факторов роста, таких как VEGF (фактор роста эндотелия сосудов), PIGF (фактор роста плаценты) и FGF (фактор роста эндотелия сосудов) при УВТ с последующим ангиогенезом⁸.

Для изучения возможной благоприятной роли ангиогенеза, индуцированного ударной волной, при других патологиях мы применили СР-терапию на животной модели ишемической болезни сердца ^9,10. После того, как был продемонстрирован регенеративный эффект в ишемизированном миокарде, мы смогли определить незаменимую роль рецептора врожденного иммунитета TLR 3 (рецептор типа Toll 3) при ударно-волновой терапии^11,12. Дальнейшие исследования показали, что механический стимул СР-терапии транслируется в биологический сигнал через высвобождение экзосом. По сравнению с экзосомами, физиологически высвобождаемыми из эндотелиальных клеток, экзосомы, высвобождаемые при УВТ, содержат повышенный груз ангиогенной микроРНК. При введении в ишемизированный миокард УВТ высвобождает экзосомы, индуцирующие регенерацию¹³.

Поскольку воздух поглощает ОУ, решающее значение имеет идеальное соединение между аппликатором и колбами для клеточных культур. Стандартизированная водяная баня представляет собой возможный метод применения УВТ in vitro и воспроизводимую экспериментальную установку. Чтобы избежать отражения и, как следствие, интерференции волн, клиновидный поглотитель разрушает первичные волны, идущие к задней части водяной бани. По этой причине мы рекомендуем применять ударные волны in vitro только с использованием описанной водяной бани.

В этом протоколе мы описываем применение ударных волн in vitro для высвобождения ангиогенных экзосом в надосадочную жидкость. Данный протокол дает возможность исследовать роль экзосом в механотрансдукции и является основой для дальнейших исследований высвобождения экзосом при УВТ.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Эндотелиальные клетки пупочной вены человека были получены путем кесарева сечения в отделении гинекологии. Таким образом, было получено письменное информированное согласие пациентов. Разрешение было дано комитетом по этике Медицинского университета Инсбрука (no. UN4435).

ПРИМЕЧАНИЕ: Работайте под стерильным ламинарным колпаком, чтобы избежать загрязнения.

1. За 24 ч до начала эксперимента

1. Приготовьте свободную от экзосом эндотелиальную питательную среду путем ультрацентрифугирования фетальной бычьей сыворотки (FCS) при 4 °C и 120 000 x g в течение ночи.
2. Покройте колбу для клеточных культур площадью 75 см² 10% желатином.
3. Засейте эндотелиальные клетки человека в колбе для клеточных культур с использованием эндотелиальной питательной среды.
   День эксперимента:
   ПРИМЕЧАНИЕ: Предварительно нагрейте 4 л ddH₂O, FCS без экзосом, базальную среду для роста эндотелиальных клеток и PBS до 37 °C.

2. Подготовьте приложение для ударно-волновой терапии

1. Приготовьте эндотелиальную питательную среду без экзосом, добавив добавки из коммерческого набора (например, Bullet Kit) и добавив ультрацентрифугированную ФКС без экзосом вместо обычной ССК в эндотелиальную питательную среду.
2. Наполните водяную баню примерно 3,5 л 37 °C предварительно подогретым ddH₂O.
3. Подключите SW-аппликатор к водяной бане.
4. Определение параметров обработки (плотность потока энергии, частота импульсов) на программном устройстве. Мы рекомендуем 500 импульсов с плотностью потока энергии 0,07 мДж/мм² и частотой 5 Гц.

3. Применение ударной волны

1. Исследование жизнеспособности клеток по морфологическому виду и плотности эндотелиальных клеток с помощью микроскопа с использованием 100-кратного общего увеличения. Используйте колбы с высокой конфлюенцией только для увеличенного количества экзосом.
2. Осторожно замените среду эндотелиальных клеток примерно 250 мл PBS, чтобы полностью заполнить колбу и подавить весь остаточный воздух.
3. Используйте парапленку или герметичные крышки, чтобы запечатать колбу.
4. Держите колбу для клеточных культур в вертикальном положении внутри водяной бани стороной, закрытой клеткой, противоположной устройству SW. Убедитесь, что расстояние от колбы до аппликатора соответствует указанной маркировке. Для аппарата Orthowave 180c используйте расстояние от 10 см.
5. Используйте 250 импульсов SW-терапии в нижней половине колбы с клеточными культурами.
6. Поверните колбу на 180° и используйте 250 импульсов для верхней половины колбы для клеточных культур.
7. Затем снимите пломбу колбы и замените PBS 15 мл эндотелиальной питательной среды на FCS, свободную от экзосом.
8. Культивировали клетки в свободной от экзосом среде в течение времени, необходимого для проведения эксперимента. Наибольшее количество экзосом может быть собрано через 4 ч после СВ-терапии (рис. 1).
   ПРИМЕЧАНИЕ: В группе, где проводилась фиктивная операция, флаконы с клеточными культурами подвергались той же обработке (см. раздел выше) без использования СР-терапии.

4. Выделение экзосом

1. Переложите надосадочную жидкость в сборную пробирку и центрифугу при температуре 4 °C и 300 x g в течение 10 минут. На этом этапе удаляются все клетки надосадочной жидкости.
2. Для удаления клеточного мусора перенесите надосадочную жидкость в новую пробирку и центрифугу при температуре 4 °C и 3 000 x g в течение 20 минут.
3. Процедите надосадочную жидкость через фильтр 200 нм в центробежную трубку для удаления апоптотических тел.
4. Центрифуга фильтрует надосадочную жидкость при 4 °C с 120 000 x g в течение 70 мин. Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу экзосомы с 300 мкл PBS.
   1. Поскольку гранула экзосомы не видна после ультрацентрифугирования, поверните ультрацентрифужную трубку на 30 секунд, чтобы убедиться, что гранула экзосомы снова суспендирована. Отрегулируйте объем PBS в соответствии с потребностями эксперимента и дальнейшими экспериментами.
5. Храните ресуспендированные экзосомы при температуре -80 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приостановить после переноса надосадочной жидкости в сборную пробирку или перед ультрацентрифугированием путем замораживания надосадочной жидкости при температуре -80 °C.

5. Подводные камни

1. Убедитесь, что SW-аппликатор плотно подключен к водяной бане. Неполное соединение может привести к негерметичности водяной бани.
2. Убедитесь, что расстояние от колбы до аппликатора является точным, чтобы использовать одинаковое количество плотности потока энергии для разных колб.
3. Отметьте колбы для клеточных культур, которые были подвергнуты SW-терапии, и колбы для клеточных культур, которые были контрольными образцами.
4. Высушите колбы перед тем, как положить их обратно в инкубатор, чтобы избежать заражения.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Используя описанный протокол, мы подвергали эндотелиальные клетки человека (HUVECs), а также эндотелиальные клетки коронарных артерий человека (CAEC; PromoCell) до ударно-волновой терапии (например, Orthowave 180c). Высвобожденные везикулы количественно оценивали с помощью анализа н?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

В многочисленных фундаментальных исследованиях был продемонстрирован регенеративный эффект ударно-волновой терапии, которая регулярно применяется при ортопедических показаниях ^3,4,5. На различных животных моделях ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture flasks	Cellstar	658170	75 cm2
Collection tubes – Falcon Tube	Corning	352070
Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit	Lonza	CC-3162
Endothelial Cell Growth Basal Medium	Lonza	CC-3121
Fetal bovine serum	Sigma	F0804
Parafilm	Pechiney	PM996
Phosphat buffered saline	gibco	14190-904
Shockwave applicator	MTS	Orthowave 180c